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Neuroscience

Beschriften einzelner Zellen im zentralen Nervensystem Published: March 4, 2013 doi: 10.3791/50150
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1
1Institute of Genetics, University of Mainz, 2Department of Anatomy and Neuroscience, University of Melbourne

Summary

Wir stellen eine Technik zur Markierung von einzelnen Neuronen im Zentralnervensystem (ZNS) von

Abstract

In diesem Artikel beschreiben wir, wie Sie individuell beschriften Neuronen in den embryonalen ZNS von Drosophila melanogaster durch juxtacellular Injektion des lipophilen fluoreszierende Membran Marker DiI. Diese Methode erlaubt die Visualisierung von neuronalen Zellmorphologie im Detail. Es ist möglich, eine beliebige Zelle im ZNS kennzeichnen: Zellkörper Zielneuronen stehen unter DIC Optik oder durch Expression eines fluoreszierenden genetischen Marker wie GFP visualisiert. Nach der Markierung kann die DiI in einen permanenten braunen Fleck von Photokonversion umgewandelt werden zur Visualisierung der Zellmorphologie mit Durchlicht-und DIC-Optik ermöglichen. Alternativ können die DiI-markierten Zellen direkt mit konfokale Mikroskopie beobachtet werden, wodurch gentechnisch eingeführte fluoreszierenden Reporter-Proteine ​​zu colocalised werden. Die Technik kann bei einem Tier verwendet werden, unabhängig von Genotyp, die es ermöglichen, bei Mutantenphänotypen Einzelzelle Auflösung zu analysieren.

Introduction

Wissen über neuronale Morphologie auf der Ebene der einzelnen Zellen ist eine wichtige Voraussetzung für das Verständnis neuronaler Verschaltungen und ZNS-Funktion. So wird aus den frühesten Tagen der Neurowissenschaften haben Forscher versucht, einzelne Zelle Kennzeichnung Techniken (siehe 7 für eine historische Aufarbeitung dieser Ausgabe) zu entwickeln. Klassische Methoden wie Golgi-Färbung eine ausgezeichnete Auflösung von neuronale Morphologie jedoch nicht geeignet sind, wenn man eine bestimmte Art von Neuronen in einer gerichteten Weise gekennzeichnet werden, wie Färbung erfolgt in einer zufälligen Weise sucht. Die Entwicklung von Verfahren zum Anfärben einzelner Zellen durch intrazelluläre oder juxtacellular Injektion von Farbstoffen von einer Mikroelektrode adressiert die Anforderung der spezifischen Markierung.

Die Anwendung der einzelnen Neurons Farbstoffinjektion zu Drosophila eine große Herausforderung, wegen der geringen Größe der sowohl dem Organismus und seiner Neuronen. Dennoch einzelnen Neurons Färbung von embryonalen Drosophila 15 erreicht. Während das Verfahren war eminent nützlich und hat einige wichtige Einblicke in Mechanismen für die neuronale Entwicklung in Drosophila in den letzten 20-30 Jahren (z. B. 2, 10), haben viele Arbeitnehmer davon entfernt gescheut, vor allem wegen seiner technischen Anforderungen.

Die Verfügbarkeit in den letzten Jahren der genetischen Techniken zur neuronalen Kennzeichnung in Drosophila wurde auch auf die Unbeliebtheit des einzelnen Neurons Farbstoffinjektion beigetragen. GAL4-gerichtete Expression von Membran-gezielte GFP-Konstrukte können eine hervorragende Auflösung von neuronalen Morphologie 1, 20. Allerdings hat diese Methode bestimmte Einschränkungen: die oft unvermeidlichen Expression von GFP in mehrere Zellen können die Struktur der einzelnen Neuronen zu verschleiern und eine GAL4 Fahrerpaarung möglicherweise nicht zur Verfügung, um die Expression in einem bestimmten Neuron von Interesse zu fahren. Die marcm (Mosaic Analyse mit einem Repressible Zellmarker) Methode 8 bieten kann Etikettieren von im Wesentlichen jedem Neuron in der einzelnen Zelle Ebene, aber nicht erfolgreich im Embryo und frühe Larve wegen der langsamen Umsatz des GAL80-Proteins verwendet werden.

Angesichts dieser Einschränkungen der genetischen Kennzeichnung, glauben wir, dass einzelne Neuron Farbstoff Injektion in den Drosophila-Embryo bleibt eine wertvolle Technik und verdient eine breitere Anwendung. Um dieses Ziel zu fördern, geben wir hier eine detaillierte Beschreibung des Verfahrens. Eine Abbildung der Leistung wird durch unsere jüngsten Berücksichtigung der Morphologie des kompletten Satz von Interneuronen abdominalen Neuromeren des späten Drosophila-Embryo 14 vorgesehen. Diese Studie, die sowohl die morphologische Variabilität der einzelnen neuronalen Zelltypen und die Prinzipien der Neuromer Organisation im ZNS des Embryos zeigten, wären nicht mit irgendeinem anderen aktuell verfügbaren Markierungsverfahren möglich gewesen.

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Protocol

Wir haben zwei leicht unterschiedliche Varianten der einzelnen Neurons Markierungsverfahren in unseren Labors eingesetzt. Die Unterschiede beziehen sich auf die Entnahmebestandes dechorionisation, devitellinisation und Embryo Filetieren Schritte. Abbildung 1 gibt einen Überblick über die gemeinsamen und divergierenden Schritte der Varianten.

Ein. Vorbereitung der Micro-Nadeln für Embryo Dissection und Mikropipetten für Dye Injection

  1. Glass Nadeln für Embryos Dissektion von Glaskapillaren (1 mm Durchmesser und 0,1 mm Wandstärke) mit einem Sutter Abzieher (Science Instruments) oder vergleichbare Geräte gezogen. Alternativ wird ein elektrolytisch geschärften 0,15 mm Wolframdraht in einem Nadelhalter angebracht ist zum Sezieren verwendet. (Anweisungen für elektrolytische Schärfen sind in 9 angegeben).
  2. Mit einem Sutter Abzieher (Science; Dye Injection Mikropipetten sind aus dünnwandigen Glaskapillaren mit inneren Filamente (GB 100 TF 8P Science Products) gezeichnetInstruments) oder vergleichbare Geräte. Die Mikropipettenspitze muss scharf sein, mit einer allmählichen, gleichmäßige Verjüngung des Schaftes, um den Durchgang durch die Gewebe des Embryos zu unterstützen. Die gewünschte Mikropipette ist die "High Resistance Mikroelektroden, Sharp und Long" Vielfalt, wie auf S.20 des Sutter Instrument Pipette Kochbuch Anleitung beschrieben ( http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf ). Im Allgemeinen sind Mikropipetten kurz vor Injektionen durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass ihre Spitzen bleiben scharf und sauber gezogen.

2. Collection, Montage und Dissection von Embryonen

  1. Embryo Collection. Wir haben erfolgreich das Neuron Injektionsverfahren verwendet haben hier beschriebenen Embryonen aus den Stufen 12 bis 17 März. Embryonen schrittweise Entwicklung einer Kutikula während der Stufe 17 und immer schwieriger zu sezieren. Zwei alternative Ansätze zur Verfügung em erhaltenbryos zu einem bestimmten Entwicklungsstadium.
    1. Lassen Fliegen Eier über Nacht auf Apfelsaft-Agarplatten mit Hefe Paste beschichtet legen. Stellen Sie die Temperatur von Ei-Sammlung auf den geplanten Zeitpunkt der Injektion am nächsten Tag anzupassen. Sammeln Sie alle Eier am nächsten Tag und wählen Embryonen im gewünschten Stufe anhand morphologischer Kriterien 3.
    2. Lassen Sie fliegt auf Agarplatten wie oben lag, aber die Swap-Agar-Platte mit einem frischen alle 1,5 Stunden bei 25 ° C. Inkubieren Sie jede Platte für einen definierten Zeitraum, bis Embryonen erreicht haben das Entwicklungsstadium erforderlich.
    1. Chemische Dechorionation. Verwenden Sie einen Metallspatel Embryonen aus dem Agar kratzen und übertragen Sie sie in ein Glasgefäß (zB Petrischale oder Matrize) mit etwa 10 ml Drosophila Ringer oder Phosphat Kochsalzlösung (PBS) gepuffert. Fügen Sie ein paar Tropfen konzentrierte Bleichmittel und rühren für ein paar Minuten auf einemDrehplattform bis die Chorion abgestoßen der Embryonen. Waschen Embryonen in mehreren Änderungen der Ringer / PBS, bis kein Geruch von Bleichmittelreste. Während dieser wäscht, sicherzustellen, dass die Embryos nicht in Kontakt mit der flüssigen Oberfläche. Andernfalls werden sie schweben und schwierig zu versenken für die spätere Manipulation. Alternativ können chemische dechorionation unter Verwendung der Technik, die von Korb 4 beschrieben durchgeführt werden.
    2. Mechanische dechorionation (siehe Abbildung 2, Schritte 1-4). Transfer Embryonen aus der Agarplatte zu einer Folie mit doppelseitigem Klebeband abgedeckt. Vermeiden Sie die Übertragung Agar mit den Embryonen, wie es mit deren Haftung auf dem Band nicht stört. Erlauben Embryonen für 5 bis 10 min trocknen, bis das Chorion bekommt leicht spröde. (Während des Wartens, Mantel das Deckglas für eine spätere devitellinisation mit Leim benötigt wird - vgl. Punkt 2.3b). Berühren Embryo vorsichtig mit einer Nadel. Das Chorion wird aufgespalten und der Embryo wird dem ne-Stickedle. -Embryonen sofort auf einem Agar-Block zum Trocknen zu verhindern und etwa 10 von ihnen in einer Reihe auszurichten, mit ihren ventralen Seiten nach oben zeigen.

Devitellinisation und Filetieren werden manuell über eine der beiden Methoden in 2.3A und 2.3B beschrieben durchgeführt.

    1. Übertragen eines einzelnen dechorionated Embryo der entsprechenden Entwicklungsstadium von der Schale von Ringer-Lösung, um mehrere Tropfen Ringer in einem Silikon Damm auf einer vorbereiteten Objektträger. (Einen 3 cm im Quadrat dam durch Verschmieren eine dünne Schicht aus Silikon auf einem Objektträger, dann einen Tropfen von 0,01% Poly-L-Lysin-Lösung auf die Mitte des Dammes. Lassen Sie das Silikon für 24 Stunden aushärten.) Übertragen des Embryos mit einem Glas Pasteurpipette sicherzustellen, dass der Embryo unter der Oberfläche des Ringer während der Übertragung verbleibt.
      Brace das hintere Ende des Embryos mit einer feinen Pinzette, während sanft squeezING den Embryo mit einer feinen Iridektomie Schere, etwa ein Viertel der Weg zurück von seinem vorderen Ende. Nicht rechts abgeschnitten durch den Embryo. Ziel ist es, gerade knacken die Vitellin-Membran während bewirkt minimale Beschädigung des Embryos. Mit der Zange noch in der Lage, mit einem Wolfram-Nadel, um den Embryo Leichtigkeit aus der geöffneten Membran und Stellung ventralen Seite nach unten auf die Folie. Der Embryo sollte dem Polylysin Mantel kleben.
      Filet der Embryo mit einem geschärften Wolframnadel. Gently durchlöchern, dann reißen den Körper Mauer entlang der dorsalen Mittellinie. Verwendung der Nadel nach unten drücken der Körperwand, so dass es zu der Folie klebt. Um Schäden an den Körper Wand zu verhindern, schieben den Körper Wand mit dem Darm zwischen ihm und der Nadel eingefügt. Dann nutzen Sie die Nadel durch den Darm an seinem vorderen und hinteren Enden reißen und heben Sie sie weg. Falls gewünscht, können zusätzliche Embryonen auf derselben Folie übertragen werden kann, und filetiert devitellinised, dabei nicht auf andere Embryonen bereits auf beschädigender Schieber.
    2. Mantel ein 24 x 60 mm Deckglas mit Heptan Kleber (siehe Tabelle 1), indem ein kleiner Tropfen Klebstoff in der Mitte des Schiebers und sie spannen mit einem 18 x 18 mm Deckglas auf einem sehr dünnen Film. Platzieren des Deckplättchens auf einen Mikroskop-Objektträger und einen Rahmen aus einem Klebeband um seine Ränder. Schneiden Sie überschüssige Agar aus dem Block die Reihe von 10 Embryonen, sanft berühren die Embryonen mit dem Deckglas Heptan Kleber Deckglas. Sie sollten nun auf dem Deckglas haften mit ihrem ventralen Seite nach unten zeigt. Fügen Sie eine großzügige Menge von PBS, die Embryonen abzudecken (siehe Abbildung 2, Schritte 4-6).
      Durchdringen die Vitellin-Membran mit einem Glas oder Wolframnadel auf der dorsalen Seite jeder Embryo nahe seinem hinteren Ende. Reißen Sie die Membran entlang der dorsalen Mittellinie und ziehen den Embryo aus der Membran. Orient der Embryo Bauchseite an anderer Stelle auf dem Substrat und Heptan Leim Filet es unter Verwendung desselben Verfahrens in 2.3A beschriebenen) (sieheAbbildung 2, Schritte 7-8). Da mehrere Embryonen auf derselben Folie verrundet werden wird, ist es hilfreich, entweder sehr genau mit ihrer Ausrichtung oder eine Zeichnung von ihrer Orientierung auf der Folie.
  2. Nach Filetieren, Embryonen leicht kann für 10-15 min in 7,4% Formaldehyd in PBS fixiert, gefolgt von vier Wäschen in PBS. Es muss besonders darauf geachtet werden, dass der Embryo in Kontakt zu bringen mit der Oberfläche der Lösung bei diesem Vorgang, da die Kräfte der Oberflächenspannung des Embryos zerstören wird. Diese Vorfixierung Schritt ist nicht unbedingt notwendig, aber es ist nützlich, um die Kontraktion der Körper Wand Muskeln im späten Stadium Embryonen zu verhindern und zur Stabilisierung embryonalem Gewebe an junge Stufen. Denken Sie daran, dass die Fixierung nicht machen das Gewebe des Embryos mehr undurchsichtig und so etwas Kompromisse Bildqualität unter DIC Beobachtung.

3. Füllen von Injection Mikropipetten

Hälfte füllen ein 0,5 ml Eppendorf-Mikrozentrifugenröhrchen miteine 0,1% ige Lösung des carbocynanine Farbstoff DiI (Molecular Probes, Eugene, OR) in 100% Ethanol (achten Sie darauf, "trocken" absolute EtOH verwenden, um DiI Niederschläge zu vermeiden). Einen schmalen Loch im Deckel des Rohres und legen das stumpfe Ende der Mikropipette durch das Loch in dem Deckel. Lassen Sie die DiI aufzusteigen bis das Filament für mindestens 5 min. (Always abdecken Loch im Deckel beim Einfüllen eines nicht-Mikropipette zur Verdampfung von Ethanol zu vermeiden).

Ausrüstung für Neuron Farbstoff Injektion (Abbildung 3) erforderlich.

Mikroskop. Eine feste Phase Mikroskop muss für Neuron Farbstoff Injektion verwendet werden, um eine vertikale Bewegung des Embryos während der Fokussierung zu vermeiden. Jede derartige Bewegung würde verdrängen die Pipette, nachdem es in Kontakt mit dem Embryo gekommen ist. Wir haben festgestellt, sowohl das Zeiss Axioskop FS und die Olympus AX50/BX50 feste Bühne Modellen zu gut für diesen Zweck geeignet. Das Mikroskop sollte mit Durchlicht DIC-Optik für die Visualisierung von neur ausgestattet werdenons vor der Färbung. Das Mikroskop sollte auch eine aufrechte anstatt einer invertierten Modells sein. Mikroskop mit einem aufrechten, ist die Spitze der Mikropipette an der gleichen Seite des Embryos als Betrachtungsrichtung Ziel, während bei einem inversen Mikroskop die beiden auf gegenüberliegenden Seiten des Embryos sind. Die letztere Anordnung beeinträchtigt die Qualität der DIC-Optik. Das Mikroskop sollte für Fluoreszenzmikroskopie eingestellt werden, mit einem geeigneten Filtersatzes für DiI Beobachtung. Da DiI einen vergleichsweise breites Spektrum mit Anregungs-und Emissionsmaxima bei 549 und 565 nm vielen Filter-Sets in diesem Bereich funktioniert, zB für Alexa 568, Cy3, Rhodamin, Texas Rot oder TRITC. Obwohl es praktisch, eine elektronisch gesteuerte Blende im Weg des Fluoreszenz Lichtquelle zu passen, um den Betrieb des Verschlusses ohne Handkontakt mit dem Mikroskop zu erlauben, auch effektiv auf einer Konfiguration, die nur mit einem manuellen Auslöser ausgestattet war beschriftet. Schließlich wird eine starke Vergrößerung, hohe numerische Blendeneinstellungre Wasser Immersionsobjektiv ist für die Beobachtung während der Injektion erforderlich. Dieses Ziel sollte für die Verwendung ohne Deckglas gestaltet werden. Wir haben erfolgreich die Zeiss Achroplan 100x/1.0W, Olympus LUMPlan FL 100x/1.0W und Olympus LUMPlan FL / IR 60x/0.9 W Ziele eingesetzt.

Ein Mikromanipulator ist erforderlich, um positionieren und die Mikropipette in Neuron Farbstoff Injektion. Wir haben sowohl das Leica Mikromanipulator und eine Bühne montiert Narashige 3-Achsen-hydraulische Mikromanipulator verwendet.

Ein intrazelluläres Gleichstromverstärker, mit der Einrichtung zur Strominjektion, wird zur iontophoretischen Injektion von DiI aus der Mikropipette erforderlich.

4. Verfahren für Dye Injection

  1. Den Objektträger mit dem montierten Embryo (s) auf der Stufe der Injektion Mikroskop (Abbildung 3). Verwenden Sie eine 10-fach Objektiv, um einen Embryo zu finden und bringen sie in die Mitte des Gesichtsfeldes.
  2. SwING die hohe Leistung Ziel in der Betrachtungsposition und bringen den Embryo in den Fokus. Suchen Sie die Zelle von Interesse unter DIC-Optik (oder mittels Fluoreszenz, wenn die Zielzelle exprimiert GFP) und bringen sie in die Mitte des Gesichtsfeldes. Sicherzustellen, dass die Feldblende des Mikroskops nur um den Rand des Sichtfelds geöffnet wird, nicht über. Ein schmaler Beleuchtungsstrahlengang wird helfen Positionierung der Mikropipette (siehe Schritt 4.4). Heben des Ziels, bis er so hoch wie möglich über dem Embryo ist zwar noch immer in Kontakt mit der Ringer / PBS-Lösung.
  3. Platzieren Sie die Badelektrode für die DC-Verstärker in das PBS auch frei von dem Embryo und dem Pfad der Mikropipette.
  4. Setzen der Injektion Mikropipette in die Halterung, die mit einer 0,1 M LiCl-Lösung gefüllt ist. Bringen Sie die Mikropipette Halter an der Mikromanipulator. Verwendung der Mikromanipulator grobe Steuerungen, bringen die Mikropipette in den Zwischenraum zwischen der Spitze des Objektivs und des Embryos.Sicherzustellen, dass er deutlich über dem Niveau des Embryos ist. Wegen der kurzen Arbeitsabstand von der hohen Leistung Ziel wird die Mikropipette müssen in einem flachen Winkel gehalten werden, um es in den Vordergrund zu bringen (siehe Abbildung 3). Sie müssen, um den entsprechenden Winkel durch Versuch und Irrtum in erster Linie zu etablieren. Wenn der Winkel zu steil ist, werden Sie nicht in der Lage, die Mikropipettenspitze in den Fokus zu bekommen. Ist sie zu flach ist, wird die Mikropipette Welle gegen die Wand des Damms Halten der Badelösung anstelle verschmutzen.
  5. Mitte die Spitze der Mikropipette in das Sichtfeld. Um dies zu erreichen, bringen Sie Ihre Augen auf die Ebene des Embryos und bewegen Sie die Mikropipette hin und her, in der Y-Achse des Mikroskops. Wenn die Spitze das Licht Weg kreuzt, sehen Sie die helle Reflexion der Lichtstrahlen von ihm. Bewegen der Spitze der Mikropipette vorwärts in der X-Achse, so dass sie den Lichtstrahl Überschwinger. Es wird leichter sein, um die Mikropipette in dem kleinen lokalisierenSichtfeld der hohen Leistung Ziel, wenn Sie sich für seine Welle statt dessen Spitze suchen. Jetzt durch das Mikroskop Okulare schauen und allmählich senken die hohe Leistung Ziel bis die Welle der Mikropipette rückt in den Fokus. Bewegen der Mikropipette hin und her in der Y-Achse mit den Mikromanipulator Steuerelemente hilft zu lokalisieren, wie es kommt allmählich in den Vordergrund. Wenn die Welle im Fokus ist, bewegen die Mikropipette in der X-Achse, bis seine Spitze befindet sich im Zentrum des Sichtfeldes. In diesem Stadium der Mikropipettenspitze sollte deutlich über dem Niveau des Embryos sein. Wechseln Sie Fluoreszenz-Beleuchtung und untersuchen die Spitze auf Dichtheit des DiI überprüfen. Stellen Sie den Gleichstrom in einen DiI Kristall bildet sich an der Spitze zu verhindern.
  6. Verwendung der Mikromanipulator Kontrollen senken die Mikropipette in der Z-Achse. Bring es zurück in den Fokus mit dem Mikroskop Fokussierung. Fortschreitend abzusenken der Mikropipette nach unten in Richtung des Embryos in dieser Weise. Zunächst können Sie dies mit dem groben tunZ-Achsen-Steuerung des Mikromanipulators und Mikroskop. Doch wie der Embryo rückt in den Fokus, sollten Sie den feinen Reglern wechseln.
  7. Wenn die Oberfläche des Embryos in den Fokus kommt, bewegt die Spitze der Mikropipette in Richtung der Kante des Sichtfeldes, in Richtung des Mikromanipulators. Konzentrieren auf die Zelle injiziert werden und sicherzustellen, dass er in der Mitte des Sichtfeldes liegt. Refokussieren der Mikropipettenspitze und ihn in der Y-Achse, bis sie auf der gleichen Ebene in der Y-Achse als der Zelle liegt. Bewegen der Spitze der Mikropipette in Richtung der Zelle in der X-Achse, wie Sie es abzusenken in der Z-Achse. Bei Verwendung eines Leica Mikromanipulator, werden Sie wahrscheinlich feststellen, dass die Mikroskoptisch Ihnen eine feinere Steuerung der Bewegung in der X-Achse als die Mikromanipulator steuert, so auf die Bühne Steuerschalter die Spitze nähert sich der Zelle steuert.
  8. Bringt die Mikropipettenspitze in Kontakt mit der Zelle und eine Vertiefung auf seiner Oberfläche. Passieren mehrere Nanoampere der depolarizing Strom für einige Sekunden. Sie sollten einen kleinen Kristall DiI bilden auf der Zelle. Um zu bestätigen, dass die Zelle markiert wurde, öffnen Sie kurz auf den Auslöser, um den Embryo mit fluoreszierendem Licht leuchtet, dann wechseln Sie zurück zu DIC. Wenn der Körper der Zelle von Interesse zeigt Anzeichen von Kennzeichnung, gelten Strom für mehrere Sekunden. Ausschalten des Stroms und schnell ziehen den Embryo entfernt von der Mikropipette in der X-Achse unter Verwendung der Mikroskoptisch Kontrolle. Dann ziehen Sie die Mikropipette aus der Lösung. Wenn kein DiI Kennzeichnung ist offensichtlich, kann die Mikropipette blockiert werden und der Ersatz mit einem frischen Mikropipette erfordern. Sie können feststellen, dass die Spitze der Mikropipette hat andere Gewebe auf dem Weg zur Zelle von Interesse snagged und das Gewebe wird anstatt der Zelle gefärbt. In diesem Fall versucht der Mikropipette Abziehen leicht und erneut nähert die Zelle. Es kann notwendig sein, um die Mikropipette ersetzt und erneut versuchen.
  1. Falls gewünscht, können mehrere Zellen individuell seinverbünden markierte in der gleichen Embryos.
  2. Entfernen meisten der Lösung in der Einspritzkammer, dann setze die Embryonen durch Zugabe von 7,4% Formaldehyd / PBS für 10 min mit 4 Waschungen mit PBS. Der Embryo wird dann bei Raumtemperatur für mindestens 4 Stunden (oder über Nacht bei 4 ° C) nach links in einem dunklen, feuchten Kammer (zur Vermeidung von Ausbleichen oder trocken fallen), damit die DiI in der gesamten neuronalen Prozesse diffundieren. In diesem Stadium können die DiI-markierten Zellen entweder lichtinduziert oder direkt im konfokalen Mikroskop betrachtet.

5. Photokonversion für die Prüfung mit DIC Optics

Das Prinzip ist der Fotowandlerelemente (photo-) Oxidation von DAB durch das fluoreszierende Licht durch die gefärbte Zelle während der Beleuchtung mit der geeigneten Wellenlänge emittiert. Dies bedeutet, hellen Zellen in kürzerer Zeit verglichen werden, um schwach gefärbten Zellen lichtinduziert. Wenn mehrere Zellen in einer Probe bezeichnet zu viel unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Helligkeit kann dies zu difficu führenlties in photoconverting alle von ihnen in der gleichen Qualität (siehe Abbildung 4C): In diesem Fall kann man haben, um auf einem Kompromiss zwischen Vernachlässigung der schwächeren Zellen (mit einem kurzen Beleuchtung) oder akzeptieren, dass die helleren Zellen zu schwellen beginnen (mit mehr Beleuchtung) entscheiden, . Wenn alle Zellen zu schwach markiert sind (also sehr lange brauchen Beleuchtung), kann durch endogene Peroxidasen Hintergrund verursacht ein Problem werden. Da DAB ist giftig sollte mit Vorsicht behandelt werden. Abfälle können "deaktiviert" werden mit 7% Chlorbleichlauge.

  1. Photokonversion muss für jeden Embryo einzeln vorgenommen werden. In Fällen, wo nur ein Embryo pro Folie gespritzt wird, wird die PBS-Lösung für den Embryo mit einem DAB-Lösung (3 mg DAB / ml Tris-Puffer), der Schieber an einem Fluoreszenzmikroskop und der gefüllten Zelle mit einem 100x Objektiv gesehen platziert ersetzt. (Unter Verwendung eines aufrechten Mikroskop die objektiven taucht in den DAB-Lösung und sollte gereinigt mehrmals mit Wasser werden nach dem Photokonversion pERFAHREN ist abgeschlossen, dies kann vermieden werden, wenn ein invertiertes Mikroskop verwendet werden). Ein Cy3-Filtersatz und einem 100W Hg-Lampe eingesetzt werden und die Zelle ausgesetzt den roten Anregungswellenlängen bis eine braune DAB Reaktionsprodukt zeigt sich in dem markierten Neuronen (ggf. periodisch durch Umschalten auf Hellfeldbeleuchtung). Die Zeit für die optimale DAB Färbung getroffen ist variabel, doch erfordert die Exposition gegenüber dem Anregungslicht jenseits der Stufe, wo die Fluoreszenz vollständig abgeklungen ist. Nach Photokonversion abgeschlossen ist, waschen die Vorbereitung mehrmals mit PBS. Ersetzen Sie die PBS mit einem Minus von 70% Glycerin, abkratzen das Silikon mit einem Skalpell, ersetzen mit einem Ring aus Vaseline und fügen Sie ein Deckglas.
  2. Wenn mehrere Embryonen auf der einen Schieber gefüllt wurden, übertragen jedes Embryo zu einem kleinen Tropfen PBS auf einem separaten 24 x 60 mm Deckglas mit der ventralen Seite des Embryos vor der Glas. Legen Sie einen Rahmen Klebeband um jedem Embryo eine gut zu schaffen und auf die Vorbereitung mit PBS. Halten Sie die Objektträger in einer feuchten Kammer vor Photokonversion um sie vor dem Austrocknen zu verhindern. Tauschen Sie die PBS für den Embryo mit DAB-Lösung. Sofort den Objektträger auf einem inversen Mikroskop mit einer 100W Hg-Lampe ausgestattet und mit einem Cy3-Filter gesetzt, um die DiI zu erregen, mit ax 50 Ziel. Nach Photokonversion, übertragen den Embryo zu einem frischen Folie in einem Rückgang von 70% Glycerin, fügen Sie ein Deckglas und Dichtung mit Nagellack.

6. Prüfung durch konfokale Mikroskopie

  1. Nach dem Schritt 4,10, Embryonen Transfer zu einem kleinen Tropfen PBS auf einem frischen 24 x 60 mm Deckglas. Wir eine optimale Optik durch Anbringen der abgeflachten Embryonen mit der dorsalen Seite zum Deckglas (wobei nur eine geringe Menge an PBS zwischen Deckglas und Embryo).
  2. Legen Sie einen Rahmen Klebeband um den Embryo und vergrößern Sie das PBS Drop, um den Rahmen zu füllen, wenn mit einer Folie abgedeckt. Legen Sie eine Folie vorsichtig auf und fixieren Sie sie mit Nagellack. Gefüllt Neuronen sollte Prüfung seinErhebungen auf konfokalen (oder Fluoreszenz) Mikroskop so schnell wie möglich.

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Representative Results

Abbildung 4 zeigt typische Ergebnisse der Technik beschreiben wir hier. 4A zeigt ein Beispiel für eine DiI gefüllt einzelnen Interneuronen, die sauber lichtinduziert wurde. Es schön zeigt die Menge der Details dieser Präparate Angebot. Wenn unter DIC Optik angesehen der räumliche Kontext der markierten Zelle innerhalb der nicht-markierten umgebende Gewebe sichtbar wird, z. B. die Position der Zelle innerhalb des Körpers Cortex und der Faser Vorsprung innerhalb des Neuropil.

4B ist ein Fall, in dem der Farbstoff Tropfen war ein wenig zu groß, was zu mehreren benachbarten Zellen zu markierten gleichzeitig. Dies macht es oft schwierig, einzelne Vorsprünge an unterschiedlichen Zellkörpern beziehen. Es zeigt auch, dass, wenn sie direkt unter dem Fluoreszenzmikroskop betrachtet (kein Photokonversion) Hintergrund Auflösung viel geringer ist.

Die Probe in 4C

4D zeigt, dass die Beobachtung durch konfokale Mikroskopie die Morphologie der markierten Zellen zeigt im Detail. DiI Markierung wurde in einem Stamm, der eine GFP-Reporter-Konstrukt durchgeführt durchgeführt. Dies kann wichtige Informationen über die räumliche Kontext (und Identität) des Farbstoffes gefüllte Zelle in bestimmten Populationen von neuronalen oder glial Zelltypen (wie von Genexpression definiert).

Als Paradigma der morphologischen Variabilität eines identifizierten Neuronen evaluieren wir haben eines der apterous positiven Neuronen 14 gewählt. Diese liegt in einem Neuron dorsalen und medialen Position nahe dem Neuropil (dAP, 5A, Lundgren et al., 1995) getrennt von den anderen apterous positiven Neuronen und ist daher leicht erkennbar apGal4-UASGFP Tieren. 5B zeigt eine Zelle dAP Das war mit DiI und photokonvertiertem gefüllt. Die Zellkörper liegt auf Höhe der vorderen Kommissur und zeigt ein Axon, wächst ersten Richtung der Mittellinie und dreht sich dann in einer medialen Region Binde anterior. Es hat Wachstumskegel wie Schwellungen an der Spitze und dem Wendepunkt. 19 Etiketten dieser Zelle, als maximale Projektionen aus Bildstapeln gezogen, sind in Abbildung 5C zusammengefasst. Zellmorphologie sichtbar wird sehr detailliert. Nur wenige Zellen zeigen Wachstumskegel wie Strukturen, sechs der 19 Zellen auch senden eine Niederlassung posterior, die immer kürzer als der vordere Ast und kann auch eine vorübergehende Funktion sein soll. In 5D alle 19 dAP Zellen markiert sind, wobei jede Zelle nur eine Opazität von 12% gestapelt. Dies führt in den Bereichen nicht dunkler, desto mehr Zellen teilen. Während die Zellkörper variiert mehrere Zelldurchmesser im Bereich der Mittellage, variiert die Position der mediolateralen Axons im Neuropil wesentlich kleiner - als die Breite Neuropil in neun Teile es befindet sich immer in einem der medialen zwei Positionen geteilt ist.

Abbildung 1
Abbildung 1. Schematischen Überblick über die Schritte des Neurons Markierungsverfahren und seinen zwei Varianten.

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Abbildung 2. Schematische Darstellung der verschiedenen Schritte bei der Vorbereitung Drosophila Embryonen zu Neuron Farbstoff Injektion nach Variante B. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Abbildung 3
Abbildung 3. . Schematische Darstellung der Einrichtung für Farbstoffinjektion Das obere rechte Einsatzes ist eine vergrößerte Ansicht der Anordnung der Probe, die Injektion Mikropipette und der Badelektrode A:. Mikromanipulator, B: Fixed Stufe Mikroskop. Der Mikromanipulator wird in einem flachen Winkel eingestellt - ca. 10 & de. g; C: Micropipette Halter mit Mikropipette, D: Specimen auf Folie, E: Bath Elektrode mit Plastilin, F fixiert: Anschluss an DC-Verstärker.

Abbildung 4
Abbildung 4. Beispiele DiI-markierten Interneuronen im ventralen Nervenstrang der Stufe 17 Embryonen. Dorsal Ansichten, ist anterior links. Mittellinie: gepunkteten Linien.

  1. Ein Beispiel für ein perfekt photokonvertiertem einzelnen Zelle, die eine prominente kontralateralen axonalen Vorsprung und ipsilateralen dendritischen Fasern (Pfeilspitze). DIC Optik.
  2. zeigt ein Präparat, in dem mehr als eine Zelle markiert wurde - das kann die eindeutige Zuordnung einer einzigen Zelle Körper seine Projektion zu verdunkeln.
  3. 8 Zellen wurden in 3 aufeinanderfolgende Abschnitte markiert worden. Zusätzlich ist in dieser Zubereitung die Fotowandlerelemente durch ein Standardprotokoll Antikörperfärbung gegen FAS2 als Landmarke gefolgt.
  4. zeigt eine einzelne DiI gefüllten Neuron mit der konfokalen Mikroskopie in einem Fly-Stamm, der ein GFP Reporter-Konstrukt dokumentiert.

Abbildung 5
Abbildung 5. Gezielte DiI Kennzeichnung (markiert durch GFP-Expression) zeigt den Bereich der morphologischen Variabilität eines identifizierten Neuron 14. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

  1. Der DAP-Zelle (künstlich gefärbt blau) eindeutig im apterous Gal4-UASGFP Muster in den Bauch (DAP, 5A, Lundgren et a anerkannt werdenl. 1995). GFP exprimierende Zellen wurden mit einem anti-GFP-Antikörper gefärbt. Die Mittellinie ist mit gestrichelten Linien markiert. ac = vordere Kommissur, pc = hinteren Kommissur.
  2. zeigt ein Beispiel eines photokonvertiertem DiI gefüllten dAP Zelle. Die Zelle wurde vor färben Ausfüllen eines apterous Gal4-UASGFP Embryo durch ihre Expression von GFP identifiziert.
  3. Eine Galerie mit 19 füllt dieser Zelle, als maximale Projektionen aus Bildstapeln gezogen. Dorsal Aussicht. Anterior ist oben. Das Neuropil ist in hellgrau ist der Cortex-Bereich in dunkleren Grau.
  4. Die 19 dAP Zellen, wobei jede Zelle mit einer Opazität von 12% gestapelt. Die Region von den meisten Zellen belegt hat die dunkelsten Grauton. Die Neuropil aller Proben (blau) zu einer ähnlichen Breite skaliert und die vorderen Kommissuren neben der Zelle ausgerichtet wurden, so dass sie überlappen. Während die Zellkörper variiert mehrere Zelldurchmesser um die zentrale Position zeigt die Stellung des mediolateralen Axons im Neuropilweniger Schwankungen.

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Discussion

Ein großer Vorteil von Drosophila als Modellsystem ist, dass sie eine Analyse der Entwicklung und Funktion auf der Ebene einzelner Zellen ermöglicht. Dies ist besonders hilfreich in Bezug auf das Nervensystem, wo die Vielfalt von Zelltypen ist außergewöhnlich hoch und die Funktion und Morphologie der benachbarten Zellen können ganz anders sein.

Das Verfahren wir hier ermöglicht die Etikettierung von einzelnen Neuronen mit einem Farbstoff, der entweder in eine dauerhafte Färbung oder direkt durch Fluoreszenzmikroskopie untersucht umgewandelt werden kann. Es zeigt die Morphologie der neuronalen Prozesse im Detail (Abbildung 4). Einer der wichtigsten Vorteile des Verfahrens ist, dass es die Morphologie von praktisch jeder Art von Neuronen können im ZNS untersucht werden (für die embryonalen Bauchmark, siehe Rickert et al, 2011;. Für die embryonalen Gehirn, siehe Kunz et al., 2012). Außerdem erfordert sie keine komplexe Kombinationen vongenetische Elemente vorhanden sein im Embryo, da mehrere der genetischen Kennzeichnung Techniken zu tun. Farbstoff Injektionen können in Zellen von Tieren, die Reporter-Konstrukte tragen durchgeführt werden, wodurch die einzelnen Zellmorphologien sein im Zusammenhang mit bestimmten Genexpressionsmuster (Figuren 4D und 5) in entweder Wildtyp-oder mutierte Hintergründen visualisiert. Wir haben auch die Technik verwendet, um die Dynamik der Axon Auswuchs in lebenden embryonalen Neuronen 11, 12 zu überwachen.

Das Verfahren kann ohne weiteres angepasst werden, um einzelne Neuronen in Embryonen von anderen Organismen, die den Embryo beschriften vorgesehen ist transparent genug, um unter DIC Beleuchtung geprüft. Wir haben es verwendet, um neuronale Morphologie in einer breiten Vielfalt von Arthropoden-Embryonen einschließlich Heuschrecken 18, Tausendfüßler 17, 19 und Krustentieren Silberfischchen 16 zu visualisieren.

Der große Nachteil des technischenque liegt in seiner technischen Schwierigkeit. Wir vertrauen darauf, dass die aktuelle ausführliche Darstellung des Verfahrens wird interessierten Forschern, sie zu beherrschen helfen.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der DFG GMT unterstützt

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
DAB Sigma-Aldrich D-5905 2-3 mg/ml in 100 mM TRIS-Hcl, pH 7.4
DiI Invitrogen/Molecular Probes D-282 1 mg/ml in ethanol
Formaldehyde Merck Millipore 7,4 % in PBS
Glycerol Roth 3783 70% in PBS
Heptane Glue Beiersdorf AG Cello 31-39-30 * dilute ca. 1 to 1 with n-Heptane
PBS 1x
TRIS Roth 4855
Vectashield Vector Laboratories H1000
EQUIPMENT
Confocal Microscope Leica TCS SP2 to view and document labelings in fluorescence
DC - amplifier Dragan Corporation Cornerstone ION-100 to perform the labelings
Coverslips Menzel BB018018A1 18 x 18 mm
Coverslips Menzel BB024060A1 24 x 60 mm
Dissecting Microscope Leica MZ8 to prepare and disect embryos
Flat Capillaries Hilgenberg outer diameter 1 mm; glas thickness 0.1 mm
Injection Capillaries Science Products GB 100 TF 8P
Micromanipulator R Leica to perform the labelings
Model P-97 Sutter Instruments to pull capillaries
Object Slides Marienfeld Superior 1000000
Scientific Microscope Zeiss Axioskop 2 mot to view labelings after photoconversion
Scientific Microscope Olympus BX50 to perform the labelings
Sony MC3255 Video Camera Sony/AVT Horn Sony MC3255 to record labelings after photoconversion

Table 1.

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References

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Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. L., Whitington, P., Technau, G. Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (73), e50150, doi:10.3791/50150 (2013).

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