Summary
Vi præsenterer en teknik til mærkning af enkelte neuroner i centralnervesystemet (CNS) af
Abstract
I denne artikel beskriver vi, hvordan du individuelt mærke neuroner i de embryonale CNS af Drosophila melanogaster ved juxtacellular injektion af lipofile fluorescerende membran markør Dil. Denne metode gør det muligt visualisering af neuronal cellemorfologi i stor detalje. Det er muligt at mærke en celle i centralnervesystemet: cellelegemer af mål-neuroner er visualiseret under DIC optik eller ved ekspression af en fluorescerende genetisk markør, såsom GFP. Efter mærkning, kan Dil blive omdannet til en permanent brun plet ved fotoomdannelse at tillade visualisering af cellemorfologi med transmitteret lys og DIC optik. Alternativt kan Dil-mærkede celler observeres direkte med konfokal mikroskopi, hvilket muliggør genetisk indført fluorescerende reporter-proteiner, der skal colocalised. Teknikken kan anvendes i noget dyr uanset genotype, hvilket gør det muligt at analysere mutante fænotyper ved enkeltcelle-opløsning.
Introduction
Kendskab til neuronal morfologi på de enkelte celler er en vigtig forudsætning for at forstå neuronal tilslutningsmuligheder og CNS-funktion. Således fra de tidligste dage af neurovidenskab, har forskere forsøgt at udvikle encellede mærkningsteknikker (se 7 for en historisk behandling af dette spørgsmål). Klassiske metoder, såsom Golgi-farvning giver fremragende opløsning af neuronal morfologi, men er ikke egnet, hvis man søger at mærke en bestemt type neuron i en rettet måde, som forekommer farvning på en tilfældig måde. Udviklingen af metoder til farvning enkelte celler ved intracellulær eller juxtacellular injektion af farvestoffer fra en mikroelektrode rettet kravet om særlig mærkning.
Anvendelsen af en enkelt neuron farvestof injektion til Drosophila præsenterede en stor udfordring på grund af den lille størrelse af både organismen og dens neuroner. Ikke desto mindre enkelt neuron farvning af embryonisk Drosophila 15. Mens metode har været særdeles nyttigt og har givet nogle vigtige indsigter i mekanismer til neuronal udvikling i Drosophila i løbet af de sidste 20-30 år (f.eks 2, 10), har mange arbejdere veget tilbage fra det, hovedsagelig på grund af dets tekniske krav.
Tilgængeligheden i de senere år af genetiske teknikker til neuronal mærkning i Drosophila har også bidraget til upopulær enkelt neuron farvestof injektion. GAL4-rettet ekspression af membran-målrettet GFP-konstruktioner kan give fremragende opløsning af neural morfologi 1, 20. Imidlertid har denne fremgangsmåde visse begrænsninger: den ofte uundgåelige ekspression af GFP i flere celler kan tilsløre strukturen af individuelle neuroner og et GAL4 transmissionsledningen er muligvis ikke tilgængelig til at drive ekspression i en bestemt neuron af interesse. Den MARCM (Mosaic Analysis med et Repressible cellemarkør) metode 8 kan tilvejebringe mærkning af væsentlige enhver neuron på det individuelle celleniveau, men ikke med held anvendt i embryoet og tidlig larve på grund af den langsomme omsætning GAL80-proteinet.
I betragtning af disse begrænsninger af genetisk mærkning, mener vi, at en enkelt neuron farvestof indsprøjtning i Drosophila foster forbliver en værdifuld teknik og fortjener bredere anvendelse. For at fremme dette mål, vi giver her en detaljeret beskrivelse af metoden. En illustration af sin magt er leveret af vores nylige hensyn til morfologi af det komplette sæt interneuroner i abdominale neuromeres i slutningen af Drosophila foster 14. Denne undersøgelse, som afslørede både morfologisk variation af individuelle neuronale celletyper og principperne for neuromere organisation i centralnervesystemet hos fosteret, ville ikke have været muligt med andre foreliggende mærkningsmetode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vi har brugt to lidt forskellige varianter af den enkelte neuron mærkningsmetode i vores laboratorier. Forskellene vedrører embryonindsamlingsteam, dechorionisation, devitellinisation og embryo filetering trin. Figur 1 giver en oversigt over de fælles og divergerende trin varianterne.
1. Fremstilling af mikro-kanyler til Embryo Dissektion og Mikropipetter for Dye Injection
- Glas nåle til embryo dissektion er hentet fra glaskapillarer (1 mm i diameter og 0,1 mm vægtykkelse) med en Sutter aftrækker (Science Instruments) eller tilsvarende udstyr. Alternativt er en elektrolytisk skærpet 0,15 mm tungsten wire monteret i en nåleholder, der anvendes til dissektioner. (Instruktioner til elektrolytisk skarphed er givet i 9).
- Dye Injection mikropipetter er hentet fra tyndvægget glaskapillarer med indvendige fibre (Science produkter; GB 100 TF 8P) med en Sutter aftrækker (ScienceInstrumenter) eller tilsvarende udstyr. The mikropipettespids skal være skarp, med en gradvis og ensartet tilspidsning af skaftet for at hjælpe passage gennem væv i embryoet. Den ønskede mikropipette er "High Resistance mikroelektroder, Sharp og Long" sort, som beskrevet på s.20 i Sutter Instrument Pipette Cookbook manual ( http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf ). Generelt er mikropipetter trukket kort før injektioner er udført for at sikre deres tips forbliver skarpe og rene.
2. Indsamling, Montering og Dissektion af embryoner
- Embryonindsamlingsteam. Vi har med succes brugt neuron injektion metode beskrevet her i embryoner fra trin 12 til 17 Marts. Embryoner gradvis at udvikle en neglebånd under trin 17 og bliver stadig vanskeligere at dissekere. To alternative metoder til rådighed for at opnå embryos på et bestemt udviklingstrin.
- Tillad fluer at lægge æg natten på æblejuice-agarplader belagt med gær pasta. Juster temperaturen af ægudtagning at passe til den planlagte tidspunktet for injektionen den næste dag. Saml alle æg den næste dag og vælge embryoner på det ønskede tidspunkt ved hjælp af morfologiske kriterier 3.
- Tillad fluer at lægge på agarplader som ovenfor, men udskifte den agarplade med en frisk hver 1,5 time ved 25 ° C. Inkubér hver plade for en defineret tidsperiode, indtil embryoer har nået udviklingsstadiet påkrævet.
- Kemisk Dechorionation. Anvende en metalspatel at skrabe embryoner fra agar og overføre dem i en glasbeholder (f.eks petriskål eller kavitetsbloksamlingen) indeholdende cirka 10 ml Drosophila Ringer eller phosphatbufret saltvand (PBS). Tilføj et par dråber koncentreret blegemiddel og agitere for et par minutter på enroterende platform, indtil chorion sloughs off embryonerne. Vask embryoner i flere hold Ringer / PBS indtil der er ingen lugt af resterende blegemiddel. Under disse vaske, sikrer, at embryonerne ikke kommer i berøring med væskeoverfladen. Ellers vil de flyde og blive vanskeligt at dykke til senere manipulation. Alternativt kan kemisk dechorionation udføres under anvendelse af kurven teknikken beskrevet af 4.
- Mekanisk dechorionation (se figur 2, trin 1-4). Overfør embryoner fra agarpladen til et objektglas dækket med dobbeltklæbende tape. Undgå at overføre agar med embryonerne, da det vil forstyrre deres vedhæftning til båndet. Tillad embryoner tørre i 5 til 10 min, indtil chorion bliver lidt skør. (Mens vi venter, frakke dækglasset er nødvendig for senere devitellinisation med lim - se 2.3b nedenfor). Røre hvert embryon blidt med en nål. Chorion vil opdele åbne og embryoet vil holde sig til neEdle. Overfør embryoner straks til en agar-blok for at forhindre udtørring og tilpasse omkring 10 af dem i træk, med deres ventrale sider opad.
Devitellinisation og filetering er færdig manuelt ved hjælp af en af de to metoder beskrevet i 2.3A og 2.3b.
- Overfør en enkelt dechorionated foster af den passende udviklingstrin fra skålen af Ringer-opløsning til flere dråber Ringer i en silicone dæmning på en pre-forberedt objektglas. (Lav et 3 cm kvadratisk dæmning ved at smøre et tyndt lag af silikone tætningsmiddel på et objektglas, hvorefter der tilsættes en dråbe af 0,01% poly-L-lysin opløsningen i midten af dæmningen. Lad silikone hærde i 24 timer.) Overfør embryo med en glas Pasteur-pipette, sikrer, at embryoet forbliver under overfladen af Ringer under overførslen.
Afstive den bageste ende af embryoet med et par fine tænger under forsigtig squeezING embryonet med et par fine iridectomy saks, omkring en fjerdedel vej tilbage fra sin forreste ende. Undgå at skære lige igennem embryoet. Formålet er at blot knække vitellinmembranen samtidig at forårsage minimal skade på fosteret. Med tangen stadig er i position, skal du bruge en wolfram nål til at lette foster ud af den åbnede membran og placer det ventrale side nedad på diaset. Embryonet bør holde sig til den poly-lysin pels.
Filet embryoet med en skærpet wolfram nål. Forsigtigt perforere, derefter rive kropsvæggen langs den dorsale midtlinje. Ved hjælp af nålen, ned skubbe på kroppen væg, så det klæber til diaset. At forhindre beskadigelse af kroppens væg, skubber kropsvæggen med tarmen anbragt mellem den og nålen. Brug derefter nålen at rive gennem tarmen på sine forreste og bageste ende og løft den væk. Hvis det ønskes, kan yderligere embryoner overføres til det samme dias, devitellinised og fileteres, pas på ikke at beskadige andre embryoner, der allerede pådiaset. - Coat a 24 x 60 mm dækglas med heptan lim (se tabel 1) ved at anbringe en lille dråbe lim i centrum af objektglasset, og sprede den med en 18 x 18 mm dækglas i en meget tynd film. Placere dækglasset på et objektglas og gøre en ramme af et klæbebånd omkring dens kanter. Skær væk overskydende agar fra blokken holder rækken af 10 fostre, blidt røre embryoner med dækglasset heptan lim dækglas. De bør nu klæbe til dækglasset med deres ventrale sider vender nedad. Tilføj en generøs mængde af PBS til at dække embryonerne (se figur 2, trin 4-6).
Trænge ind i vitellinmembranen med et glas eller wolfram nål på den dorsale side af hvert embryo nær dets posteriore ende. Oprive membranen langs den dorsale midtlinje og træk embryon ud af membranen. Orientere embryo ventrale side nedad andetsteds på heptan lim substrat og filet den ved hjælp af den samme fremgangsmåde som beskrevet i 2.3A) (seFigur 2, trin 7-8). Da flere embryoner vil blive fileteres på samme dias, er det nyttigt at enten være meget præcis med deres orientering eller lave en tegning af deres orientering på diaset.
- Overfør en enkelt dechorionated foster af den passende udviklingstrin fra skålen af Ringer-opløsning til flere dråber Ringer i en silicone dæmning på en pre-forberedt objektglas. (Lav et 3 cm kvadratisk dæmning ved at smøre et tyndt lag af silikone tætningsmiddel på et objektglas, hvorefter der tilsættes en dråbe af 0,01% poly-L-lysin opløsningen i midten af dæmningen. Lad silikone hærde i 24 timer.) Overfør embryo med en glas Pasteur-pipette, sikrer, at embryoet forbliver under overfladen af Ringer under overførslen.
- Efter filettering, kan embryoner let fastsættes i 10-15 minutter i 7,4% formaldehyd i PBS efterfulgt af 4 vaske i PBS. Yderste forsigtighed skal udvises forsigtighed for ikke at bringe embryo i kontakt med overfladen af opløsningen under denne proces, da de overfladespændingskræfter vil ødelægge embryoet. Denne pre-fiksering trin er ikke strengt nødvendigt, men er nyttig til at forhindre sammentrækning af kroppens væg muskler i sent stadium embryoner, og til hjælpe med at stabilisere embryonale væv på unge stadier. Husk, at fiksering gør væv af embryoet mere uigennemsigtig og så lidt kompromiser billedkvalitet under DIC observation.
3. Påfyldning af Injection Mikropipetter
Half fylde en 0,5 ml Eppendorf mikrocentrifugeglas meden 0,1% opløsning af carbocynanine farvestoffet Dil (Molecular Probes, Eugene, OR) i 100% ethanol (husk at bruge 'tør' absolut EtOH for at undgå Dil nedbør). Foretage en smal hul i låget af røret og indsætte den stumpe ende mikropipette gennem hullet i låget. Tillade Dil at stige op filamentet i mindst 5 min. (Altid dække hullet i låget, når ikke fyldning af en mikropipette for at undgå fordampning af ethanol).
Udstyr til neuron farvestof injektion (figur 3).
Mikroskop. En fast fase mikroskop skal anvendes til neuron farvestof injektion for at undgå lodret bevægelse af fosteret under fokusering. Enhver sådan bevægelse vil forskyde pipetten efter at den er kommet i kontakt med fosteret. Vi har fundet både Zeiss Axioskop FS og OLYMPUS AX50/BX50 faste trins modeller til at være velegnet til dette formål. Mikroskopet bør være udstyret med transmitteret lys DIC optik til visualisering af NEURons før farvning. Mikroskopet bør også være en opretstående snarere end en omvendt model. Med en opretstående mikroskop, er spidsen af mikropipette på samme side af embryoet som vist mål, hvorimod med et omvendt mikroskop de to er på modsatte sider af embryoet. Det sidstnævnte arrangement kompromitterer kvaliteten af DIC optik. Mikroskopet bør oprettes for fluorescensmikroskopi, med et egnet filter sæt til Dil observation. Da Dil har et sammenligneligt bredt spektrum med excitation og emission maksima ved 549 og 565 nm mange filtersæt i denne serie vil arbejde, fx dem, for Alexa 568, Cy3, Rhodamin, Texas Red eller TRITC. Selv om det er praktisk at montere en elektronisk styret lukker i banen for fluorescens lyskilde, for at tillade drift af lukkeren uden hånd kontakt med mikroskop, vi også effektivt mærket på en opsætning som først blev udstyret med en manuel udløser. Endelig er der en stor forstørrelse, høj numerisk aperture nedsænkning i vand mål kræves til observation under indsprøjtning. Dette mål bør konstrueret til brug uden et dækglas. Vi har med succes brugt Zeiss Achroplan 100x/1.0W, Olympus LUMPlan FL 100x/1.0W, og Olympus LUMPlan FL / IR 60x/0.9 W mål.
En mikromanipulator kræves for at placere og flytte mikropipette under neuron farvestof injektion. Vi har brugt både Leica mikromanipulator og en scene-monteret Narashige 3-akse hydraulisk mikromanipulator.
En intracellulær DC forstærker, med mulighed for løbende injektion, er nødvendig for iontoforetisk injektion af Dil fra mikropipette.
4. Procedure for Dye Injection
- Placér med monteret embryo (er) på tidspunktet for injektionen mikroskop (fig. 3). En 10x formål at lokalisere et foster og bringe den i midten af synsfeltet.
- SwING den høje effekt målsætning i TV-stilling og bringe embryoet i fokus. Find cellen af interesse under DIC optik (eller ved hjælp af fluorescens, hvis målcellen udtrykker GFP) og bringe den i midten af synsfeltet. Sikre, at det område membran af mikroskopet åbnes lige til kanten af synsfeltet, ikke ud. En smal belysningsstråle vil hjælpe positionering af mikropipetten (se trin 4.4). Hæv målet, indtil den er så højt som muligt over embryonet, men stadig være i kontakt med Ringer / PBS-opløsningen.
- Placer bad elektrode til DC forstærkeren til PBS godt klar af embryonet og stien til mikropipette.
- Sæt indsprøjtning mikropipetten ind i holderen, som er blevet fyldt med en 0,1 M LiCl opløsning. Fastgør mikropipetten holder til mikromanipulator. Brug af mikromanipulator grove kontroller, bringe mikropipetten ind i mellemrummet mellem toppen af målet og embryoet.Sikre, at det er et godt stykke over niveauet af embryoet. På grund af den korte arbejdsafstand på den høje effekt mål vil mikropipetten skal holdes i en flad vinkel for at bringe den i fokus (se figur 3). Du bliver nødt til at fastsætte den passende vinkel ved trial and error i første omgang. Hvis vinklen er for stejl, vil du ikke være i stand til at få den mikropipettespids i fokus. Hvis det er for lavt, vil mikropipetten akslen tilstoppe mod væggen af dæmningen holder badopløsningen på plads.
- Midten spidsen af mikropipette i synsfeltet. For at opnå dette bringer øjnene til niveauet af embryonet og flytte mikropipetten frem og tilbage i Y-akse mikroskopbordet. Når spidsen krydser lysbanen, vil du se den lyse refleksion af lysstrålerne fra det. Bevæge spidsen af mikropipette fremad i X-aksen, således at den skyder lysstrålen. Det vil være lettere at lokalisere mikropipetten i den lillesynsfelt af den høje effekt mål, hvis du er på udkig efter sin aksel snarere end dens spids. Se nu gennem mikroskopet okularerne og gradvist sænke den høje effekt målet, indtil akslen af mikropipetten er i fokus. Flytning af mikropipetten og tilbage i Y-aksen med mikromanipulator kontrollen bidrager til at lokalisere det, efterhånden som det kommer i fokus. Når akslen er i fokus, flytte mikropipetten i X-aksen, indtil dens spids ligger i midten af synsfeltet. På dette trin mikropipettespids bør være et godt stykke over niveauet af embryoet. Skift til fluorescens belysning og undersøge spidsen for at kontrollere for lækage af Dil. Justere DC-strømmen for at forhindre enhver Dil krystal dannes ved spidsen.
- Brug af mikromanipulator kontrol mikropipetten i Z-aksen lavere. Bring det tilbage i fokus med mikroskopet fokus kontrol. Gradvis lavere mikropipetten ned mod embryoet på denne måde. I første omgang, kan du gøre dette med den groveZ-aksen kontrol af mikromanipulator og mikroskop. Men da fosteret kommer i fokus, bør du skifte til de fine betjeningsknapper.
- Når overfladen af embryonet kommer i fokus, bevæger spidsen af mikropipette mod kanten af synsfeltet, i retning af mikromanipulator. Fokus på cellen, der skal injiceres, og kontrollere, at den ligger i midten af synsfeltet. Koncentrere sig om den mikropipettespids og flytte den i Y-aksen, indtil det ligger på samme niveau i Y-aksen som cellen. Bevæge spidsen af mikropipette til cellen i X-aksen som du sænker den i Z-aksen. Hvis du bruger en Leica mikromanipulator, vil du sandsynligvis opleve, at mikroskopbordet styrer give dig finere kontrol af bevægelse i X-aksen end mikromanipulator kontrol, så skifte til scenen kontrol som spidsen kommer tæt på cellen.
- Bringe mikropipettespids i kontakt med cellen og foretag en fordybning på dens overflade. Pass flere nanoamps af depolarizing strøm i et par sekunder. Du bør se en lille krystal af Dil dannes på cellen. For at bekræfte, at cellen er blevet mærket, kortvarigt åbne lukkeren at belyse foster med fluorescerende lys, derefter skifte tilbage til DIC. Hvis kroppen af cellen af interesse viser tegn på mærkning, anvendes løbende i adskillige sekunder. Slukke for nuværende og hurtigt trække embryo væk fra mikropipetten i X-aksen ved hjælp af mikroskopbordet kontrol. Derefter trække mikropipetten fra opløsningen. Hvis der ikke Dil mærkning er indlysende, kan mikropipetten blive blokeret og skal udskiftes med en frisk mikropipette. Man kan opleve, at spidsen af mikropipette har snagged andre væv undervejs til cellen af interesse, og dette væv farves snarere end cellen. I dette tilfælde, kan du prøve at trække mikropipetten lidt, og re-nærme cellen. Det kan være nødvendigt at udskifte mikropipetten og prøv igen.
- Om ønsket kan flere celler være individueltalliere mærket på samme embryo.
- Fjerne det meste af opløsningen i indsprøjtningskammeret, derefter fastsætte embryoner ved tilsætning af 7,4% formaldehyd / PBS i 10 minutter efterfulgt af 4 vaske med PBS. Embryonet efterlades derefter ved stuetemperatur i mindst 4 timer (eller natten over ved 4 ° C) i et mørkt, fugtigt kammer (for at undgå blegning eller tør faldende) for at tillade Dil at diffundere gennem neuronale processer. På dette stadium kan de DII-mærkede celler enten photoconverted eller vises direkte i konfokalt mikroskop.
5. Fotoomdannelse til undersøgelse under anvendelse af DIC Optics
Princippet om fotoomdannelse er (foto-) oxidation af DAB af det fluorescerende lys udsendt af de farvede celler under belysning med den passende bølgelængde. Dette betyder lyse celler photoconverted på kortere tid sammenlignet med svagt farvede celler. Hvis flere celler mærket i én enhed afvige for meget med hensyn til deres lysstyrke kan dette føre til difficulties i photoconverting dem alle i samme kvalitet (se figur 4C): I dette tilfælde kan man nødt til at beslutte på et kompromis mellem at forsømme de svagere celler (ved hjælp af kort belysning), eller acceptere, at de lysere celler begynder at svulme (ved hjælp af længere belysning) . Hvis alle celler er for svagt mærket (således behov for meget lang belysning), kan baggrunden forårsaget af endogene peroxidaser blive et problem. Da DAB er giftig det skal håndteres med forsigtighed. Affald kan "slås" med 7% klorblegning.
- Fotoomdannelse skal udføres for hver foster individuelt. I tilfælde, hvor kun ét æg injiceres pr slide er PBS-opløsning dækker embryo erstattet med en DAB-opløsning (3 mg DAB / ml Tris-buffer), slæden anbragt på et fluorescensmikroskop og den fyldte celle viste en 100x objektiv. (Med en opretstående mikroskop de objektive dypper ned i DAB-opløsning og skal rengøres flere gange med vand efter fotoomdannelse pROCEDURE er færdig, hvilket kan undgås, hvis et omvendt mikroskop anvendes). En Cy3 filtersæt og en 100W Hg-lampe anvendes, og cellen eksponeres for de røde excitationsbølgelængder, indtil en brun DAB reaktionsprodukt viser sig i det mærkede neuron (se periodisk ved at skifte til lyse feltbelysning). Den tid, det tager for optimal DAB-farvning er variabel, men kræver eksponering for det exciterende lys end det trin, hvor fluorescensen er fuldstændig falmet. Efter fotoomdannelse er fuldført, vaskes præparatet flere gange med PBS. Udskift PBS med et fald på 70% glycerol, skrab silicone med en skalpel klinge, udskift med en ring af vaseline og tilføje et dækglas.
- Når flere embryoer er blevet fyldt på den ene objektglas, overføre hvert embryo til en lille dråbe PBS på en separat 24 x 60 mm dækglas med den ventrale side af fosteret vendende glasset. Placer en ramme af tape rundt om hvert foster til at skabe en god og omfatter forberedelse med PBS. Holde objektglassene i et fugtigt kammer før fotoomdannelse at forhindre dem i at tørre ud. Exchange PBS dækker foster med DAB-opløsning. Anbring straks slide på et inverteret mikroskop udstyret med en 100W Hg-lampe og bruge en Cy3 filter indstillet til at vække Dil, ved hjælp af økse 50 mål. Efter fotoomdannelse, overføre embryonet til en frisk dias i et fald på 70% glycerol, tilføje et dækglas og tætning med neglelak.
6. Undersøgelse ved konfokal mikroskopi
- Efter trin 4,10, embryoner overførsel til en lille dråbe af PBS på en frisk 24 x 60 mm dækglas. Vi opnår optimale optik ved at montere de udfladede embryoer med den dorsale side mod dækglasset (efterlader kun en lille mængde PBS mellem dækglasset og embryo).
- Placere en ramme af tape rundt om fosteret og udvide PBS drop at fylde rammen, når dækket med et objektglas. Placer et dias på den omhyggeligt og fastgør det med neglelak. Udfyldte neuroner bør prøveined på et konfokalt (eller fluorescens) mikroskop så hurtigt som muligt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
4 viser typiske resultater af teknikken, er beskrevet her. 4A viser et eksempel på en Dil fyldt enkelt interneuron der var rent photoconverted. Det pænt viser mængden af detaljer disse præparater tilbud. Når de betragtes under DIC optik den rumlige sammenhæng af det mærkede celle i det ikke-mærkede omgivende væv bliver synlig, fx positionen af cellelegemet i cortex og af fiberen fremspring i neuropile.
Figur 4B er et tilfælde, hvor farvestoffet dråbe var lidt for stor resulterer i flere naboceller blive mærket samtidigt. Dette gør det ofte vanskeligt at relatere de enkelte fremskrivninger til særskilte cellelegemer. Det viser også, at når direkte ses under fluorescensmikroskop (ingen fotoomdannelse) baggrund opløsning er meget lavere.
Prøven i figur 4C
Figur 4D viser, at observation ved konfokal mikroskopi viser morfologien af mærkede celler i detaljer. Dil mærkning blev udført i en stamme, der bar en GFP reporter konstrukt. Det kan give vigtige oplysninger om den rumlige kontekst (og identitet) af farvestoffet fyldte celle inden for specifikke populationer af neuronal eller glial celletyper (som defineret af genekspression).
Som et paradigme til at vurdere morfologiske variation af en identificeret neuron har vi valgt en af de Apterous positive neuroner 14. Denne neuron ligger i en dorsal og mediale stilling tæt på neuropile (DAP, figur 5A, Lundgren et al. 1995) adskilt fra de øvrige Apterous positive neuroner og er derfor lette at identificere i apGal4-UASGFP dyr. Figur 5B viser en dAP celle der var fyldt med Dil og photoconverted. Cellelegemet ligger på niveau med den forreste commissure og viser en axon, der først vokser mod midterlinjen og derefter bliver anterior i en medial bindevæv region. Det har vækst kegle ligesom hævelser på spidsen, og vendepunktet. 19 etiketter af denne celle, tegnet som maksimale fremspring fra billedstakke, er opsummeret i figur 5C. Cellemorfologi bliver synlig for stor detalje. Kun få celler viser vækst kegle ligesom strukturer; Seks af de 19 celler også sende en filial posterior der er altid kortere end den forreste gren og kan meget vel være en forbigående funktion. I figur 5D alle 19 DAP mærkede celler er stablet med hver celle med kun en opacitet på 12%. Dette resulterer i områder er mørkere jo flere celler deler dem. Mens cellelegemet varierer mere end en cellediameter omkring midterpositionen, den mediolateral position Axon i neuropile varierer meget mindre - når neuropile bredde er opdelt i ni dele det befinder sig altid i en af de mediale to positioner.
Figur 1. Skematiske oversigt over trinnene Neuron mærkningsmetode og de to varianter.
"Fo: indhold-bredde =" 4in "fo: src =" / files/ftp_upload/50150/50150fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50150/50150fig2.jpg "/>
Figur 2. Diagram, som viser de forskellige trin i forberedelsen Drosophila embryoner til neuron farvestof injektion efter variant B. Klik her for at se større figur .
Figur 3. . Skematisk gengivelse af opsætningen for farvestof injektion Den øverste højre insert er et forstørret billede af arrangementet af prøven, injektionen mikropipetten og vandbadet elektroden A:. Mikromanipulator, B: Fast fase-mikroskop. Den mikromanipulator er sat i en flad vinkel - ca 10 & de. g; C: Mikropipette holder med mikropipette, D: Specimen på dias, E: Bath elektrode fikseret med modellervoks, F: Tilslutning til DC-forstærker.
Figur 4. Eksempler på Dil-mærkede interneuroner i den ventrale nerve ledning af etape 17 embryoner. Dorsal synspunkter, anterior er til venstre. Midterlinjen: punkterede linier.
- Et eksempel på en perfekt photoconverted enkelt celle, der viser en fremtrædende kontralateral axonal fremspring og ipsilaterale dendritiske fibre (pilespids). DIC optik.
- viser et præparat, hvor mere end én celle blev mærket - dette kan tilsløre klar fordeling af en enkelt celle organ til projektion.
- 8 celler er blevet mærket i 3 på hinanden følgende segmenter. Hertil kommer, at fotoomdannelse i dette præparat blev efterfulgt af en standardprotokol antistoffarvning mod FAS2 som en milepæl.
- viser en enkelt Dil fyldt neuron dokumenteret med konfokal mikroskopi i en flue stamme, som bærer en GFP reporter konstrukt.
Figur 5. Målrettet Dil mærkning (markeret med GFP-ekspression) afslører rækken af morfologisk variation af en identificeret neuron 14. Klik her for at se større figur .
- DAP celle (kunstigt farvet blå) kan anerkendes entydigt inden for den apterous Gal4-UASGFP mønster på maven (DAP, 5A, Lundgren et enl. 1995). GFP-udtrykkende celler er blevet farvet med et anti-GFP-antistof. Midterlinjen er markeret med stiplede linier. ac = anterior commissure, pc = posterior commissure.
- viser et eksempel på en photoconverted Dil fyldt dAP celle. Cellen blev identificeret forud for farvning udfylde en apterous Gal4-UASGFP embryo ved sin ekspression af GFP.
- Et galleri af 19 fylder af denne celle, tegnet som maksimale projektioner fra billedstakke. Dorsale udsigt. Anterior er op. Det neuropile er i lys grå, cortex område er i mørkere grå.
- De 19 Dap-celler er stablet med hver celle har en opacitet på 12%. Regionen besat af de fleste af cellerne har den mørkeste nuance af grå. The neuropile af alle prøver (blå) blev skaleret til en tilsvarende bredde og de anteriore Commissurerne siden af cellen blev rettet ind, så de overlapper hinanden. Mens cellelegemet varierer mere end en cellediameter omkring den centrale position, mediolateral position Axon i neuropile visermindre variation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En væsentlig fordel ved Drosophila som et modelsystem er, at den tillader analyse af udvikling og funktion af niveauet af enkeltceller. Dette er især nyttigt i forbindelse med nervesystemet, hvor de forskellige celletyper er usædvanlig høj og funktionen og morfologi af naboceller kan være helt forskellige.
Fremgangsmåden præsenteres her tillader mærkning af individuelle neuroner med et farvestof, som enten kan omdannes til en permanent farvning eller undersøges direkte ved fluorescensmikroskopi. Det afslører morfologien af neurale processer i stor detalje (Figur 4). En af de store fordele ved fremgangsmåden er, at den muliggør morfologien af praktisk taget enhver type neuron i CNS der skal undersøges (for det embryoniske ventrale nerve ledning under Rickert et al, 2011. For den embryonale hjerne, se Kunz et al., 2012). Desuden kræver det ikke komplekse kombinationer afgenetiske elementer skal være til stede i embryonet, da flere af de genetiske mærkningsteknikker gøre. Dye injektioner kan udføres i celler hos dyr, der bærer reporterkonstruktioner, hvorved enkelte celle morfologier skal visualiseres i forbindelse med særlige genekspression mønstre (figur 4D og 5) i enten vildtype eller mutante baggrunde. Vi har også brugt teknikken til at overvåge dynamikken i axon udvækst i levende embryonale neuroner 11, 12.
Fremgangsmåden kan let tilpasses til at mærke individuelle neuroner i embryoner af andre organismer, forudsat embryoet er transparent nok til at blive undersøgt under DIC belysning. Vi har anvendt det at visualisere neural morfologi i en lang række arthropode embryoner, herunder græshopper 18, centipedes 17, krebsdyr 19 og silverfish 16.
Den største ulempe ved tekniskeque ligger i dens tekniske vanskeligheder. Vi har tillid til, at den nuværende detaljeret redegørelse for metoden vil hjælpe interesserede forskere i mastering det.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra DFG til GMT
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DAB |  Sigma-Aldrich |
D-5905 | 2-3 mg/ml in 100 mM TRIS-Hcl, pH 7.4 |
| DiI | Invitrogen/Molecular Probes |
D-282 | 1 mg/ml in ethanol |
| Formaldehyde | Merck Millipore | 7,4 % in PBS | |
| Glycerol | Roth |
3783 | 70% in PBS |
| Heptane Glue | Beiersdorf AG | Cello 31-39-30 * | dilute ca. 1 to 1 with n-Heptane |
| PBS | 1x | ||
| TRIS | Roth |
4855 | |
| Vectashield | Vector Laboratories |
H1000 | |
| EQUIPMENT | |||
| Confocal Microscope | Leica | TCS SP2 | to view and document labelings in fluorescence |
| DC - amplifier | Dragan Corporation | Cornerstone ION-100 | to perform the labelings |
| Coverslips | Menzel |
BB018018A1 | 18 x 18 mm |
| Coverslips | Menzel |
BB024060A1 | 24 x 60 mm |
| Dissecting Microscope | Leica | MZ8 | to prepare and disect embryos |
| Flat Capillaries | Hilgenberg |
outer diameter 1 mm; glas thickness 0.1 mm | |
| Injection Capillaries | Science Products | GB 100 TF 8P | |
| Micromanipulator R | Leica | to perform the labelings | |
| Model P-97 | Sutter Instruments | to pull capillaries | |
| Object Slides | Marienfeld Superior |
1000000 | |
| Scientific Microscope | Zeiss | Axioskop 2 mot | to view labelings after photoconversion |
| Scientific Microscope | Olympus | BX50 | to perform the labelings |
| Sony MC3255 Video Camera | Sony/AVT Horn | Sony MC3255 | to record labelings after photoconversion |
Table 1. |
|||
References
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Broadie, K., Sink, H., Van Vactor, D., Fambrough, D., Whitington, P. M., Bate, M., Goodman, C. S. From growth cone to synapse: the life history of the RP3 motor neuron. Dev. Suppl. , 227-238 (1993).
- Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , Springer. Berlin. (1985).
- Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures. J. Vis. Exp. (27), e1347 (2009).
- Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule. Cell. 67, 45-57 (1991).
- Kunz, T., Kraft, K. F., Technau, G. M., Urbach, R. Origin of Drosophila mushroom body neuroblasts and generation of divergent embryonic lineages. Development. 139, 2510-2522 (2012).
- Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Levick, W. R. Another tungsten microelectrode. Med. Biol. Eng. 10, 510-515 (1972).
- Matthes, D. J., Sink, H., Kolodkin, A. L., Goodman, C. S. Semaphorin II can function as a selective inhibitor of specific synaptic arborizations. Cell. 81, 631-639 (1995).
- Murray, M. J., Whitington, P. M. Effects of roundabout on growth cone dynamics, filopodial length, and growth cone morphology at the midline and throughout the neuropile. Journal of Neuroscience. 19, 7901-7912 (1999).
- Murray, M. J., Merritt, D. J., Brand, A. H., Whitington, P. M. In vivo dynamics of axon pathfinding in the Drosophilia CNS: a time-lapse study of an identified motorneuron. J. Neurobiol. 37, 607-621 (1998).
- Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).
- Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -L., Whitington, P. M., Technau, G. M. Morphological characterization of the entire interneuron population reveals principles of neuromere organization in the ventral nerve cord of Drosophila. Journal of Neuroscience. 31, 15870-15883 (2011).
- Thomas, J. B., Bastiani, M. J., Bate, M., Goodman, C. S. From grasshopper to Drosophila: a common plan for neuronal development. Nature. 310, 203-207 (1984).
- Whitington, P., Harris, K. Early axonogenesis in the embryo of a primitive insect, the silverfish Ctenolepisma longicaudata. Development Genes and Evolution. 205 (5-6), 272-281 (1996).
- Whitington, P., Meier, T. Segmentation, neurogenesis and formation of early axonal pathways in the centipede, Ethmostigmus rubripes (Brandt). Development Genes and Evolution. 199, 349-363 (1991).
- Whitington, P. M., Seifert, E. Axon growth from limb motorneurons in the locust embryo: the effect of target limb removal on the pattern of axon branching in the periphery. Developmental Biology. 106, 438-449 (1984).
- Whitington, P. M., Leach, D., Sandeman, R. Evolutionary change in neural development within the arthropods: axonogenesis in the embryos of two crustaceans. Development. 118, 449-461 (1993).
- Williams, D. W., Tyrer, M., Shepherd, D. Tau and tau reporters disrupt central projections of sensory neurons in Drosophila. J. Comp. Neurol. 428, 630-640 (2000).
