Summary
אנו מציגים טכניקה לסימון תאי עצב בודדים במערכת העצבים המרכזית (CNS) של
Abstract
במאמר זה יתאר כיצד בנפרד לתייג תאי עצב במערכת העצבים המרכזיים העוברית של דרוזופילה melanogaster על ידי ההזרקה של juxtacellular DiI סמן lipophilic ניאון הממברנה. שיטה זו מאפשרת הדמיה של מורפולוגיה של תאים עצבית בפירוט רב. אפשר לתייג את כל תאים במערכת העצבים מרכזיים: גופי תא של הנוירונים היעד הם דמיינו תחת אופטיקה DIC או על ידי ביטוי של סמן גנטי ניאון כגון ה-GFP. לאחר תיוג, DiI יכול להפוך לחום קבוע כתם ידי photoconversion כדי לאפשר הדמיה של מורפולוגיה תא עם אור מועבר ואופטיקה DIC. לחלופין, את התאים שכותרת DiI-ניתן לצפות ישירות עם מיקרוסקופיה confocal, המאפשרים חלבוני כתב ניאון הציגו גנטי להיות colocalised. הטכניקה יכולה לשמש בכל בעל חיים, ללא קשר לגנוטיפ, כך שניתן לנתח פנוטיפים מוטציה ברזולוצית תא בודדה.
Introduction
ידע של מורפולוגיה עצבית ברמה של תאים בודדים הוא תנאי מפתח להבנת קישוריות עצבית ותפקוד מערכת עצבים מרכזיים. כך, החל מהימים הראשונים של מדעי המוח, החוקרים בקשו לפתח טכניקות תיוג תא בודדות (ראה 7 לטיפול הסטורי של בעיה זו). שיטות קלסיות כגון צביעת Golgi לספק רזולוציה מצוינת של מורפולוגיה עצבית אך אינן מתאימים אם אחד מבקש לתייג סוג מסוים של נוירון באופן מכוון, כמכתים מתרחשת באופן אקראי. הפיתוח של שיטות להכתמת תאים בודדים על ידי הזרקה תאית או juxtacellular של צבעים מmicroelectrode התייחס לדרישה של תיוג ספציפי.
היישום של זריקה אחת נוירון לצבוע כדי תסיסנית הציג אתגר גדול, בגלל גודלו הקטן של שניהם האורגניזם ותאי העצב שלה. עם זאת, כתמי נוירון בודדים של עוברית דרוזופילה 15 גודמן. בעוד השיטה הייתה בהחלט שימושית וספקה כמה תובנה חשובות על מנגנונים להתפתחות עצבית בדרוזופילה במשך 20-30 השנים האחרונות (לדוגמה, 2, 10), עובדים רבים נרתעו ממנו, בעיקר בגלל הדרישות הטכניות שלה.
הזמינה בשנים האחרונות יותר של טכניקות גנטיות לתיוג עצבי בדרוזופילה גם תרם לפופולריות של הזרקת צבע נוירון בודדה. ביטוי GAL4 ביים של מבני GFP קרום ממוקדים יכול לספק פתרון מצוין למורפולוגיה עצבית 1, 20. עם זאת, לשיטה זו יש מגבלות מסוימות: הביטוי לעתים קרובות בלתי הנמנע של ה-GFP בתאים מרובים יכול לטשטש את המבנה של תאי עצב בודד וקו נהג GAL4 לא יהיה זמין לנהוג ביטוי בתא עצב מסוים של ריבית. MARCM (ניתוח פסיפס עם ציטוטמרקר סלולרי ressible) שיטה 8 יכול לספק תיוג של מהות כל נוירון ברמת התא הבודדה, אך לא ניתן להשתמש בהצלחה בעובר והזחל מוקדם בגלל התחלופה האיטית של חלבון GAL80.
בהתחשב במגבלות אלה של תיוג גנטי, אנו מאמינים כי הזרקת צבע נוירון הבודדה בעובר דרוזופילה נשארת טכניקה חשובה וראויה ליישום רחב יותר. כדי לקדם מטרה זו, אנו מספקים כאן תיאור מפורט של השיטה. המחשת כוחה מסופקת על ידי החשבון האחרון שלנו על המורפולוגיה של הסט השלם של interneurons בneuromeres בטן של העובר מאוחר תסיסנית 14. מחקר זה, שחשף גם את השונות מורפולוגית של סוגי תאים עצביים בודדים ועקרונות של ארגון neuromere במערכת העצבים המרכזיים של העובר, לא היה אפשרי עם כל שיטת תיוג זמינה אחרת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
אנחנו השתמשנו בשתי גרסות שונות מעט של שיטת תיוג נוירון הבודדה במעבדות שלנו. ההבדלים מתייחסים לאוסף העובר, dechorionisation, devitellinisation וצעדי המגואלת בדם עובר. איור 1 נותן סקירה של השלבים הנפוצים והמתפצלים של הגרסות.
1. הכנת מייקרו מחטים לנתיחת עובר וmicropipettes להזרקה די
- מחטי זכוכית לנתיחת עובר שאובות מזכוכית נימים (בקוטר 1 מ"מ ועובי דופן 0.1 מ"מ) עם חולץ סאטר (מדע מכשירים) או ציוד דומה. לחלופין, חוט חדד אלקטרוליטים 0.15 מ"מ טונגסטן רכוב במחזיק מחט משמש לניתוחים. (הוראות לאלקטרוליטי חידוד ניתנות ב9).
- micropipettes הזרקת חומר צבע שאובה מזכוכית נימים דקות דופן עם חוטים פנימיים (מוצרי מדע; GB 100 TF 8P) עם חולץ סאטר (מדעמכשירים) או ציוד דומה. טיפ micropipette צריך להיות חד, עם להתחדד הדרגתי ואחיד של השוק כדי לסייע מעבר דרך הרקמות של העובר. Micropipette הרצוי הוא "microelectrode ההתנגדות הגבוהה, שארפ וארוך" מגוון, כמתואר בעמ '20 של מדריך סאטר Instrument פיפטה ספר הבישול (http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf). באופן כללי, micropipettes הם משכו זמן קצר לפני זריקות מבוצעות כדי להבטיח עצותיהם להישאר חדות ונקיות.
2. אוסף, הרכבה וDissection של עוברים
- אוסף עובר. יש לנו להשתמש בשיטת הזרקת נוירון הצלחה מתוארת כאן בעוברים משלבי מרס 12-17. עוברים בהדרגה לפתח ציפורן בשלב 17 והפכו קשה יותר ויותר לניתוחים. שתי גישות חלופיות זמינות להשגתםbryos בשלב התפתחות מסוים.
- אפשר זבובים להטיל ביצי לילה על צלחות מיץ אגרו תפוחים מצופות בממרח שמרים. כוון את הטמפרטורה של אוסף ביצה כדי שיתאים לזמן המתוכנן של זריקה ביום שלמחרת. לאסוף את כל הביצים ביום שלמחרת ובחר עוברים בשלב הרצוי באמצעות קריטריונים מורפולוגיים 3.
- לאפשר לזבובים שכבו על צלחות אגרו כאמור לעיל, אלא להחליף את הצלחת אגרה עם אחד טרי בכל 1.5 שעות ב 25 ° C. דגירה כל צלחת לתקופת זמן מוגדר, עד שהעוברים הגיעו לשלב ההתפתחותי הנדרשים.
- Dechorionation הכימי. השתמש במרית מתכת כדי לגרד את עוברי אגאר ולהעביר אותם לתוך כלי זכוכית (למשל צלחת פטרי או בלוק חלל) המכילים כ 10 המ"ל תסיסנית רינגר או פוספט שנאגר תמיסת מלח (PBS). הוסף כמה טיפין של אקונומיקה מרוכזת ולהתסיס במשך כמה דקות עלפלטפורמה סיבובית עד שהביצות הסיסיות את העוברים. שטוף את העוברים במספר שינויים של צלצול / PBS עד אין ריח של אקונומיקה שיורית. במהלך השוטף אלה, להבטיח שהעוברים לא באים במגע עם פני שטח הנוזליים. אחרת, הם יצופו והפכו קשים לצלול למניפולציה מאוחר יותר. לחלופין, dechorionation הכימי יכול להתבצע תוך שימוש בטכניקה שתוארה על ידי סל 4.
- dechorionation המכאני (ראה איור 2, על שלבי 1-4). עוברי העברה מהצלחת אגרה לשקופית מכוסית בסרט דביק דו צדדי. להימנע מהעברה אגרה עם העוברים כפי שיפריע להידבקותם לקלטת. אפשר עוברים להתייבש במשך 5 עד 10 דקות עד שסיסי מקבל מעט פריך. (בזמן המתנה, מעייל coverslip הדרוש לdevitellinisation מאוחר יותר עם דבק - ראה 2.3B בהמשך). לגעת זה בעובר בעדינות עם מחט. הסיסיים יתבקע והעובר יידבק לneedle. עוברים מייד לבלוק אגר כדי למנוע ייבוש וליישר על 10 מהם ברציפות, עם צדדי גחונם פונים כלפי מעלה.
Devitellinisation והמגואלת בדם נעשים באופן ידני באמצעות אחת משתי השיטות שתוארו ב2.3A ו2.3B.
- העברת עובר dechorionated יחיד של השלב ההתפתחותי המתאים מהצלחת של פתרון רינגר לכמה טיפין של רינגר בסכר סיליקון בשקופית מיקרוסקופ מוכנה מראש. (הפוך סכר ריבוע 3 סנטימטר על ידי מריחת שכבה דקה של סיליקון איטום בשקופית מיקרוסקופ, ואז להוסיף טיפה של 0.01% פתרון poly-L-ליזין למרכז הסכר. אפשר לרפא סיליקון ל24 שעות). להעביר את העובר עם כוס פסטר פיפטה, להבטיח כי העובר עדיין מתחת לפני השטח של הצלצול בעת ההעברה.
אל תתרגש הסוף האחורי של העובר עם זוג מלקחיים משובחים, ואילו בעדינות squeezing את העובר עם מספרי iridectomy עדינים, כרבע בדרך חזרה מהקצה הקדמי שלה. אל תחתכו ישר דרך את העובר. המטרה היא רק כדי לפצח את קרום vitelline תוך גרימת ניזק מינימאלי לעובר. עם המלקחיים עדיין בתנוחה, שימוש במחט טונגסטן כדי להקל את העובר מתוך קרום ופתח את עמדת צד גחון על השקופית. העובר צריך לדבוק במעייל פולי ליזין.
פילת העובר עם מחט טונגסטן חדד. עדינות לנקב, ולאחר מכן לקרוע את קיר הגוף לאורך קו האמצע הגבה. שימוש במחט, לדחוף למטה על קיר הגוף כך שהיא נדבקת לשקופית. כדי למנוע ניזק לקיר הגוף, לדחוף את קיר הגוף עם הבטן חוצצת בינו והמחט. לאחר מכן השתמשתי במחט לחדור דרך המעיים בקצוות הקדמיים ואחוריים שלו ולהרים אותו. אם ירצה, תוכל עוברים נוספים עשויים להיות מועברים לאותה השקופית, devitellinised ותוכנה נשלף, נזהרים שלא לפגוע בעוברים אחרים כברהשקופית. - מעייל 24 60 coverslip מ"מ עם heptane דבק (ראה טבלה 1) על ידי נחת טיפה קטנה של דבק במרכז השקופית ומפיץ אותו עם coverslip 18 x 18 מ"מ לסרט דק מאוד. הנח את coverslip בשקופית מיקרוסקופ ולהפוך את מסגרת של סרט דביק חד צדדי בקצותיו. לחתוך אגר עודף מהבלוק מחזיק השורה של 10 עוברים, למשש בעדינות את העוברים עם coverslip coverslip heptane הדבק. הם צריכים עכשיו לדבוק coverslip עם צדדי גחונם פונים מטה. הוסף כמות נדיבה של PBS כדי לכסות את העוברים (ראה איור 2, על שלבי 4-6).
לחדור את הממברנה vitelline עם זכוכית או מחט טונגסטן בצד הגב של כל עובר ליד הקצה האחורי שלה. לקרוע את הקרום לאורך קו אמצע הגב וגרור את העובר מחוץ לממברנה. אוריינט צד עובר הגחון למטה במקום אחר על פני מצע הדבק heptane ופילה אותו באותה השיטה שתוארה ב2.3A) (ראהאיור 2, על שלבי 7-8). מאז יהיו פרוסים מספר עוברים באותה השקופית, כדאי גם להיות מאוד מדויק עם האורינטציה שלהם או שציור של נטייתם על השקופית.
- העברת עובר dechorionated יחיד של השלב ההתפתחותי המתאים מהצלחת של פתרון רינגר לכמה טיפין של רינגר בסכר סיליקון בשקופית מיקרוסקופ מוכנה מראש. (הפוך סכר ריבוע 3 סנטימטר על ידי מריחת שכבה דקה של סיליקון איטום בשקופית מיקרוסקופ, ואז להוסיף טיפה של 0.01% פתרון poly-L-ליזין למרכז הסכר. אפשר לרפא סיליקון ל24 שעות). להעביר את העובר עם כוס פסטר פיפטה, להבטיח כי העובר עדיין מתחת לפני השטח של הצלצול בעת ההעברה.
- לאחר המגואלת בדם, עוברים עשויים להיות קבועים בקלילות במשך 10-15 דקות בפורמלין 7.4% ב PBS, ואחרי 4 כביסות בPBS. זהירות רבה יש להקפיד שלא להביא את העובר במגע עם פני השטח של הפתרון בתהליך זה, שכן כוחות מתח הפנים יהרסו את העובר. צעד זה מראש קיבעון הוא לא הכרחי, אבל הוא שימושי כדי למנוע התכווצות של שרירי דופן הגוף בעוברים בשלב מאוחר וכדי לעזור לייצב רקמות עובריות בשלבים צעירים. זכור כי קיבעון עושה את הרקמות של העובר יותר איכות תמונת פשרות אטומות וכל כך מעט תחת השגחת דסק"ש.
3. מילוי של micropipettes הזרקה
מחצית למלא צינור 0.5 מ"ל אפנדורף microfuge עם0.1% פתרון של carbocynanine לצבוע DiI (בדיקות מולקולריות, יוג'ין, OR) באתנול 100% (הקפד להשתמש EtOH 'יבש' מוחלט, כדי למנוע משקעי DiI). עושה חור צר במכסה של הצינור ולהכניס את הקצה הקהה של micropipette דרך החור במכסה. אפשר DiI לעלות את הנימה לפחות 5 דקות. (תמיד לכסות את החור במכסה כאשר אינו ממלא micropipette כדי למנוע אידוי של אתנול).
ציוד דרוש לנוירון צבע הזרקה (איור 3).
מיקרוסקופ. מיקרוסקופ במה קבועה יש להשתמש להזרקת צבע נוירון כדי להימנע מתנועה אנכית של העובר בהתמקדות. כל תנועה כזו לעקור פיפטה לאחר שהוא בא במגע עם העובר. מצאנו גם Zeiss Axioskop FS וAX50/BX50 מודלי במה הקבועה אולימפוס להיות מותאמים היטב למטרה זו. מיקרוסקופ צריך להיות מצויד באופטיקה DIC אור המועבר להדמיה של neurתוספות לפני הצביעה. מיקרוסקופ צריך גם להיות זקוף ולא מודל הפוך. עם מיקרוסקופ זקוף, קצה micropipette הוא באותו הצד של העובר כמטרת צפייה, ואילו עם מיקרוסקופ הפוך שניים בצדדים מנוגדים של העובר. ההסדר זה האחרון פוגע באיכות האופטיקה DIC. מיקרוסקופ יש להגדיר למיקרוסקופ פלואורסצנטי, עם סט מסנן מתאים לתצפית DiI. מאז DiI יש ספקטרום רחב comparably עם עירור ופליטה היא מקסימום 549 וב565 ננומטר רב קובע מסנן בטווח זה עובד, למשל אלה לAlexa 568, Cy3, rhodamine, טקסס האדומה או TRITC. למרות שזה נוח שיתאים לתריס אלקטרוני מבוקר בדרכו של מקור האור פלואורסצנטי, כדי לאפשר הפעלה של התריס ללא מגע יד עם מיקרוסקופ, גם כיניתי את היעילות על התקנה אשר הייתה מצויד רק בתריס ידני. לבסוף, הגדלה גבוהה, גבוה המספרי apertuמטרת טבילה במים מחדש נדרשת להשגחה במהלך זריקה. מטרה זו צריכה להיות מתוכננת לשימוש ללא coverslip. אנחנו השתמשנו בהצלחה Zeiss Achroplan 100x/1.0W, אולימפוס LUMPlan פלורידה 100x/1.0W, ואולימפוס LUMPlan 60x/0.9 יעדי FL / IR W.
Micromanipulator נדרש למקם ולהזיז את micropipette במהלך הזרקת צבע תא עצב. יש לנו להשתמש גם micromanipulator היקה וmicromanipulator שלב רכוב Narashige 3-ציר הידראולי.
מגבר תאי בירה, עם המתקן להזרקה נוכחית, הוא נדרש הזרקת iontophoretic של DiI מmicropipette.
4. הליך להזרקה די
- הנח את השקופית עם עובר רוכבים (ות) על הבמה של מיקרוסקופ ההזרקה (איור 3). השתמש אובייקטיבי 10x לאתר עובר ולהביא אותו למרכז שדה הראייה.
- Swing אובייקטיבי ההספק הגבוה לעמדת הצפייה ולהביא את העובר אל מוקד. אתר את התא של ריבית מתחת אופטיקה DIC (או באמצעות פלואורסצנטי אם תא המטרה מבטא GFP) ולהביא אותו למרכז שדה הראייה. ודא שסרעפת תחום מיקרוסקופ נפתחה רק לקצה שדה הראייה, ולא מעבר לכך. אלומת תאורה צרה תסייע מיצוב של micropipette (ראה שלב 4.4 להלן). הרם את המטרה עד שהוא גבוה ככל האפשר מעל העובר ובכל זאת להישאר בקשר עם פתרון רינגר / PBS.
- הנח את האלקטרודה האמבטיה למגבר DC לתוך PBS גם הברור של העובר, ואת דרכו של micropipette.
- הכנס micropipette ההזרקה למחזיק בו, שכבר מלא בפתרון 0.1 מ 'LiCl. צרף בעל micropipette לmicromanipulator. באמצעות פקדי micromanipulator הגסים, להביא micropipette לתוך החלל שבין הקצה האובייקטיבי והעובר.ודא שזה הרבה מעל הרמה של העובר. בגלל מרחק עבודה הקצר האובייקטיבי ההספק הגבוה, micropipette יצטרך להיות מוחזק בזווית שטוחה, כדי להביא אותו למוקד (ראה איור 3). יהיה לך להקים את הזווית המתאימה על ידי ניסוי וטעייה בערכאה הראשונה. אם הזווית היא תלולה מדי, אתה לא תוכל לקבל את עצת micropipette אל מוקד. אם זה רדוד מדי, פיר micropipette יהיה עבירה על הקיר של הסכר מחזיק פתרון הרחצה במקום.
- מרכז קצה micropipette בשדה הראייה. כדי להשיג זאת, תביא את העיניים שלך לרמה של העובר ולהזיז את micropipette קדימה ואחורה בציר ה-Y של במת מיקרוסקופ. כאשר קצו חוצה את נתיב האור, אתה תראה את ההשתקפות הבהירה של קרן האור ממנו. העבר את קצה micropipette קדימה בציר ה-X כך שהוא overshoots קרן האור. זה יהיה קל יותר לאתר את micropipette בקטןשדה ראייה של מטרת ההספק הגבוהה אם אתה מחפש הפיר ולא קצו. עכשיו להסתכל דרך עינית מיקרוסקופ ובהדרגה להפחית את מטרת המתח הגבוהה עד הפיר של micropipette מתחדד. הזזת micropipette הלוך ושוב בציר ה-Y עם פקדי micromanipulator מסייעת לאתר אותו, כפי שהוא בא בהדרגה למוקד. כאשר המוט הוא במיקוד, להעביר micropipette בציר ה-X עד שקצו נמצא במרכז שדה הראייה. בשלב זה קצה micropipette צריך להיות הרבה מעל הרמה של העובר. לעבור לתאורת פלואורסצנטי ולבחון את הקצה כדי לבדוק לדליפה של DiI. כוון את הזרם ישר כדי למנוע כל גביש DiI מ טביעה בקצה.
- באמצעות פקדי micromanipulator, להנמיך micropipette בציר ה-Z. להחזיר אותו אל מוקד עם מוקד שליטת מיקרוסקופ. בהדרגה להוריד את micropipette מטה לכיוון העובר בדרך זו. בתחילה, אתה יכול לעשות את זה עם גספקדי Z-ציר micromanipulator ומיקרוסקופ. עם זאת, בשלב העוברי מתחדד אתה צריך לעבור לכפתורי הבקרה הטוב.
- כאשר פני השטח של העובר מתחדדים, הזז את קצה micropipette לקצה שדה הראייה, בכיוון של micromanipulator. פוקוס על התא להיות מוזרקים ובדוק שהוא עומד במרכזו של שדה הראייה. להתרכז על קצה micropipette ולהעביר אותו בציר ה-Y עד שהיא נמצאת באותה הרמה בציר ה-Y כתא. העבר את קצה micropipette כיוון התא בציר ה-X כמו שאתה מוריד אותו בציר ה-Z. אם אתם משתמשים בmicromanipulator יקה, סביר להניח שתגלו ששלב מיקרוסקופ שולט לך שליטה מדויקת יותר של תנועה בציר ה-X מפקדי micromanipulator, אז לעבור לשליטת הבמה כקצה מתקרב קרוב לתא.
- הבא את קצה micropipette במגע עם התאים וליצור גומה על פני השטח שלו. לעבור כמה nanoamps של depolariziנוכחי ננוגרם לכמה שניות. אתה צריך לראות את גביש קטן של DiI להרכיב על התא. כדי לוודא שהתאים סומנו בתווית, בקצרה לפתוח את התריס כדי להאיר את העובר באור ניאון, לאחר מכן לחזור לדסק"ש. אם הגוף של התא של עניין מראה סימנים של תיוג, להחיל נוכחי עוד כמה שניות. ניתק את הזרם ולמשוך במהירות את העובר מmicropipette בציר ה-X באמצעות שלט במת מיקרוסקופ. ואז למשוך את micropipette מהפתרון. אם לא תיוג DiI ניכר, micropipette עלול להיחסם וידרוש החלפה עם micropipette טרי. אתה עשוי לגלות כי קצה micropipette כבר תפס רקמות אחרות בדרך לתא של עניין ורקמה זו מוכתמת ולא התא. במקרה זה, נסה נסיגת micropipette מעט, ולהתקרב מחדש לתא. ייתכן שיהיה צורך להחליף את micropipette ונסה שוב.
- אם ירצה, מספר תאים יכולים להיות individuהברית מתויגת באותו העובר.
- להסיר את רוב הפתרון בתא ההזרקה, לאחר מכן לתקן את העוברים על ידי הוספת פורמלדהיד 7.4% / PBS למשך 10 דקות ואחרי 4 שטיפות עם PBS. אז העוברים מוטל בטמפרטורת חדר במשך לפחות 4 שעות (או הלילה ב 4 ° C) באולם חשוך ולח (כדי למנוע הלבנה או נפילה יבשה) כדי לאפשר DiI לפזר לאורך כל תהליכים עצביים. בשלב זה, את כותרת DiI-תאי ניתן photoconverted או לצפות ישירות בconfocal מיקרוסקופ.
5. Photoconversion לבחינת השימוש אופטיקה DIC
עיקרון photoconversion הוא החמצון (צילום-) של DAB ידי אור הניאון הנפלט על ידי התא המוכתם בתאורה עם אורך הגל המתאים. משמעות הדבר הוא תאים בהירים הנם photoconverted בזמן קצר יותר בהשוואה לתאים חלשים מוכתמים. אם מספר תאים שכותרתו בדגימה 1 שונה יותר מדי לגבי הבהירות שלהם זה יכול להוביל לdifficulties בphotoconverting כולם באותה איכות (ראה איור 4 ג): במקרה זה ייתכן שיצטרך להחליט על פשרה בין מזניח את התאים החלשים יותר (באמצעות תאורה קצרה) או לקבל את העובדה שהתאים הבהירים מתחילים להתנפח (באמצעות תאורה ארוכה יותר) . אם כל התאים מסומנים מדי חלש (ולכן צורך הרבה זמן תאורה), רקע שנגרם על ידי peroxidases אנדוגניים יכול להפוך לבעיה. מאז DAB הוא רעיל זה צריך להיות מטופל בזהירות. פסולת יכולה להיות 'מבוטלת' עם כלור 7% לבנים.
- Photoconversion חייב להתבצע לכל עובר באופן אינדיבידואלי. במקרים שבו רק עובר אחד מוזרק לשקופית, פתרון PBS מכסה את העובר מוחלף בפתרון DAB (3 מ"ג DAB / מ"ל טריס חיץ), השקופיות מונחות על מיקרוסקופ פלואורסצנטי ותא המלא נצפה במטרת 100x. (באמצעות מיקרוסקופ זקוף הירידות האובייקטיביות לפתרון DAB ויש לנקות מספר פעמים עם מים לאחר photoconversion עמrocedure נגמר, זה יכול להימנע אם מיקרוסקופ הפוך משמש). סט Cy3 מסנן ומנורה כספית 100W משמשים והתא החשוף לאורכי גל העירור האדומים עד מוצר תגובת DAB חום ניכר בנוירון שכותרתו (לבדוק מעת לעת על ידי מעבר לתחום תאורה בהירה). הזמן שלוקח להכתמת DAB אופטימלית הוא משתנה, אך דורש חשיפה לאור העירור מעבר לשלב שבו פלואורסצנטי נמוג. לאחר photoconversion הושלם, לשטוף ההכנה מספר פעמים עם PBS. החלף את PBS עם ירידה של 70% גליצרול, גרד את הסיליקון עם להב אזמל, להחליף עם טבעת של וזלין ולהוסיף coverslip.
- כאשר עוברים מרובים מולאו בשקופית האחת, להעביר את כל עובר לירידה קטנה של PBS על coverslip נפרד 24 x 60 מ"מ עם צד הגחון של העובר מול הזכוכית. הנח מסגרת של סרט דבק סביב כל עובר כדי ליצור טוב ולכסות את ההכנה עם PBS. שמור את השקופיות בתא לח לפני photoconversion כדי למנוע מהם להתייבש. בורסת PBS מכסה את העובר עם פתרון DAB. מייד למקם את השקופית על מיקרוסקופ הפוך מצויד במנורה כספית 100W ולהשתמש Cy3 מסנן להגדיר לרגש DiI, באמצעות 50 אובייקטיביים גרזן. לאחר photoconversion, להעביר את העובר לשקופית טריה בירידה של 70% גליצרול, להוסיף coverslip וחותם עם לק.
6. בדיקה על ידי מיקרוסקופיה confocal
- לאחר השלב 4.10, עוברי העברה לירידה קטנה של PBS על coverslip טרי 24 x 60 מ"מ. אנו משיגים אופטיקה האופטימלית על ידי הרכבת העוברים המשוטחים בצד הגבה לקראת coverslip (משאיר רק כמות קטנה של PBS בין coverslip והעובר).
- הנח מסגרת של סרט דבק סביב העובר ולהגדיל טיפת PBS כדי למלא את המסגרת כשמכוסית בשקופית. הנח אותו בזהירות על מגלשה ולתקן אותה עם ציפורניים. הנוירונים מלאים צריכים להיות בחינהלעצמה על confocal מיקרוסקופ (או פלואורסצנטי) בהקדם האפשרי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 4 ממחיש תוצאות טיפוסיות של הטכניקה, שאנו מתארים כאן. האיור 4A מראה דוגמה של interneuron אחת DiI מלא שphotoconverted נקי. זה יפה ממחיש את כמות הפרטים אלה הצעת הכנות. כאשר מתחת אופטיקה DIC ההקשר המרחבי של התא המסומן בתוך הרקמה הסובבת הלא מתויגת-הופך לגלוי, למשל עמדתו של גוף התא בקליפת המוח ושל השלכת הסיבים בתוך neuropile.
האיור 4B הוא מקרה שבו טיפת הצבע הייתה קצת גדולה מדי וכתוצאה ממספר תאי שכנים הופך כותרתו בו זמנית. זה בדרך כלל עושה את זה קשה להתייחס לתחזיות בודדות גופי תא נפרדים. הוא גם מראה שכאשר צופה ישירות מתחת למיקרוסקופ פלואורסצנטי (לא photoconversion) רזולוצית רקע היא הרבה יותר נמוכה.
דגימת 4C באיור
האיור 4D מראה כי תצפית על ידי מיקרוסקופיה confocal חושפת את המורפולוגיה של תאים שכותרתו בפירוט. DiI התיוג בוצע בזן שבוצע מבנה כתב ה-GFP. זה עשוי לספק מידע חשוב על ההקשר המרחבי (וזהות) של תא מלא הצבע בתוך אוכלוסיות ספציפיות של תאי עצב או GLסוגי התאים ial (כפי שהוגדר בביטוי גנים).
כפרדיגמה להעריך שונות המורפולוגית של נוירון זיהה שבחרנו אחד מהנוירונים Apterous החיוביים 14. נוירון זו נעוץ בגב וקרוב המדיאלי עמדת neuropile (DAP, 5A איור, ונדגרן et al., 1995) נפרד מהנוירונים החיוביים Apterous האחרים ולכן קל לזיהוי בחי apGal4-UASGFP. 5B האיור מראה תא DAP שהיה מלא בDiI וphotoconverted. גוף התא נמצא ברמה של השליך י הקדמי ומראה האקסון שגדל ראשון לקראת קו האמצע ולאחר מכן פונה קדמי באזור חיבור המדיאלי. יש חרוט צמיחה כמו נפיחויות בקצה ונקודת המפנה. 19 תוויות של תא זה, נמשך כהשלכות מרביות מארובות תמונה, מסוכמות באיור 5 ג. המורפולוגיה של תאים הופכת לגלויה לפירוט רב. רק כמה תאי חרוט להראות צמיחה כמו מבנים: שישה של 19 תאים גם לשלוח אחורי סניף שהוא תמיד קצר יותר מהענף הקדמי ויכול בהחלט להיות תכונה חולפת. באיור 5D כל 19 תאי DAP כותרת נערמים בכל תא שיש רק אטימות של 12%. זה תוצאות באזורים כהים יותר ככל שיותר תאים לשתף אותם. בעוד גוף התא משתנה קוטר יותר מתא אחד סביב עמדת המרכז, עמדת mediolateral של האקסון בתוך neuropile משתנית הרבה פחות - כאשר רוחב neuropile מחולק לתשעה חלקיו הוא שוכן תמיד באחת משתי העמדות המדיאלי.
איור 1. סקירה סכמטי של שיטת התיוג של נוירון ושתי גרסותיה.
"Fo: תוכן רוחב =" 4in "fo: src =" / files/ftp_upload/50150/50150fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50150/50150fig2.jpg "/>
איור 2. דיאגרמה המתאר את השלבים השונים בהכנת עוברי תסיסנית להזרקת צבע נוירון, על פי גרסה ב 'לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 3. . ייצוג סכמטי של ההתקנה להזרקת צבע להוסיף הימני העליון הוא נוף מוגדל של ההסדר של דגימה, micropipette ההזרקה והאלקטרודה האמבטיה:. Micromanipulator, B: מיקרוסקופ במה הקבוע. Micromanipulator מוגדר בזווית שטוחה - כ 10 & דה. גרם; C: בעל micropipette עם micropipette, D: דגימה בשקופית, E: אלקטרודה חמאם הקבוע בפלסטלינה, F: חיבור למגבר DC.
איור 4. דוגמאות לinterneurons DiI כותרת-בחוט עצב הגחון של שלב 17 עוברים. נופים הגבו, קדמי הוא לשמאל. קו אמצע: קווים מקווקווים.
- דוגמה לתא בודד לחלוטין photoconverted, מראה תחזית בולטת נגדית אקסונלית וסיבים הדנדריטים ipsilateral (ראש החץ). אופטיקה DIC.
- מראה הכנה בי יותר מתא אחד שכותרתו - זה יכול לטשטש את ההקצאה הברורה של גוף תא בודד להקרנתו.
- 8 תאים סומנו בתווית ב3 קטעים רצופים. בנוסף, בהכנה הזאת photoconversion בעקבות צביעה סטנדרטית נוגדן נגד Fas2 כנקודת ציון.
- מראה נוירון בודד DiI מלא מתועדים עם מיקרוסקופיה confocal בזן זבוב נושא כתב GFP לבנות.
איור 5. ממוקד DiI תיוג (מסומן על ידי ביטוי של GFP) מגלה מגוון של השתנות המורפולוגית של נוירון 14 זיהה. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
- תא DAP (כחול באופן מלאכותי בצבע) ניתן להכיר באופן חד משמעי בתוך דפוס Gal4-UASGFP apterous בבטן (DAP, 5A איור, ונדגרן etl. 1995). תאים להביע GFP היו מוכתמים בנוגדן אנטי-GFP. קו האמצע מסומן בקווים מקווקווים. ac = הקדמי commissure, המחשב = commissure האחורי.
- מראה דוגמה של תא DAP DiI מלא photoconverted. התא זוהה לפני לצבוע את המילוי בעובר apterous Gal4-UASGFP ידי ביטויו של ה-GFP.
- גלריה של 19 ממלאת של תא זה, נמשך כהשלכות מרביות מארובות תמונה. נופים הגבו. הקדמי הוא למעלה. Neuropile הוא בצבע אפור בהיר, באזור קליפת המוח הוא בצבע אפור כהה.
- את 19 תאי DAP נערמים בכל תא שיש אטימות של 12%. האזור נכבש על ידי רוב התאים יש את הגוון הכהה ביותר של אפור. Neuropile של כל הדגימות (כחול) נחשף לרוחב דומה וcommissures הקדמי ליד התא היה מיושר אז הם חופפים. בעוד גוף התא משתנה קוטר יותר מתא אחד סביב המיקום המרכזי, עמדת mediolateral של האקסון בתוך neuropile תערוכותוריאציה פחות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אחד יתרונות עיקריים של דרוזופילה כמודל למערכת הוא שהיא מאפשרת ניתוח של התפתחות ותפקוד ברמה של תאים בודדים. זה שימושי במיוחד לגבי מערכת עצבים, שם המגוון של סוגי תאים הוא גבוה במיוחד והתפקוד והמורפולוגיה של תאי שכנים יכולים להיות שונים לחלוטין.
השיטה שאנו מציגים כאן מאפשרת תיוג של נוירונים בודדים עם צבע שגם יכול להפוך לכתם קבוע, או נבחן ישירות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הוא מגלה את המורפולוגיה של תהליכים עצביים בפירוט רב (איור 4). אחד היתרונות העיקריים של השיטה היא שהיא מאפשרת את המורפולוגיה של כמעט כל סוג של תא עצב במערכת עצבים מרכזיות שיש לבחון (לצינור העצבים העוברי הגחון, ראה Rickert et al, 2011;. למוח העוברי, ראה קונץ et אל., 2012). בנוסף, היא אינה דורשת שילובים מורכבים שלאלמנטים גנטיים להיות קיימים בעובר, כפי שכמה מטכניקות התיוג הגנטיות לעשות. זריקות Dye עשויות להתבצע בתאים של בעלי חיים שנושאים מבנים של כתב, ובכך מאפשרות מורפולוגיה תא בודדות להיות דמיינו בהקשר של דפוסי ביטוי גן מסוימים (האיורים 4D ו 5) בכל אחד מסוגים פרועים או רקע מוטציה. אנחנו גם השתמשנו בטכניקה כדי לנטר את הדינמיקה של תולדת האקסון בחי 11 נוירונים עובריים, 12.
השיטה יכולה להיות מותאמת בקלות לתייג נוירונים בודדים בעוברים של אורגניזמים אחרים, ובלבד העובר הוא שקוף מספיק כדי להיבחן תחת תאורת דסק"ש. אנחנו השתמשנו בו כדי להמחיש מורפולוגיה עצבית במגוון רחב של עוברי חרקים, כוללים חגבים 18, 17, 19 מרבי רגלי סרטנים ודג כסף 16.
החסרון העיקרי של technique טמון בקושי הטכני שלה. אנו בטוחים שהתיאור המפורט של השיטה הנוכחי יסייע לחוקרים המעוניינים בשליטתו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מDFG לGMT
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DAB |  Sigma-Aldrich |
D-5905 | 2-3 mg/ml in 100 mM TRIS-Hcl, pH 7.4 |
| DiI | Invitrogen/Molecular Probes |
D-282 | 1 mg/ml in ethanol |
| Formaldehyde | Merck Millipore | 7,4 % in PBS | |
| Glycerol | Roth |
3783 | 70% in PBS |
| Heptane Glue | Beiersdorf AG | Cello 31-39-30 * | dilute ca. 1 to 1 with n-Heptane |
| PBS | 1x | ||
| TRIS | Roth |
4855 | |
| Vectashield | Vector Laboratories |
H1000 | |
| EQUIPMENT | |||
| Confocal Microscope | Leica | TCS SP2 | to view and document labelings in fluorescence |
| DC - amplifier | Dragan Corporation | Cornerstone ION-100 | to perform the labelings |
| Coverslips | Menzel |
BB018018A1 | 18 x 18 mm |
| Coverslips | Menzel |
BB024060A1 | 24 x 60 mm |
| Dissecting Microscope | Leica | MZ8 | to prepare and disect embryos |
| Flat Capillaries | Hilgenberg |
outer diameter 1 mm; glas thickness 0.1 mm | |
| Injection Capillaries | Science Products | GB 100 TF 8P | |
| Micromanipulator R | Leica | to perform the labelings | |
| Model P-97 | Sutter Instruments | to pull capillaries | |
| Object Slides | Marienfeld Superior |
1000000 | |
| Scientific Microscope | Zeiss | Axioskop 2 mot | to view labelings after photoconversion |
| Scientific Microscope | Olympus | BX50 | to perform the labelings |
| Sony MC3255 Video Camera | Sony/AVT Horn | Sony MC3255 | to record labelings after photoconversion |
Table 1. |
|||
References
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Broadie, K., Sink, H., Van Vactor, D., Fambrough, D., Whitington, P. M., Bate, M., Goodman, C. S. From growth cone to synapse: the life history of the RP3 motor neuron. Dev. Suppl. , 227-238 (1993).
- Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , Springer. Berlin. (1985).
- Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures. J. Vis. Exp. (27), e1347 (2009).
- Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule. Cell. 67, 45-57 (1991).
- Kunz, T., Kraft, K. F., Technau, G. M., Urbach, R. Origin of Drosophila mushroom body neuroblasts and generation of divergent embryonic lineages. Development. 139, 2510-2522 (2012).
- Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Levick, W. R. Another tungsten microelectrode. Med. Biol. Eng. 10, 510-515 (1972).
- Matthes, D. J., Sink, H., Kolodkin, A. L., Goodman, C. S. Semaphorin II can function as a selective inhibitor of specific synaptic arborizations. Cell. 81, 631-639 (1995).
- Murray, M. J., Whitington, P. M. Effects of roundabout on growth cone dynamics, filopodial length, and growth cone morphology at the midline and throughout the neuropile. Journal of Neuroscience. 19, 7901-7912 (1999).
- Murray, M. J., Merritt, D. J., Brand, A. H., Whitington, P. M. In vivo dynamics of axon pathfinding in the Drosophilia CNS: a time-lapse study of an identified motorneuron. J. Neurobiol. 37, 607-621 (1998).
- Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).
- Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -L., Whitington, P. M., Technau, G. M. Morphological characterization of the entire interneuron population reveals principles of neuromere organization in the ventral nerve cord of Drosophila. Journal of Neuroscience. 31, 15870-15883 (2011).
- Thomas, J. B., Bastiani, M. J., Bate, M., Goodman, C. S. From grasshopper to Drosophila: a common plan for neuronal development. Nature. 310, 203-207 (1984).
- Whitington, P., Harris, K. Early axonogenesis in the embryo of a primitive insect, the silverfish Ctenolepisma longicaudata. Development Genes and Evolution. 205 (5-6), 272-281 (1996).
- Whitington, P., Meier, T. Segmentation, neurogenesis and formation of early axonal pathways in the centipede, Ethmostigmus rubripes (Brandt). Development Genes and Evolution. 199, 349-363 (1991).
- Whitington, P. M., Seifert, E. Axon growth from limb motorneurons in the locust embryo: the effect of target limb removal on the pattern of axon branching in the periphery. Developmental Biology. 106, 438-449 (1984).
- Whitington, P. M., Leach, D., Sandeman, R. Evolutionary change in neural development within the arthropods: axonogenesis in the embryos of two crustaceans. Development. 118, 449-461 (1993).
- Williams, D. W., Tyrer, M., Shepherd, D. Tau and tau reporters disrupt central projections of sensory neurons in Drosophila. J. Comp. Neurol. 428, 630-640 (2000).
