Summary
Мы представляем технику для маркировки отдельных нейронов в центральной нервной системе (ЦНС)
Abstract
В этой статье мы расскажем, как индивидуально маркировать нейронов в ЦНС эмбриональные дрозофилы по juxtacellular введения липофильных флуоресцентных маркеров DiI мембраны. Этот метод позволяет визуализировать морфологию клеток нейронов в мельчайших подробностях. Можно пометить любую ячейку в ЦНС: клеточных тел нейронов-мишеней визуализируются при DIC оптики или выражение флуоресцентные генетических маркеров, таких как GFP. После маркировки, DiI может быть преобразована в постоянный коричневое пятно на фотопреобразования, чтобы позволить визуализации морфологии клеток в проходящем свете и DIC оптики. Кроме того, DiI-меченых клеток можно наблюдать непосредственно с конфокальной микроскопии, позволяющий генетически введен флуоресцентных белков репортер, чтобы быть colocalised. Этот метод может быть использован в любое животное, независимо от генотипа, что делает его возможным для анализа мутантных фенотипов на одной резолюции клетки.
Introduction
Знание морфологии нейронов на уровне отдельных клеток является ключевым условием для понимания нейронных соединений и ЦНС функции. Таким образом, с первых дней неврологии, исследователи стремились развивать одну ячейку маркировка техники (см. 7 для исторических лечения этого вопроса). Классические методы, такие как окрашивание Гольджи обеспечивают превосходное разрешение морфологии нейронов, но не подходит, если один пытается маркировать определенный тип нейронов в направленном образом, как окрашивание происходит случайным образом. Разработка методов окрашивания отдельных клеток или внутриклеточных juxtacellular введения красителей из микроэлектродов обратился к требованиям конкретной маркировки.
Применение однократной инъекции нейрона красителя Drosophila представлены основные проблемы, из-за малого размера и организм и его нейронов. Тем не менее, одно окрашивание нейронов эмбрионального Drosophila 15. Хотя метод был высшей полезно и предоставило некоторые ключевые идеи в механизмах нейронального развития у дрозофилы в течение последних 20-30 лет (2, например, 10), многие рабочие уклонялись от этого, в основном из-за его технических требований.
Наличие в последние годы генетические методы для маркировки нейронов дрозофилы также способствовало непопулярности одной инъекцией красителя нейрона. GAL4-направленной экспрессии мембранных ориентированных конструкций GFP может обеспечить превосходное разрешение нейронной морфологии 1, 20. Однако, этот метод имеет некоторые ограничения: часто неизбежны выражения GFP в несколько ячеек можно скрыть структуру отдельных нейронов и GAL4 драйвер линии могут быть доступны не ездить выражение в конкретных нейронов интерес. MARCM (Mosaic анализ с Repressible Маркер Cell) метод 8 может обеспечить маркировку практически любого нейрона на уровне отдельной клетки, но не может быть успешно использован в зародыше и в начале личинки из-за медленного оборота GAL80 белка.
Учитывая эти ограничения генетической маркировки, мы считаем, что однократное введение красителя нейронов у эмбрионов Drosophila остается ценной техники и заслуживает более широкого применения. Для продвижения этой цели, мы предоставляем здесь подробное описание метода. Иллюстрация из его питание обеспечивается нашей недавней счет морфологии полный набор интернейроны в брюшной neuromeres конца эмбриона Drosophila 14. Это исследование, которое показало, как морфологической изменчивости отдельных нейронов типов клеток и принципы организации neuromere в ЦНС эмбриона, не были бы возможны с любым другим в настоящее время маркировки методом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Мы использовали два несколько разных вариантов одного метода маркировки нейронов в наших лабораториях. Различия касаются эмбрионов, dechorionisation, devitellinisation и шаги эмбриона филе. Рисунок 1 дает обзор общих и расходящиеся шагов из вариантов.
1. Подготовка микро-иглы для Dissection эмбрионов и микропипетки для краски инъекций
- Стекло иглы для эмбриона рассечения взяты из стеклянных капилляров (1 мм и 0,1 мм толщины стенки) с Sutter съемник (Science Instruments) или сопоставимые оборудования. Кроме того, электролитически заостренные 0,15 мм вольфрамовой проволоки устанавливается в держатель иглы используются для вскрытия. (Инструкция для электролитического заточки приведены в 9).
- Краска микропипетки инъекций взяты из тонкостенных стеклянных капилляров с внутренним нитей (наука продукции; GB 100 TF 8P) с Sutter съемник (ScienceInstruments) или сопоставимые оборудования. Наконечником микропипетки должны быть острыми, с постепенным, равномерным конусности хвостовика, чтобы помочь прохождении через ткани эмбриона. Желаемой микропипетки является "High Микроэлектродные сопротивления, Sharp и Long" сорта, как описано на стр.20 из пипетки Sutter инструмента Поваренная книга ручной ( http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf ). Как правило, микропипетки тянут незадолго до инъекции проводятся с целью обеспечения их советы остаются острыми и чистыми.
2. Сбор, монтаж и Dissection эмбрионов
- Эмбрион Collection. Мы успешно использовали метод нейронных инъекции описанным здесь, в эмбрионы из этапов от 12 до 17 3. Эмбрионы развиваются постепенно кутикулы во время первого этапа 17 и становится все труднее анализировать. Две альтернативные подходы, которые можно получить EMbryos в определенной стадии развития.
- Разрешить мухи откладывают яйца в ночь на яблочный сок-агара покрытый дрожжей пасты. Отрегулируйте температуру сбор яиц в соответствии с запланированной время инъекции на следующий день. Соберите все яйца на следующий день и выберите эмбрионов в нужной стадии, используя морфологические критерии 3.
- Разрешить мух лежал на агар, как указано выше, но замените агар пластины с свежая каждые 1,5 часа при 25 ° C. Инкубируйте каждую пластину в течение определенного периода времени, пока эмбрионов достигли стадии развития требуется.
- Химическая Dechorionation. С помощью металлического шпателя, чтобы очистить эмбрионов от агара и передавать их в стеклянный сосуд (например, чашку Петри или полость блока), содержащий приблизительно 10 мл Drosophila звонка или фосфатным буферным раствором (PBS) решение. Добавить несколько капель концентрированной хлорной извести и агитировать за несколько минутповоротной платформы до хориона лугам у эмбрионов. Промойте эмбрионы в несколько смен Ringer / PBS, пока нет никакого запаха остаточного отбеливателя. Во время этих моет, убедитесь, что эмбрионы не вступают в контакт с поверхностью жидкости. В противном случае, они будут плавать и становится все труднее погружаться для последующей манипуляции. Кроме того, химические dechorionation может быть осуществлено с использованием корзины методике, описанной 4.
- Механические dechorionation (см. Рисунок 2, шаги 1-4). Передаче эмбрионов из чашки с агаром на слайд покрыта двухсторонней клейкой лентой. Избегайте передачи агар с эмбрионами, как он будет мешать их адгезию к ленте. Разрешить эмбрионов высохнуть в течение 5 до 10 минут, пока хорион становится немного хрупким. (Ожидая, пальто покровное необходимых для последующего devitellinisation с клеем - 2.3B см. ниже). Коснитесь каждого эмбриона осторожно с помощью иглы. Хориона будут разделены открытыми и эмбрион будет прилипать к пеEdle. Трансфер эмбрионов немедленно агар блока, чтобы предотвратить высыхание и выровнять около 10 из них подряд, с брюшной стороны вверх.
Devitellinisation и филе производится вручную, используя один из двух методов, описанных в 2.3A и 2.3B.
- Передача одного эмбриона dechorionated соответствующей стадии развития от блюдом раствор Рингера несколько капель Ringer в силиконовой плотины на заранее подготовленные стекле микроскопа. (Сделайте 3 см, площадь Дам, смазывая тонким слоем силиконового герметика на предметное стекло микроскопа, затем добавить каплю 0,01% поли-L-лизин решение центре плотины. Разрешить силиконовые вылечить в течение 24 час.) Трансфер эмбрионов со стеклянной пипетки Пастера, гарантируя, что зародыш остается под поверхностью Ringer в процессе передачи.
Приготовьтесь к заднему концу зародыша с парой тонких щипцов, мягко SqueezING эмбриона с парой тонких ножниц иридэктомия, около четверти пути назад от его переднего конца. Не режьте прямо через эмбриона. Цель состоит в том, чтобы просто взломать желточной мембраны в то время как наносящие минимальный ущерб для эмбриона. С помощью пинцета в том же положении, используют вольфрамовую иглу, чтобы облегчить эмбриона из открытых мембраны и положение его вентральной стороной вниз на слайде. Эмбриона должны придерживаться поли-лизин пальто.
Филе эмбриона с заостренной вольфрамовой иглы. Аккуратно проколите, а затем оторвите тело стены вдоль спинной средней линии. С помощью иглы, надавите на стенки тела, так что он прилипает к слайду. Чтобы предотвратить повреждение стенки тела, нажмите стенки тела с кишку вставляли между ним и иглой. Затем с помощью иглы рвать через кишечник на его переднего и заднего концов и поднимите ее. При желании, дополнительные эмбрионы могут быть переданы в тот же слайд, devitellinised и филе, стараясь не повредить другие эмбрионы уже наслайда. - Пальто 24 х 60 мм покровным гептаном клея (см. Таблицу 1), создав небольшую каплю клея в центре слайда и его распространение с 18 х 18 мм покровным в очень тонкую пленку. Поместите покровное на предметное стекло микроскопа и сделать рамки односторонней клейкой лентой по краям. Срежьте избыток агара из блока проведении ряда 10 эмбрионов, осторожно прикасаться к эмбрионы с покровным покровное гептан клея. Они теперь должны придерживаться покровное с брюшной стороны вниз. Добавить щедрое количество PBS, чтобы покрыть эмбрионов (рис. 2, шаги 4-6).
Проникнуть желточной мембраны со стеклянной или вольфрамовой иглой на спинной стороне каждого эмбриона вблизи ее заднего конца. Вскройте мембраны вдоль спинной средней линии и перетащите эмбриона из оболочки. Orient эмбриона вентральной стороной вниз в другом месте на гептана подложке клеем и филе, используя тот же метод, описанный в 2.3A) (см.Рисунок 2, шаги 7-8). Так как несколько эмбрионов будут филе на одном слайде, это полезно быть либо очень точным с их ориентацией или сделать рисунок их ориентации на слайде.
- Передача одного эмбриона dechorionated соответствующей стадии развития от блюдом раствор Рингера несколько капель Ringer в силиконовой плотины на заранее подготовленные стекле микроскопа. (Сделайте 3 см, площадь Дам, смазывая тонким слоем силиконового герметика на предметное стекло микроскопа, затем добавить каплю 0,01% поли-L-лизин решение центре плотины. Разрешить силиконовые вылечить в течение 24 час.) Трансфер эмбрионов со стеклянной пипетки Пастера, гарантируя, что зародыш остается под поверхностью Ringer в процессе передачи.
- После филе, эмбрионы могут быть легко зафиксированы в течение 10-15 мин в 7,4% формальдегида в PBS, затем 4 промывками в PBS. Экстремальный необходимо позаботиться, чтобы не довести эмбрион в контакт с поверхностью раствора в ходе этого процесса, так как силы поверхностного натяжения уничтожит эмбрион. Это до фиксации шаг не является строго обязательным, но полезно для предотвращения сокращения мышц стенки тела в конце эмбрионов на стадии и помочь стабилизировать эмбриональных тканей на молодых стадиях. Имейте в виду, что фиксация делает ткани эмбриона более непрозрачной и так несколько компромиссов качества изображения при DIC наблюдения.
3. Заполнение инъекций Микропипетки
Половина заполнения 0,5 мл Eppendorf пробирке с0,1% раствор красителя carbocynanine DiI (Molecular Probes, Eugene, OR) в 100% этанола (не забудьте использовать "сухой" абсолютного этанола, чтобы избежать DiI осадков). Сделать узкое отверстие в крышке трубки и вставить тупым концом микропипетки через отверстие в крышке. Разрешить DiI подняться вверх по нити, по крайней мере 5 мин. (Всегда закрывайте отверстия в крышке, когда он не заполнение микропипетки, чтобы избежать испарения этанола).
Оборудование, необходимое для инъекций красителя нейрона (рис. 3).
Микроскоп. Фиксированным столик микроскопа должен быть использован для инъекции нейрона краситель, чтобы избежать вертикального перемещения эмбриона во время фокусировки. Любое такое движение будет вытеснять пипетки после того, как вступил в контакт с эмбрионом. Мы нашли, как Zeiss Axioskop FS и Olympus AX50/BX50 фиксированных моделей этапе хорошо подходит для этой цели. Микроскоп должен быть оснащен проходящем свете DIC оптика для визуализации NeurДополнения перед окрашиванием. Микроскоп также должна быть вертикальной, а не перевернутая модель. С прямого микроскопа, кончик микропипетки находится на той же стороне эмбриона, как просмотр цели, в то время как с помощью инвертированного микроскопа два находятся на противоположных сторонах эмбриона. Последний расположение ставит под угрозу качество DIC оптики. Микроскоп должен быть создан для флуоресцентной микроскопии, с подходящим набором фильтров для наблюдения DiI. С DiI имеет сравнительно широкий спектр с возбуждения и испускания максимумами при 549 и 565 нм многие наборы фильтров в этом диапазоне будет работать, например, те, за 568 Alexa, Cy3, родамина, Texas Red или TRITC. Хотя это удобно, чтобы соответствовать электронным управлением затвора на пути флуоресценции источник света, чтобы позволить работу затвора без контакта рук с микроскопом, мы также эффективно помечены на установку которой было оснащено только ручным затвором. Наконец, большое увеличение, высокое численное apertuповторное погружение в воду цели необходимы для наблюдения во время инъекции. Эта цель должна быть предназначена для использования без покровное. Мы успешно использовали Zeiss Achroplan 100x/1.0W, Olympus FL LUMPlan 100x/1.0W, и Olympus FL LUMPlan / IR 60x/0.9 W цели.
Микроманипулятора требуется для размещения и перемещения микропипетки во время инъекции нейрона красителя. Мы использовали оба микроманипулятора Leica и стадии монтажа Narashige 3-осевых гидравлических микроманипулятора.
Внутриклеточных усилитель постоянного тока, с возможностью для инжекции тока, требуется для iontophoretic инъекции DiI из микропипетки.
4. Порядок краска инъекций
- Поместите слайды с установленными эмбрион (ы) на этапе введения микроскопа (рис. 3). Используйте 10x цель, чтобы найти эмбриона и привести его в центр поля зрения.
- SwING высокую цель власти в просмотре положение и принести эмбриона в фокусе. Найдите ячейку проценты по ОПК оптики (или с помощью флуоресценции, если клетки-мишени выражает GFP) и приведения его в центр поля зрения. Убедитесь, что в поле диафрагмой микроскопа открыл только на краю поля зрения, а не за его пределами. Узкого пучка освещения будет способствовать позиционированию микропипетки (см. п. 4.4). Поднимите цели, пока она не как можно выше над эмбрионом, оставаясь в контакте с Ringer / PBS решение.
- Поместите электрод для ванны усилитель постоянного тока в PBS подальше от эмбриона и пути микропипетки.
- Вставьте инъекции микропипетки в держатель, который был заполнен с 0,1 М раствора LiCl. Прикрепите держатель для микропипетки микроманипулятора. Использование микроманипулятора грубого контроля, довести микропипетки в пространство между кончиком цели и эмбрионов.Убедитесь, что он находится значительно выше уровня эмбриона. Из-за короткого рабочего расстояния высокую цель власти, микропипетки должны быть проведены под небольшим углом для того, чтобы привести его в фокус (см. Рисунок 3). Вам нужно будет установить соответствующий угол путем проб и ошибок, в первую очередь. Если угол слишком крутой, вы не сможете получить микропипетки чаевые в центре внимания. Если он слишком мелкий, вал микропипетки будет фол против стены плотины проведения купания решение на месте.
- Центр кончике микропипетки в поле зрения. Для достижения этой цели, принесите свой глаз на уровне зародыша и переместить микропипетки взад и вперед по Y-оси микроскопа. Когда его кончик пересекает путь света, вы увидите яркое отражение световых лучей от него. Перемещение кончика микропипетки вперед в X-оси, так что это выбросы светового пучка. Это будет легче найти микропипетки в небольшихПоле зрения высокую цель власти, если вы ищете его валу, а не его кончик. Теперь посмотрите в микроскоп окуляры и постепенно снижать высокую цель власти до вала микропипетки вступает в фокусе. Перемещение микропипетки вперед и назад в Y-ось с микроманипулятора управления помогает найти, так как она постепенно приходит в фокус. Когда вал находится в фокусе, переместить микропипетки в X-оси, пока его кончик лежит в центре поля зрения. На данном этапе кончике микропипетки должны быть значительно выше уровня эмбриона. Переключить на флуоресценцию освещения и изучить наконечник для проверки утечки DiI. Отрегулируйте постоянного тока, чтобы предотвратить любой кристалл DiI от формирования на конце.
- Использование микроманипулятора управления, снизить микропипетки в Z-оси. Принесите его обратно в центр внимания с управления фокус микроскопа. Постепенное снижение микропипетки вниз к эмбриона на этом пути. Первоначально, вы можете сделать это с грубымиZ-оси контроля микроманипулятора и микроскоп. Однако, как эмбрион вступает в фокусе вам нужно перейти к тонкой ручки управления.
- Когда поверхность эмбриона происходит в центре внимания, перемещение кончика микропипетки к краю поля зрения, в направлении микроманипулятора. Фокус на ячейку вводится и убедитесь, что она лежит в центре поля зрения. Переориентация на кончике микропипетки и переместить его в Y-ось, пока он находится на том же уровне в Y-оси клетки. Перемещение кончика микропипетки к ячейке в X-оси, как вы опустите его в Z-оси. При использовании микроманипулятора Leica, вы, вероятно, обнаружите, что столик микроскопа контролирует дать вам более тонкий контроль движений в X-оси, чем микроманипулятора управления, поэтому переключиться на этапе контроля, как кончик приближается к клетке.
- Принесите микропипетки наконечник в контакт с клеткой и сделать депрессии на его поверхности. Пройдите несколько nanoamps из depolariziнг текущем течение нескольких секунд. Вы должны увидеть небольшой кристалл DiI формирования на клетку. Чтобы подтвердить, что клетки были помечены, кратко открыть затвор, чтобы осветить эмбриона с флуоресцентным светом, а затем вернитесь в ОПК. Если тело клетки интерес проявляет признаки маркировки, применяется текущая в течение нескольких секунд. Выключите ток и быстро вытащить зародыш от микропипетки в X-оси с помощью контроля столик микроскопа. Затем снять микропипетки из раствора. Если нет маркировки DiI очевидно, микропипетки может быть заблокирован и требует замены с новым микропипетки. Вы можете обнаружить, что кончике микропипетки была зацепил других тканей на пути к ячейке интерес и эта ткань окрашивается, а не в клетке. В этом случае, попробуйте снятия микропипетки немного, и вновь приблизиться к клетке. Это может быть необходимо заменить микропипетки и попробуйте снова.
- При желании, несколько ячеек может быть индивидуальносоюз помечены в том же эмбрион.
- Удалите большинство из раствора в камеры впрыска, а затем исправить эмбрионов путем добавления 7,4% формальдегида / PBS в течение 10 мин, затем 4 промывок PBS. Эмбрион затем оставляют при комнатной температуре в течение по крайней мере 4 часа (или на ночь при 4 ° С) в темном, влажной камере (во избежание обесцвечивания или сухой падения), чтобы DiI, чтобы рассеять по всему нейронных процессов. На данном этапе, DiI-меченых клеток может быть либо photoconverted или просматривать непосредственно в конфокальной микроскопии.
5. Фотопреобразования на исследование с использованием DIC оптики
Принцип фотопреобразования является (фото-) окисления DAB от дневного света, испускаемого окрашенные клетки при освещении с соответствующей длиной волны. Это означает, яркие клетки photoconverted в более короткие сроки по сравнению с слабо окрашенных клеток. Если несколько ячейки, обозначенные в одном образце слишком сильно отличаются по своей яркости это может привести к difficulties в photoconverting все они в той же качества (см. рисунок 4C): в этом случае, возможно, придется принять решение о компромиссе между пренебрегая слабыми клеток (с использованием коротких освещении) или признания того, что ярче клетки начинают набухать (используя больше освещения) . Если все клетки слишком слабо обозначенный (таким образом, нуждающиеся очень долгое освещение), фон вызванных эндогенными пероксидазы может стать проблемой. С DAB является токсичным следует использовать с осторожностью. Отходы могут «отключить» с 7% хлора отбеливания.
- Фотопреобразования должна проводиться для каждого эмбриона индивидуально. В случае, когда только один эмбрион вводится на слайд, решение PBS покрытие эмбриона заменяется решением DAB (3 мг DAB / мл Трис-буфер), слайд помещается на флуоресцентного микроскопа и заполненные ячейки рассматривается с 100x цели. (С использованием прямой микроскоп цели погружается в раствор DAB и должны быть очищены несколько раз водой после фотопреобразования рrocedure закончена, этого можно избежать, если инвертированный микроскоп используется). Cy3 набор фильтров и 100 Вт лампе ртуть используется и клетка подвергается красной длине волны возбуждения до коричневого продукта реакции DAB становится очевидным в меченых нейронов (периодически проверять путем перехода на яркое освещение поля). Время, необходимое для оптимального окрашивания DAB является переменной величиной, но требует воздействия возбуждающего света за сцену, где флуоресценция полностью исчезла. После фотопреобразования завершена, мыть подготовки несколько раз PBS. Заменить PBS с каплей 70% глицерина, соскрести с силиконовыми лезвие скальпеля, замените кольцо вазелином и добавить покровное.
- Когда несколько эмбрионов были заполнены на одном слайде, передавать каждый эмбрион небольшую каплю PBS на отдельном 24 х 60 мм покровным с вентральной стороне эмбриона, стоящих перед стеклом. Поместите рамках клейкой лентой вокруг каждого эмбриона создать хорошо и охватывают подготовку с PBS. Держите слайдах во влажной камере до фотопреобразования, чтобы предотвратить их от высыхания. Биржи PBS покрытие эмбриона с решением DAB. Немедленно поместить слайд на инвертированный микроскоп оснащен 100 Вт лампа Hg и использовать Cy3 набор фильтров для возбуждения DiI, используя топор 50 целей. После фотопреобразования, передача эмбриона к новому стекло в каплю 70% глицерина, добавить покровное и печать с лаком для ногтей.
6. Экспертиза с помощью конфокальной микроскопии
- После шаг 4.10, передача эмбрионов небольшую каплю PBS на свежем 24 х 60 мм покровным. Мы добиваемся оптимального оптики за счет установки плоского эмбрионов с дорсальной стороны к покровным (оставив только небольшое количество PBS между покровным и эмбрионов).
- Поместите рамках клейкой лентой вокруг эмбриона и увеличить падение PBS, чтобы заполнить кадр, когда покрытый слайд. Поместите слайды на нее внимательно и закрепить его лаком для ногтей. Заполненные нейроны должны быть экзаменаINED на конфокальной (или флуоресценции) микроскоп как можно скорее.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 4 показаны типичные результаты технику, мы опишем здесь. Рисунке 4а приведен пример DiI заполнены одной интернейронов, который был чисто photoconverted. Это хорошо демонстрирует степень детализации этих препаратов предложение. При осмотре под DIC оптики пространственного контекста меченые клетки в немеченого окружающих тканей становится видимым, например, положение тела клетки в коре головного мозга и волоконно проекции в нейропиле.
Рисунок 4B является случай, когда краситель падение было слишком большим в результате чего несколько соседних клеток становятся помечены одновременно. Это часто делает его трудно связать отдельные прогнозы для различных органов ячейки. Это также показывает, что, когда непосредственно рассматривается под флуоресцентным микроскопом (без фотопреобразования) фон разрешение гораздо ниже.
Образца на рис 4C
Рисунок 4D показывает, что наблюдения с помощью конфокальной микроскопии показывает, морфология меченых клеток в деталях. DiI маркировка была выполнена в штамм, который проводится конструкция GFP репортер. Это может дать важную информацию о пространственном контексте (и личности) на красителе заполнить ячейку в конкретной популяции нейронов или GLIAL типов клеток (как определено в экспрессии генов).
В качестве парадигмы для оценки морфологической изменчивости определены нейрона мы выбрали одну из Бескрылые позитивных нейронов 14. Этот нейрон лежит в спинном и медиальной положение, близкое к нейропиле (DAP, рис 5А, Лундгрен и соавт., 1995) отдельно от других Бескрылые позитивных нейронов и, следовательно, легко узнаваемый в apGal4-UASGFP животных. Рис. 5б показывает, DAP клетки , который был заполнен DiI и photoconverted. Тело клетки находится на уровне передняя спайка и показывает аксона, что сначала растет по отношению к средней линии, а затем поворачивает переднюю в средней соединительной региона. Он имеет конус роста, как отеки на кончике и поворотным моментом. 19 этикетках этой ячейки, рисуется как максимальная проекции изображения стеки, приведены на рисунке 5C. Морфология клеток становится видна очень подробно. Лишь немногие клетки демонстрируют рост конуса, как структур, шесть из 19 клеток также отправить филиала задних, который всегда короче передней ветви и вполне может быть переходные функции. На рисунке 5D все 19 DAP ячейки, обозначенные укладываются друг с ячейки, имеющей только непрозрачность 12%. Это приводит к сферами являются темными больше клеток делиться ими. В то время как тело клетки изменяется более чем на одну ячейку диаметра вокруг центрального положения, медиолатеральная положение аксонов в нейропиле меняется намного меньше - когда нейропиле ширина разделена на девять частей она находится всегда в одном медиальной две позиции.
Рисунок 1. Схема обзор шагов метода маркировки нейрона и его двух вариантах.
"FO: содержание ширина =" 4in "FO: SRC =" / files/ftp_upload/50150/50150fig2highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50150/50150fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Диаграмма, иллюстрирующая различные шаги в подготовке эмбрионов Drosophila для инъекций красителя нейронов, в соответствии с вариантом B. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 3. . Схематическое изображение установки для инъекций красителя правый верхний вкладыш представляет собой увеличенный вид расположения образца, введения микропипетки и ванны электродом. Микроманипулятор, B: Исправлена столик микроскопа. Микроманипулятора установлен под небольшим углом - около 10 и де-. г; C: микропипетки держатель с микропипетки, D: Образцы на слайде, E: Ванна электрод фиксируется с пластилином, F: Подключение к усилителю постоянного тока.
Рисунок 4. Примеры DiI-меченных интернейроны в брюшной нервной стадии 17 эмбрионов. Спинной взгляды, передние это осталось. Средняя линия: пунктирными линиями.
- Примером совершенно photoconverted одну ячейку, показывая, видный аксональной контралатеральной проекцией и ипсилатеральных волокон дендритные (стрелки). DIC оптики.
- показывает подготовки, в которых более одной ячейки был назван - это не может заслонить четкое распределение одного тела клетки к ее проекции.
- 8 клеток были названы в 3 последовательных сегментов. Кроме того, в этой подготовке фотопреобразования последовал стандартный протокол меченых антител против Fas2 в качестве ориентира.
- показан один DiI заполненные нейрона документально с конфокальной микроскопии в лету штамм, несущий репортера GFP построить.
Рисунок 5. Целевые DiI маркировки (отмечены выражения GFP) показывает диапазон морфологической изменчивости определены нейронов 14. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
- DAP клетки (искусственно окрашен в синий цвет) может быть однозначно признаны в бескрылых Gal4-UASGFP картины в животе (DAP, рис 5А, Лундгрен и др.л., 1995). GFP экспрессирующие клетки были окрашивали анти-GFP антител. Срединной линии отмечены пунктирными линиями. AC = передняя спайка, PC = задней спайки.
- показан пример photoconverted DiI заполненные DAP клетки. Ячейка была определена до красить заполнения бескрылых Gal4-UASGFP эмбриона его выражения GFP.
- Галерея из 19 заполняется этой ячейки, рисуется как максимальная проекции изображения стеки. Спинной вид. Передняя вверх. Нейропиле в светло-серый цвет, области коры в темно-серый.
- В 19 клетках DAP укладываются друг с ячейки, имеющей прозрачность 12%. Области, занятой большинство клеток имеет темный оттенок серого. Нейропиле всех образцов (синий) было уменьшено с аналогичной ширины и передней спайки рядом с ячейкой были согласованы, чтобы они перекрывались. В то время как тело клетки изменяется более чем на одну ячейку диаметра вокруг центрального положения, медиолатеральная положение аксонов в нейропиле показываетменьше вариаций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Одно из главных преимуществ Drosophila в качестве модельной системы является то, что она позволяет анализ развития и функционирования на уровне отдельных клеток. Это особенно полезно в отношении нервной системы, где разнообразие типов клеток является исключительно высоким и функции и морфологии соседние клетки могут быть совершенно разные.
Метод, который мы представляем здесь, позволяет маркировки отдельных нейронов с красителем, который может быть преобразован в постоянный пятна или рассматривать непосредственно с помощью флуоресцентной микроскопии. Она показывает, морфологии нервных процессов в больших деталях (рис. 4). Одним из основных преимуществ метода является то, что она позволяет морфологии практически любого типа нейронов в ЦНС должны быть рассмотрены (для эмбрионального брюшной нервной см. Риккерт и др., 2011;. Для эмбрионального мозга, см. Кунц и др. др.., 2012). Кроме того, он не требует сложных комбинацийгенетические элементы присутствуют в зародыше, так как некоторые из методов генетической маркировки делать. Краска инъекции могут быть выполнены в клетках животных, которые несут репортер конструкций, что позволяет отдельным морфологии клетки, чтобы быть визуализированы в контексте частности экспрессии генов (рис. 4D и 5) в любом дикого типа или мутантного происхождения. Мы также использовали технику, чтобы следить за динамикой аксона результат в живых эмбриональных нейронов, 11, 12.
Этот метод может быть легко адаптирован для обозначения отдельных нейронов у эмбрионов других организмов при условии, что эмбрион является достаточно прозрачным, чтобы быть рассмотрено в соответствии DIC освещения. Мы использовали его для визуализации нейронной морфологии в различных членистоногих эмбрионов, в том числе кузнечиков 18, многоножки 17, 19 и ракообразных серебрянки 16.
Основным недостатком техническихдие заключается в его технической сложности. Мы верим, что нынешнее подробное изложение метода поможет заинтересованных исследователей в освоении этого.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом DFG по Гринвичу
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DAB |  Sigma-Aldrich |
D-5905 | 2-3 mg/ml in 100 mM TRIS-Hcl, pH 7.4 |
| DiI | Invitrogen/Molecular Probes |
D-282 | 1 mg/ml in ethanol |
| Formaldehyde | Merck Millipore | 7,4 % in PBS | |
| Glycerol | Roth |
3783 | 70% in PBS |
| Heptane Glue | Beiersdorf AG | Cello 31-39-30 * | dilute ca. 1 to 1 with n-Heptane |
| PBS | 1x | ||
| TRIS | Roth |
4855 | |
| Vectashield | Vector Laboratories |
H1000 | |
| EQUIPMENT | |||
| Confocal Microscope | Leica | TCS SP2 | to view and document labelings in fluorescence |
| DC - amplifier | Dragan Corporation | Cornerstone ION-100 | to perform the labelings |
| Coverslips | Menzel |
BB018018A1 | 18 x 18 mm |
| Coverslips | Menzel |
BB024060A1 | 24 x 60 mm |
| Dissecting Microscope | Leica | MZ8 | to prepare and disect embryos |
| Flat Capillaries | Hilgenberg |
outer diameter 1 mm; glas thickness 0.1 mm | |
| Injection Capillaries | Science Products | GB 100 TF 8P | |
| Micromanipulator R | Leica | to perform the labelings | |
| Model P-97 | Sutter Instruments | to pull capillaries | |
| Object Slides | Marienfeld Superior |
1000000 | |
| Scientific Microscope | Zeiss | Axioskop 2 mot | to view labelings after photoconversion |
| Scientific Microscope | Olympus | BX50 | to perform the labelings |
| Sony MC3255 Video Camera | Sony/AVT Horn | Sony MC3255 | to record labelings after photoconversion |
Table 1. |
|||
References
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Broadie, K., Sink, H., Van Vactor, D., Fambrough, D., Whitington, P. M., Bate, M., Goodman, C. S. From growth cone to synapse: the life history of the RP3 motor neuron. Dev. Suppl. , 227-238 (1993).
- Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , Springer. Berlin. (1985).
- Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures. J. Vis. Exp. (27), e1347 (2009).
- Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule. Cell. 67, 45-57 (1991).
- Kunz, T., Kraft, K. F., Technau, G. M., Urbach, R. Origin of Drosophila mushroom body neuroblasts and generation of divergent embryonic lineages. Development. 139, 2510-2522 (2012).
- Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Levick, W. R. Another tungsten microelectrode. Med. Biol. Eng. 10, 510-515 (1972).
- Matthes, D. J., Sink, H., Kolodkin, A. L., Goodman, C. S. Semaphorin II can function as a selective inhibitor of specific synaptic arborizations. Cell. 81, 631-639 (1995).
- Murray, M. J., Whitington, P. M. Effects of roundabout on growth cone dynamics, filopodial length, and growth cone morphology at the midline and throughout the neuropile. Journal of Neuroscience. 19, 7901-7912 (1999).
- Murray, M. J., Merritt, D. J., Brand, A. H., Whitington, P. M. In vivo dynamics of axon pathfinding in the Drosophilia CNS: a time-lapse study of an identified motorneuron. J. Neurobiol. 37, 607-621 (1998).
- Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).
- Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -L., Whitington, P. M., Technau, G. M. Morphological characterization of the entire interneuron population reveals principles of neuromere organization in the ventral nerve cord of Drosophila. Journal of Neuroscience. 31, 15870-15883 (2011).
- Thomas, J. B., Bastiani, M. J., Bate, M., Goodman, C. S. From grasshopper to Drosophila: a common plan for neuronal development. Nature. 310, 203-207 (1984).
- Whitington, P., Harris, K. Early axonogenesis in the embryo of a primitive insect, the silverfish Ctenolepisma longicaudata. Development Genes and Evolution. 205 (5-6), 272-281 (1996).
- Whitington, P., Meier, T. Segmentation, neurogenesis and formation of early axonal pathways in the centipede, Ethmostigmus rubripes (Brandt). Development Genes and Evolution. 199, 349-363 (1991).
- Whitington, P. M., Seifert, E. Axon growth from limb motorneurons in the locust embryo: the effect of target limb removal on the pattern of axon branching in the periphery. Developmental Biology. 106, 438-449 (1984).
- Whitington, P. M., Leach, D., Sandeman, R. Evolutionary change in neural development within the arthropods: axonogenesis in the embryos of two crustaceans. Development. 118, 449-461 (1993).
- Williams, D. W., Tyrer, M., Shepherd, D. Tau and tau reporters disrupt central projections of sensory neurons in Drosophila. J. Comp. Neurol. 428, 630-640 (2000).
