Summary
Nous présentons une technique pour l'étiquetage des neurones simples dans le système nerveux central (SNC) de
Abstract
Dans cet article, nous décrivons comment étiqueter individuellement les neurones dans le SNC embryonnaire de Drosophila melanogaster par injection juxtacellulaire de la membrane lipophile Dil marqueur fluorescent. Cette méthode permet la visualisation de la morphologie des cellules neuronales dans les moindres détails. Il est possible de marquer n'importe quelle cellule du système nerveux central: les corps cellulaires des neurones cibles sont visualisés sous une optique DIC ou par expression d'un marqueur fluorescent génétique comme la GFP. Après marquage, le DiI peut être transformée en une tache brune permanente par photoconversion pour permettre la visualisation de la morphologie des cellules avec de la lumière transmise et de l'optique DIC. Alternativement, les cellules Dil-marqués peuvent être observés directement par microscopie confocale, permettant génétiquement introduits protéines rapporteurs fluorescents à colocalised. Cette technique peut être utilisée dans n'importe quel animal, quelle que soit le génotype, ce qui permet d'analyser les phénotypes mutants à résolution cellule unique.
Introduction
La connaissance de la morphologie neuronale au niveau des cellules individuelles est une condition essentielle pour la compréhension de la connectivité neuronale et la fonction du système nerveux central. Ainsi, dès les premiers jours de la neuroscience, les chercheurs ont cherché à développer des simples techniques de marquage de cellules (voir 7 pour un traitement historique de cette question). Les méthodes classiques comme la coloration de Golgi fournir une excellente résolution de la morphologie neuronale, mais ne sont pas adaptés si l'on cherche à identifier un type particulier de neurone d'une manière dirigée, que la coloration se produit de façon aléatoire. Le développement de méthodes pour la coloration des cellules individuelles par injection intracellulaire ou juxtacellulaire de colorants à partir d'une microélectrode l'exigence en matière d'étiquetage spécifique.
L'application de neurone unique colorant injection chez la drosophile a présenté un défi majeur, en raison de la petite taille de l'organisme et à la fois ses neurones. Néanmoins, la coloration seul neurone de Drosophila embryonnaire 15. Bien que la méthode a été éminemment utile et a fourni des renseignements clés sur les mécanismes de développement neuronal chez la drosophile au cours des 20-30 dernières années (par exemple, 2, 10), de nombreux travailleurs ont renoncé en grande partie à cause de ses exigences techniques.
La disponibilité de ces dernières années des techniques génétiques pour l'étiquetage des neurones chez la drosophile a également contribué à l'impopularité de l'injection de colorant unique neurone. Expression GAL4-dirigé des constructions GFP membrane ciblées peuvent fournir une excellente résolution de la morphologie des neurones 1, 20. Cependant, cette méthode présente certaines limites: l'expression souvent inévitable de la GFP dans les cellules multiples peuvent obscurcir la structure des neurones individuels et une ligne pilote de GAL4 peut ne pas être disponible pour conduire l'expression dans un neurone d'intérêt particulier. Le MarcM (Analyse mosaïque avec un représentantmarqueur des cellules ressible) Méthode 8 peut fournir l'étiquetage des neurones essentiellement tout au niveau de la cellule individuelle, mais ne peut pas être utilisé avec succès dans l'embryon et la larve au début à cause de la rotation lente de la protéine GAL80.
Compte tenu de ces limites de l'étiquetage génétique, nous croyons que l'injection de colorant seul neurone dans l'embryon de drosophile reste une technique intéressante et mérite une plus large application. Pour promouvoir cet objectif, nous proposons ici une description détaillée de la méthode. Une illustration de sa puissance est fournie par notre récent compte de la morphologie de l'ensemble des interneurones dans neuromeres abdominale de l'embryon chez la drosophile fin 14. Cette étude, qui révèle à la fois la variabilité morphologique des différents types de cellules neuronales et les principes d'organisation neuromere dans le SNC de l'embryon, n'aurait pas été possible avec n'importe quelle méthode d'étiquetage actuellement disponible autres.
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Protocol
Nous avons utilisé deux variantes légèrement différentes de la méthode de marquage seul neurone dans nos laboratoires. Les différences portent sur la collecte d'embryons, dechorionisation, devitellinisation et les étapes de filetage embryons. Figure 1 donne un aperçu des étapes communs et divergents des variantes.
1. Préparation des micro-aiguilles pour dissection de l'embryon et Micropipettes pour injection Dye
- Aiguilles de verre pour la dissection d'embryons sont issus de capillaires en verre (1 mm de diamètre et de 0,1 mm d'épaisseur) avec un extracteur Sutter (Science Instruments) ou un équipement comparable. En variante, une électrolyse aiguisé 0,15 mm fil de tungstène monté dans un porte-aiguille est utilisée pour la dissection. (Instructions pour électrolytique d'affûtage sont donnés dans 9).
- Micropipettes injection de colorant sont tirées à paroi mince capillaires en verre avec des filaments intérieurs (Science Products, 100 Go TF 8P) avec un extracteur Sutter (SciencesInstruments) ou équipement comparable. La pointe de la micropipette doit être pointu, avec une progressif, conique uniforme de la tige pour faciliter le passage à travers les tissus de l'embryon. La micropipette souhaitée est la «Haute Résistance microélectrodes, Sharp et Long" la variété, comme décrit à la page 20 du manuel Instrument Sutter Cookbook pipette ( http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf ). En général, les micropipettes sont retirés peu de temps avant les injections sont effectuées afin de s'assurer que leurs conseils restent aiguisés et propres.
2. Collecte, de montage et de dissection des embryons
- Collection embryon. Nous avons utilisé avec succès la méthode d'injection neurone décrit ici dans des embryons de stade 12 au 17 mars. Embryons de développer progressivement une cuticule lors de l'étape 17 et de plus en plus difficiles à disséquer. Deux approches alternatives sont disponibles pour lui obtenirbryons à un stade de développement particulier.
- Permettez-mouches pour pondre leurs œufs sur les pommes de jus de nuit des plaques de gélose recouvertes de pâte de levure. Réglez la température de la collecte des œufs en fonction de l'heure prévue de l'injection, le lendemain. Recueillir tous les oeufs le lendemain et sélectionner les embryons au stade souhaité à l'aide des critères morphologiques 3.
- Permettez-mouches à poser sur des plaques d'agar comme ci-dessus, mais échanger la plaque de gélose par une neuve chaque heure 1,5 à 25 ° C. Incuber chaque plaque pendant une période de temps définie, jusqu'à ce que les embryons ont atteint le stade de développement nécessaire.
- Dechorionation chimique. Utilisez une spatule métallique pour gratter embryons de l'agar-agar et les transférer dans un récipient en verre (par exemple, une boîte de Pétri ou bloc de cavité) contenant environ 10 ml de Ringer drosophile ou dans un tampon phosphate salin (PBS). Ajouter quelques gouttes d'eau de Javel concentrée et agiter pendant quelques minutes sur unplate-forme rotative jusqu'à ce que les bourbiers chorion au large des embryons. Laver embryons dans plusieurs changements de sonnerie / PBS jusqu'à ce qu'il n'y a pas d'odeur d'eau de Javel résiduelle. Au cours de ces lavages, veiller à ce que les embryons ne pas entrer en contact avec la surface du liquide. Sinon, ils vont flotter et deviennent difficiles à plonger pour une manipulation plus tard. En variante, dechorionation chimique peut être réalisée en utilisant la technique décrite par panier 4.
- Dechorionation mécanique (voir figure 2, étapes 1-4). Embryons transfert de la plaque de gélose sur une lame recouverte de ruban adhésif double face collante. Evitez de transférer agar avec les embryons car elle interfère avec leur adhésion à la bande. Laissez sécher pendant embryons 5 à 10 min jusqu'à ce que le chorion devient un peu fragile. (En attendant, le manteau de la lamelle nécessaire pour devitellinisation plus tard avec de la colle - voir 2.3B ci-dessous). Touchez chaque embryon doucement avec une aiguille. Le chorion se fendit et l'embryon ne s'en tenir à laedle. Embryons transférer immédiatement à un bloc de gélose pour empêcher une déshydratation et d'aligner environ 10 d'entre eux dans une rangée, avec leurs faces ventrales vers le haut.
Devitellinisation et le filetage sont faites manuellement en utilisant l'une des deux méthodes décrites dans 2.3A et 2.3B.
- Transfert d'un embryon unique dechorionated de la phase de développement approprié de l'antenne de solution de Ringer à plusieurs gouttes de Ringer dans un barrage de silicone sur une lame de microscope préalablement préparée. (Faites un barrage de 3 cm carré en étalant une mince couche de silicone sur une lame de microscope, puis ajouter une goutte de 0,01% de poly-L-lysine solution au centre de la digue. Laisser le silicone sécher pendant 24 heures.) transférer l'embryon avec une pipette Pasteur en verre, en veillant à ce que l'embryon reste en dessous de la surface de la sonnerie pendant le transfert.
Préparez l'extrémité postérieure de l'embryon avec une paire de pinces fines, tout en douceur squeeztion de l'embryon avec une paire de ciseaux iridectomie fines, environ un quart du chemin du retour de son extrémité antérieure. Ne pas couper droit à travers l'embryon. Le but est simplement de fissurer la membrane vitelline tout en causant un minimum de dommages à l'embryon. Avec la pince encore en position, utiliser une aiguille de tungstène pour faciliter l'embryon sur la membrane et la position ouverte il côté ventral vers le bas sur le chariot. L'embryon doit s'en tenir à la couche de poly-lysine.
Filet l'embryon avec une aiguille de tungstène affûtées. Doucement perforer, puis déchirer la paroi du corps le long de la ligne médiane dorsale. Utilisation de l'aiguille, poussez vers le bas sur la paroi du corps de sorte qu'il colle à la lame. Pour éviter d'endommager la paroi du corps, pousser la paroi du corps avec l'intestin interposé entre elle et l'aiguille. Ensuite, utilisez l'aiguille à se déchirer dans l'intestin à ses extrémités antérieure et postérieure et soulevez-le. Si vous le souhaitez, les embryons supplémentaires peuvent être transférées à la même diapositive, devitellinised et en filets, en prenant soin de ne pas endommager d'autres embryons déjàle coulisseau. - Enduire une lamelle 24 x 60 mm avec de l'heptane colle (voir tableau 1) en plaçant une petite goutte de colle dans le centre de la diapositive et en l'étalant avec une lamelle de 18 x 18 mm pour un film très mince. Placez la lamelle sur une lame de microscope et faire un cadre de ruban adhésif d'un côté sur les bords. Coupez l'excédent de gélose le bloc de maintien de la ligne de 10 embryons, les embryons toucher doucement avec la lamelle couvre-heptane colle. Ils doivent maintenant se conformer à la lamelle avec leurs côtés ventral vers le bas. Ajouter une quantité généreuse de PBS pour couvrir les embryons (voir la figure 2, étapes 4-6).
Pénétrer la membrane vitelline d'un verre ou d'une aiguille de tungstène sur la face dorsale de chaque embryon à proximité de son extrémité postérieure. Déchirer la membrane le long de la ligne médiane dorsale et faire glisser l'embryon sur la membrane. Orientez le côté ventral embryonnaire par ailleurs dans la colle sur le substrat heptane et le filet de l'aide de la méthode décrite dans 2.3A) (voirLa figure 2, étapes 7-8). Depuis plusieurs embryons seront découpés en filets sur la même lame, il est utile d'être soit très précis avec leur orientation ou de faire un dessin de leur orientation sur la diapositive.
- Transfert d'un embryon unique dechorionated de la phase de développement approprié de l'antenne de solution de Ringer à plusieurs gouttes de Ringer dans un barrage de silicone sur une lame de microscope préalablement préparée. (Faites un barrage de 3 cm carré en étalant une mince couche de silicone sur une lame de microscope, puis ajouter une goutte de 0,01% de poly-L-lysine solution au centre de la digue. Laisser le silicone sécher pendant 24 heures.) transférer l'embryon avec une pipette Pasteur en verre, en veillant à ce que l'embryon reste en dessous de la surface de la sonnerie pendant le transfert.
- Après filetage, les embryons peuvent être légèrement fixés pendant 10-15 min dans du formol 7,4% dans du PBS, suivi par 4 lavages en PBS. Un soin extrême doit être pris pour ne pas porter l'embryon en contact avec la surface de la solution au cours de ce processus, que les forces de tension superficielle va détruire l'embryon. Cette étape de pré-fixation n'est pas strictement nécessaire, mais elle est utile pour éviter la contraction des muscles de la paroi du corps des embryons à un stade avancé et pour aider à stabiliser les tissus embryonnaires à des stades jeunes. Gardez à l'esprit que la fixation ne font les tissus de l'embryon plus opaque et donc une qualité d'image quelque peu compromis sous observation DIC.
3. Remplissage de Micropipettes injection
Remplissez à moitié une centrifugeuse Eppendorf 0,5 ml tube avecune solution à 0,1% de la Dil carbocynanine colorant (Molecular Probes, Eugene, OR) dans de l'éthanol à 100% (veillez à utiliser «sec» EtOH absolu pour éviter la précipitation Dil). Faire un trou étroit dans le couvercle du tube et insérer l'extrémité émoussée de la micropipette à travers le trou dans le couvercle. Laissez le Dil monter le filament pendant au moins 5 min. (Toujours couvrir le trou dans le couvercle lorsqu'il n'est pas le remplissage d'une micropipette pour éviter l'évaporation de l'éthanol).
Matériel nécessaire pour l'injection de colorant neurone (figure 3).
Microscope. Un microscope à platine fixe doit être utilisé pour des neurones colorant injection pour éviter le mouvement vertical de l'embryon pendant la mise au point. Un tel mouvement serait déplacer la pipette après qu'il est entré en contact avec l'embryon. Nous avons trouvé à la fois le Zeiss Axioskop FS et les AX50/BX50 Olympus modèles de scène fixes bien adaptés à cette fin. Le microscope doit être équipé de la lumière transmise optique DIC pour la visualisation des neurons avant coloration. Le microscope doit également être un droit plutôt qu'un modèle inversé. Avec un microscope droit, la pointe de la micropipette est sur le même côté de l'embryon dans l'objectif d'observation, alors qu'avec un microscope inversé les deux sont sur des côtés opposés de l'embryon. Cette dernière disposition compromet la qualité de l'optique DIC. Le microscope doit être mis en place pour la microscopie de fluorescence, avec un jeu de filtres adapté à l'observation Dil. Depuis DiI a un spectre large comparable avec excitation et d'émission des maxima à 549 et 565 nm plusieurs jeux de filtres de cette gamme de marche sera, par exemple, ceux pour Alexa 568, Cy3, la rhodamine, le rouge Texas ou TRITC. Bien qu'il soit nécessaire de prévoir un obturateur à commande électronique dans le chemin de la source de lumière de fluorescence, pour permettre le fonctionnement de l'obturateur sans contact manuel avec le microscope, nous avons aussi efficacement étiquetés sur une configuration qui n'était équipé que d'un obturateur manuel. Enfin, un fort grossissement, numérique élevée apertuobjectif à immersion re de l'eau est nécessaire pour l'observation pendant l'injection. Cet objectif devrait être conçu pour être utilisé sans une lamelle. Nous avons utilisé avec succès le Zeiss Achroplan 100x/1.0W, Olympus FL LUMPlan 100x/1.0W et Olympus FL LUMPlan / IR 60x/0.9 objectifs W.
Un micromanipulateur est nécessaire de positionner et de déplacer la micropipette lors de neurone colorant injection. Nous avons utilisé à la fois le micromanipulateur Leica et une scène montée Narashige 3-axe micromanipulateur hydraulique.
Un amplificateur à courant continu intracellulaire, avec l'installation d'injection de courant, est nécessaire à l'injection iontophorétique de DiI de la micropipette.
4. Procédure à suivre pour l'injection de colorant
- Placer la lame avec l'embryon monté (s) sur la platine du microscope d'injection (Figure 3). Utiliser un objectif 10x pour localiser un embryon et l'amener dans le centre du champ de vue.
- Swtion de l'objectif de forte puissance dans la position de visualisation et de mettre en lumière l'embryon. Localiser la cellule d'intérêt sous une optique (DIC ou par fluorescence si la cellule cible exprimant la GFP) et l'amener vers le centre du champ de vision. Faire en sorte que le diaphragme de champ du microscope est ouvert juste au bord du champ de vue, pas au-delà. Un faisceau d'éclairage étroit de faciliter le positionnement de la micropipette (voir l'étape 4.4 ci-dessous). Soulever l'objectif jusqu'à ce qu'elle soit la plus élevée possible au-dessus de l'embryon, tout en restant en contact avec la solution de Ringer / PBS.
- Placer l'électrode de bain pour l'amplificateur à courant continu dans le puits claire de l'embryon et de la trajectoire de la micropipette PBS.
- Insérer la micropipette injection dans son support, qui a été rempli d'une solution 0,1 M de LiCl. Fixez le support micropipette pour le micromanipulateur. À l'aide des commandes secondaires micromanipulateur, amener la micropipette dans l'espace entre l'extrémité de l'objectif et de l'embryon.Assurez-vous qu'il est bien au-dessus du niveau de l'embryon. En raison de la courte distance de travail de l'objectif de forte puissance, la micropipette devra être maintenu à un angle peu profond afin de le mettre en mise au point (voir figure 3). Vous aurez à établir l'angle approprié par essais et erreurs en première instance. Si l'angle est trop raide, vous ne serez pas en mesure d'obtenir la pointe de la micropipette dans le foyer. Si elle est trop faible, l'arbre micropipette se souiller contre la paroi du barrage de retenue de la solution du bain en place.
- Centre de la pointe de la micropipette dans le champ de vision. Pour ce faire, amenez vos yeux au niveau de l'embryon et déplacer la micropipette avant en arrière dans l'axe Y de la platine du microscope. Lorsque la pointe traverse la trajectoire de la lumière, vous verrez le reflet lumineux des rayons lumineux provenant de celui-ci. Déplacer la pointe de la micropipette à l'avant de l'axe X de sorte que le dépassement du faisceau lumineux. Il sera plus facile de localiser la micropipette dans le petitchamp de vision de l'objectif de forte puissance si vous êtes à la recherche de son arbre plutôt que sa pointe. Maintenant regarder à travers les oculaires du microscope et l'objectif de diminuer progressivement la puissance élevée jusqu'à ce que l'arbre de la micropipette est mis au point. Déplacer la micropipette en avant et en arrière de l'axe Y avec les commandes micromanipulateur permet de montrer, comme il vient progressivement au point. Lorsque l'arbre est au point, déplacer la micropipette à l'axe X jusqu'à ce que sa pointe se trouve au centre du champ de vue. A ce stade de la pointe de la micropipette doit être bien au-dessus du niveau de l'embryon. Passez à l'éclairage par fluorescence et d'examiner la pointe de vérifier s'il ya des fuites de Dil. Ajuster le courant continu pour empêcher toute formation de cristaux DiI à la pointe.
- À l'aide des commandes micromanipulateur, abaisser la micropipette à l'axe Z. Ramenez dans le foyer avec le système de focalisation du microscope. Abaisser progressivement la micropipette descend vers l'embryon de cette manière. Au départ, vous pouvez le faire avec le grossierL'axe Z contrôles de la micromanipulateur et d'un microscope. Cependant, comme l'embryon est mis au point, vous devriez passer aux boutons de réglage fin.
- Lorsque la surface de l'embryon est au point, déplacer la pointe de la micropipette en direction du bord du champ de vue, dans le sens de la micromanipulateur. Concentrez-vous sur la cellule pour être injecté et vérifier qu'il se trouve au centre du champ de vision. Recentrer sur la pointe de la micropipette et le déplacer dans l'axe Y jusqu'à ce qu'il se trouve au même niveau dans l'axe des Y à la cellule. Déplacer la pointe de la micropipette vers la cellule dans l'axe X comme vous le faites descendre dans l'axe Z. Si vous utilisez un micromanipulateur Leica, vous trouverez probablement que la platine du microscope contrôle vous donne un contrôle plus fin de mouvement dans l'axe X que les contrôles micromanipulateur, donc passer à l'étape du contrôle que la pointe se rapproche de la cellule.
- Amener la pointe de la micropipette en contact avec la cellule et de faire une dépression sur sa surface. NA passer plusieurs depolariziactuelle ng pendant quelques secondes. Vous devriez voir un petit cristal de Dil se former sur la cellule. Pour confirmer que la cellule a été marqué, il ouvre brièvement sur le déclencheur pour éclairer l'embryon avec une lumière fluorescente, puis revenez à une CIVD. Si le corps de la cellule d'intérêt présente des signes de marquage, appliquer un courant de quelques secondes supplémentaires. Couper le courant et retirer rapidement l'embryon loin de la micropipette à l'axe X en utilisant la commande de la platine du microscope. Puis retirer la micropipette de la solution. Si aucun étiquetage Dil est évident, la micropipette peut être bloqué et devra être remplacé avec une nouvelle micropipette. Vous pouvez constater que la pointe de la micropipette a accroché autres tissus en route vers la cellule d'intérêt et ce tissu est taché plutôt que de la cellule. Dans ce cas, essayez de retirer la micropipette légèrement et ré-aborder la cellule. Il peut être nécessaire de remplacer la micropipette et essayez à nouveau.
- Si vous le souhaitez, plusieurs cellules peuvent être indis'allier étiquetés dans la même embryon.
- Éliminer la majeure partie de la solution dans la chambre d'injection, puis de fixer les embryons en ajoutant du formaldéhyde 7,4% / PBS pendant 10 min suivie de 4 lavages avec du PBS. L'embryon est ensuite laissé à température ambiante pendant au moins 4 heures (ou une nuit à 4 ° C) dans un endroit sombre, chambre humide (pour éviter de blanchiment ou de tomber à sec) pour permettre à l'Dil se diffuser à travers les processus neuronaux. A ce stade, les cellules DII-marqués peuvent être soit photoconverted ou affichés directement dans le microscope confocal.
5. Photoconversion pour examen à l'aide Optique DIC
Le principe de l'oxydation de photoconversion est (photo-) de DAB par la lumière fluorescente émise par la cellule colorée pendant l'illumination avec la longueur d'onde appropriée. Cela signifie que les cellules lumineuses sont photoconverted en moins de temps par rapport aux cellules faiblement colorés. Si plusieurs cellules marquées dans un spécimen trop différents quant à leur luminosité cela peut conduire à difficulties dans photoconverting tous dans la même qualité (voir la figure 4C): dans ce cas, on peut avoir à se prononcer sur un compromis entre négliger les cellules les plus faibles (en utilisant un éclairage court) ou accepter que les cellules claires commencent à gonfler (en utilisant plus d'éclairage) . Si toutes les cellules sont trop faiblement marqués (donc nécessitant un éclairage très long), fond causé par les peroxydases endogènes peut devenir un problème. Depuis DAB est toxique, il doit être manipulé avec soin. Les déchets peuvent être «désactivé» avec 7% de chlore de blanchiment.
- Photoconversion doit être effectué individuellement pour chaque embryon. Dans le cas où un seul embryon est injecté par lame, la solution PBS couvrant l'embryon est remplacé par une solution DAB (3 mg DAB / ml de tampon Tris), le coulisseau placé sur un microscope à fluorescence et la cellule remplie de vues avec un objectif 100X. (À l'aide d'un microscope droit des trempettes objectives dans la solution DAB et doit être nettoyé plusieurs fois avec de l'eau après la photoconversion pROCÉDURE est terminé, ce qui peut être évité si un microscope inversé est utilisé). Un ensemble filtre Cy3 et une lampe Hg 100 W sont utilisés et la cellule exposée à des longueurs d'onde d'excitation rouges jusqu'à ce que le produit réactionnel brun DAB se manifeste dans le neurone marqué (vérifier périodiquement par la commutation de l'éclairage à fond clair). Le temps pris pour la coloration DAB optimale est variable, mais nécessite une exposition à la lumière d'excitation au-delà du stade où la fluorescence a complètement disparu. Après photoconversion est terminé, lavez la préparation à plusieurs reprises avec du PBS. Remplacer le PBS avec une goutte de glycérol 70%, gratter la silicone avec une lame de scalpel, remplacez-le par un anneau de vaseline et ajouter une lamelle.
- Lorsque plusieurs embryons ont été remplis sur la diapositive un, transférer chaque embryon d'une petite goutte de PBS sur une lamelle séparée de 24 x 60 mm avec la face ventrale de l'embryon face à la vitre. Placez un cadre de ruban adhésif autour de chaque embryon pour créer un puits et couvrir la préparation avec PBS. Gardez les lames dans une chambre humide avant de photoconversion pour les empêcher de se dessécher. Bourse du PBS couvrant l'embryon avec une solution DAB. Immédiatement placer la lame sur un microscope inversé équipé d'une lampe 100W Hg et utiliser un filtre Cy3 mis à exciter le Dil, en utilisant AX 50 objectif. Après photoconversion, transfert d'embryons frais à une diapositive dans une goutte de glycérol à 70%, ajouter une lamelle et joint avec du vernis à ongles.
6. Examen par microscopie confocale
- Après l'étape de transfert d'embryons 4.10, à une petite goutte de PBS sur une nouvelle lamelle 24 x 60 mm. Nous réalisons optiques optimales en montant les embryons aplaties, à la face dorsale vers la lamelle (laissant seulement une petite quantité de PBS entre la lamelle et embryon).
- Placez un cadre de ruban adhésif autour de l'embryon et agrandir la baisse du PBS pour remplir le cadre lorsqu'il est recouvert avec un toboggan. Placez une diapositive sur-le attentivement et le fixer avec du vernis à ongles. Neurones doivent être remplis examenminé sur un confocale (ou fluorescence) microscope le plus tôt possible.
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Representative Results
La figure 4 illustre les résultats typiques de la technique, que nous décrivons ici. Figure 4A montre un exemple de Dil interneurone unique rempli qui a été proprement photoconverted. Il démontre bien le niveau de détail de ces préparatifs offre. Lorsqu'elle est vue sous une optique DIC le contexte spatial de la cellule marquée dans le tissu environnant non marqué est visible, par exemple, la position du corps de la cellule à l'intérieur de l'écorce et de la projection de fibres à l'intérieur de la neuropile.
La figure 4B est un cas où la goutte de colorant était un peu trop grand entraîne plusieurs cellules voisines deviennent marqués simultanément. Cela rend souvent difficile de relier les projections individuelles pour les corps cellulaires distincts. Elle montre aussi que lorsqu'il est directement visualisée sous le microscope à fluorescence (pas photoconversion) Résolution arrière-plan est beaucoup plus faible.
Le spécimen figure 4C
Figure 4D montre que l'observation en microscopie confocale révèle la morphologie des cellules marquées en détail. Dil étiquetage a été réalisée dans une souche qui a réalisé une construction rapporteur GFP. Cela peut fournir des informations importantes sur le contexte spatial (et l'identité) de la cellule à colorant pourvoir au sein des populations spécifiques de neurones ou gltypes de cellules ial (tel que défini par l'expression des gènes).
Comme un paradigme pour évaluer la variabilité morphologique d'un neurone identifié, nous avons choisi l'un des neurones positifs aptères 14. Ce neurone se trouve dans une position proche dorsal et médian à la neuropile (DAP, la figure 5A, Lundgren et al., 1995) distinct des autres aptères neurones positifs et est donc facilement identifiable dans apGal4-UASGFP animaux. Figure 5B montre une cellule dAP qui a été rempli avec Dil et photoconverted. Le corps de la cellule se situe au niveau de la commissure antérieure et présente un axone qui pousse d'abord vers la ligne médiane et ensuite tourne dans une région antérieure médiale conjonctif. Il a cône de croissance comme des gonflements à l'extrémité et le point d'inflexion. 19 labels de cette cellule, établi que les projections maximales de piles d'images, sont résumées dans la figure 5C. La morphologie cellulaire devient visible pour les détails. Seules quelques cellules montrent cône de croissance comme structures, six des 19 cellules aussi envoyer un postérieur branche qui est toujours plus courte que la branche antérieure et pourrait bien être une caractéristique temporaire. La figure 5D tous les 19 cellules marquées DAP sont empilées, chaque cellule ayant seulement une opacité de 12%. Cela se traduit par des zones sombres étant les cellules plus les partager. Tandis que le corps de la cellule varie de plus d'un diamètre de cellule autour de la position centrale, la position médio-latérale de l'axone dans le neuropile varie beaucoup moins - lorsque la largeur neuropile est divisée en neuf parties qu'il se trouve toujours dans une des deux positions médianes.
Figure 1. Aperçu schématique des étapes de la méthode de marquage des neurones et ses deux variantes.
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Figure 2. Schéma illustrant les différentes étapes de la préparation embryons de drosophile pour neurone colorant injection, selon la variante B. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 3. . Représentation schématique de la configuration de l'injection de colorant L'insert en haut à droite est une vue agrandie de la disposition de l'échantillon, la micropipette d'injection et l'électrode de bain A:. Micromanipulateur, B: microscope à platine fixe. Le micromanipulateur est fixé à un angle faible - environ 10 et de. g; C: Porte Micropipette avec micropipette, D: Spécimen de la diapositive, E: Bain électrode fixe avec de la plasticine, F: Raccordement à un amplificateur à courant continu.
Figure 4. Exemples de interneurones Dil-marqués dans la chaîne nerveuse ventrale de l'étape 17 embryons. Dorsale de vue, est antérieure à gauche. Ligne médiane: lignes en pointillés.
- Un exemple d'une cellule parfaitement photoconverted unique, montrant une importante projection axonale controlatéral et ipsilatéral fibres dendritiques (tête de flèche). Optique DIC.
- montre une préparation dans laquelle plus d'une cellule a été étiqueté - ce qui peut obscurcir l'affectation précise d'un organisme unicellulaire à sa projection.
- 8 cellules ont été marqués en 3 segments consécutifs. En outre, dans cette préparation la photoconversion a été suivie par une coloration des anticorps contre le protocole standard FAS2 comme point de repère.
- montre un seul Dil remplie de neurone documentée par microscopie confocale dans une souche portant une mouche journaliste GFP.
Figure 5. Ciblée Dil étiquetage (marquée par une expression de GFP) révèle l'étendue de la variabilité morphologique d'un neurone identifié 14. Cliquez ici pour agrandir la figure .
- La cellule dAP (artificiellement coloré en bleu) peut être reconnue sans ambiguïté dans le aptères Gal4-UASGFP modèle dans l'abdomen (DAP, la figure 5A, Lundgren et all., 1995). Cellules GFP exprimant ont été colorées avec un anticorps anti-GFP. La ligne médiane est marqué par des lignes pointillées. ac = commissure antérieure, pc = commissure postérieure.
- montre un exemple d'une cellule dAP Dil rempli photoconverted. La cellule a été identifié avant de teindre remplissant un aptères Gal4-UASGFP embryon par son expression de la GFP.
- Une galerie de 19 remplit de cette cellule, établi que les projections maximales de piles d'images. Face dorsale. Antérieure est en place. Le neuropile est en gris clair, la zone de cortex est en gris plus foncé.
- Les 19 cellules DAP sont empilées, chaque cellule ayant une opacité de 12%. La région occupée par la plupart des cellules a la teinte la plus foncée de gris. Le neuropile de tous les échantillons (en bleu) a été réduite à une largeur similaire et les commissures antérieures à côté de la cellule ont été alignés de sorte qu'ils se chevauchent. Tandis que le corps de la cellule varie de plus d'un diamètre de cellule autour de la position centrale, la position médio-latérale de l'axone dans le neuropile montremoins de variation.
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Discussion
Un avantage majeur de la drosophile comme modèle de système est qu'il permet l'analyse du développement et de la fonction au niveau des cellules individuelles. Ceci est particulièrement utile en ce qui concerne le système nerveux, où la diversité des types de cellules est exceptionnellement élevé et la fonction et la morphologie des cellules voisines peut être totalement différente.
Procédé nous présentons ici permet le marquage des neurones individuels avec un colorant qui peut être soit transformée en une tache permanente ou à l'examen direct au microscope à fluorescence. Il révèle la morphologie des processus neuronaux dans les moindres détails (figure 4). L'un des principaux avantages de la méthode est qu'elle permet la morphologie de pratiquement n'importe quel type de neurones dans le SNC à examiner (pour le cordon nerveux ventral embryonnaire, voir Rickert et al, 2011;. Pour le cerveau embryonnaire, voir Kunz et al., 2012). En outre, il ne nécessite pas de combinaisons complexes deéléments génétiques d'être présents dans l'embryon, comme plusieurs des techniques de marquage génétique faire. Injections de colorants peuvent être effectués dans des cellules d'animaux porteurs de constructions rapporteurs, permettant ainsi à des morphologies cellulaires individuels pour être visualisées dans le contexte particulier de l'expression des gènes (figures 4D et 5) soit de type sauvage ou mutantes milieux. Nous avons également utilisé la technique pour suivre la dynamique de la croissance axonale des neurones embryonnaires dans le salon 11, 12.
La méthode peut être facilement adaptée à étiqueter les neurones individuels chez les embryons d'autres organismes, à condition de l'embryon est assez transparent pour être examiné sous un éclairage DIC. Nous l'avons utilisé pour visualiser la morphologie de neurones dans une grande variété d'embryons d'arthropodes, y compris les sauterelles 18, mille-pattes 17, 19 et crustacés poissons d'argent 16.
L'inconvénient majeur de la techniqueQue réside dans sa difficulté technique. Nous sommes convaincus que le compte courant détaillée de la méthode aidera les chercheurs intéressés à le maîtriser.
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Disclosures
Les auteurs déclarent n'avoir aucun conflit d'intérêts financiers.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention de la DFG avec l'heure GMT
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DAB |  Sigma-Aldrich |
D-5905 | 2-3 mg/ml in 100 mM TRIS-Hcl, pH 7.4 |
| DiI | Invitrogen/Molecular Probes |
D-282 | 1 mg/ml in ethanol |
| Formaldehyde | Merck Millipore | 7,4 % in PBS | |
| Glycerol | Roth |
3783 | 70% in PBS |
| Heptane Glue | Beiersdorf AG | Cello 31-39-30 * | dilute ca. 1 to 1 with n-Heptane |
| PBS | 1x | ||
| TRIS | Roth |
4855 | |
| Vectashield | Vector Laboratories |
H1000 | |
| EQUIPMENT | |||
| Confocal Microscope | Leica | TCS SP2 | to view and document labelings in fluorescence |
| DC - amplifier | Dragan Corporation | Cornerstone ION-100 | to perform the labelings |
| Coverslips | Menzel |
BB018018A1 | 18 x 18 mm |
| Coverslips | Menzel |
BB024060A1 | 24 x 60 mm |
| Dissecting Microscope | Leica | MZ8 | to prepare and disect embryos |
| Flat Capillaries | Hilgenberg |
outer diameter 1 mm; glas thickness 0.1 mm | |
| Injection Capillaries | Science Products | GB 100 TF 8P | |
| Micromanipulator R | Leica | to perform the labelings | |
| Model P-97 | Sutter Instruments | to pull capillaries | |
| Object Slides | Marienfeld Superior |
1000000 | |
| Scientific Microscope | Zeiss | Axioskop 2 mot | to view labelings after photoconversion |
| Scientific Microscope | Olympus | BX50 | to perform the labelings |
| Sony MC3255 Video Camera | Sony/AVT Horn | Sony MC3255 | to record labelings after photoconversion |
Table 1. |
|||
References
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