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Biology

अलगाव और संस्कृति नवजात माउस cardiomyocytes की

Published: September 6, 2013 doi: 10.3791/50154
Automatic Translation
1, 2, 2
1Randall and Cardiovascular Divisions, King’s College London, 2Division of Cardiology, School of Medicine, University of California San Diego

Summary

प्राथमिक माउस cardiomyocyte संस्कृतियों myofibrillar संगठन और समारोह की जांच के लिए निर्णायक उपकरणों में से एक हैं. निम्नलिखित प्रोटोकॉल नवजात माउस दिल से प्राथमिक cardiomyocytes के अलगाव और संस्कृति का वर्णन करता है. परिणामस्वरूप cardiomyocyte संस्कृतियों बाद में biomechanical, जैव रासायनिक और सेल जैविक assays की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Abstract

संवर्धित नवजात cardiomyocytes लंबे myofibrillogenesis और myofibrillar कार्यों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. संवर्धित cardiomyocytes आसान जांच और हेरफेर जैव रासायनिक रास्ते की, और अनायास cardiomyocytes पिटाई के biomechanical संपत्तियों पर उनके प्रभाव के लिए अनुमति देते हैं.

निम्नलिखित 2 दिन प्रोटोकॉल नवजात माउस cardiomyocytes के अलगाव और संस्कृति का वर्णन करता है. हम आसानी से, नवजात शिशुओं से दिल टुकड़े करना हृदय के ऊतकों को अलग कर देना और हृदय सेल आबादी से cardiomyocytes को समृद्ध करने के लिए दिखा. हम सेल हदबंदी के लिए अलग एंजाइम घोला जा सकता है के उपयोग, और सेल व्यवहार्यता पर उनके प्रभाव पर चर्चा की. पृथक cardiomyocytes बाद में रूपात्मक, electrophysiological, जैव रासायनिक, सेल जैविक या biomechanical assays के एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम केवल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध समाधान का उपयोग करके, मजबूती और reproducibility के लिए प्रोटोकॉल अनुकूलित और एंजाइम घोला जा सकता है कि शओउ थोड़ा बहुत से बहुत परिवर्तनशीलता. हम भी cardiomyocytes के अलगाव और संस्कृति के साथ जुड़े आम समस्याओं से निपटने, और अलगाव और संस्कृति शर्तों के अनुकूलन के लिए विकल्प की एक किस्म की पेशकश करते हैं.

Introduction

कृंतक हृदय कोशिकाओं की सफल हदबंदी और संस्कृति के लिए जल्द से जल्द रिपोर्ट वापस 1960 के 1,2 करने के लिए तारीखें. फिर भी, Harary और फ़ार्ले सुसंस्कृत cardiomyocytes "आवधिक सिकुड़ना की आवश्यकताओं के अध्ययन के लिए एक अनूठी प्रणाली प्रदान कर सकता है [, और हो सकता है] [पिटाई] प्रक्रिया के लिए विभिन्न चयापचय मार्ग के योगदान का निर्धारण करने का एक साधन प्रदान" देखा. युवा चूहों, और मूल प्रोटोकॉल से Harary और फ़ार्ले पृथक और सुसंस्कृत cardiomyocytes वर्षों में रूपांतरित किया और कई वैज्ञानिकों द्वारा संशोधित किया गया है, सामान्य अलगाव और संवर्धन प्रक्रिया बहुत नहीं बदली है. हालांकि, बेहतर एंजाइमों 3, मानकीकृत समाधान 4,5, और अलगाव की प्रक्रिया 6-9 दौरान कोशिकाओं की रक्षा के लिए प्रतिवर्ती चैनल और मायोसिन ATPase अवरोध करनेवाला BDM के अलावा काफी सेल उपज और व्यवहार्यता में सुधार हुआ है.

नवजात cardiomyo बनाम वयस्कcytes

नवजात चूहों या चूहों से अलग और सुसंस्कृत cardiomyocytes वयस्क cardiomyocytes की संस्कृतियों पर कई फायदे हैं. वयस्क माउस या चूहा 10 से cardiomyocytes के अलगाव की तुलना में जब अग्रणी, नवजात माउस या चूहा दिल के लिए अलगाव की प्रक्रिया, आसान और कम महंगा है. नवजात cardiomyocytes बहुत सेल उपज में वृद्धि, हदबंदी के बाद एक कैल्शियम युक्त मध्यम में reintroduction के लिए अब तक कम संवेदनशील होते हैं. वयस्क cardiomyocytes आमतौर पर संकुचन प्रेरित करने के लिए पेसिंग की आवश्यकता होती है, जबकि आम तौर पर अनायास चढ़ाना के बाद कोशिकाओं को 20 घंटे की धड़कन में यह परिणाम है कि redifferentiation चक्र - एक और बड़ा लाभ यह है कि नवजात माउस cardiomyocytes एक और अधिक तेजी dedifferentiation से गुजरना है. वयस्क cardiomyocytes ट्रांसजेनिक डीएनए के सफल प्रसव के लिए वायरल वैक्टर की आवश्यकता होती है, जबकि नवजात cardiomyocytes, अधिक आसानी से भी लिपोसोमल अभिकर्मक तरीकों के साथ transfectable हैं. नवजात cardiomyocyte के विपरीतएस, वयस्क कृंतक cardiomyocytes 11-13 की संस्कृति myofibrillar गिरावट और सिकुड़ा तंत्र के अंतिम reestablishment की जांच के लिए अनुमति देता है. वयस्क cardiomyocytes में इन विशेषता morphological परिवर्तन 1-2 सप्ताह की अवधि में पाए जाते हैं. dedifferentiation - redifferentiation चक्र जिससे मानव cardiomyopathies 14 में मनाया रोग परिवर्तन की नकल उतार, भ्रूण जीन कार्यक्रम के reexpression के साथ है. नवजात cardiomyocytes की संस्कृति से अधिक वयस्क चूहे cardiomyocytes की एक और लाभ यह समय की लंबी अवधि के लिए संस्कृति करने की क्षमता इन कोशिकाओं है.

माउस cardiomyocytes बनाम चूहा

चूहे नवजात cardiomyocytes के अलगाव और संस्कृति व्यवहार्य कोशिकाओं की उच्च पैदावार और बढ़ अभिकर्मक दरों सहित माउस नवजात cardiomyocytes, उस पर कुछ फायदे हैं. हालांकि, हृदय रोगों के लिए आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडल का व्यापक उपयोग (जैसे </ उन्हें> फैली हुई cardiomyopathy 15 के लिए मॉडल के रूप में पेशी लिम प्रोटीन पीटकर माउस) नवजात चूहों से व्युत्पन्न cardiomyocytes के लिए अलगाव की प्रक्रिया का अनुकूलन करने के लिए प्रेरित किया है. नवजात चूहे और माउस cardiomyocytes अलग करने के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल लगभग समान हैं, अधिक से अधिक देखभाल बाद के लिए एक उपयुक्त एंजाइम मिश्रण के चयन में लिया जाना चाहिए. दरअसल, नवजात माउस cardiomyocytes एक कम सेल उपज और व्यवहार्यता, जिसके परिणामस्वरूप आम तौर पर overdigestion लिए अतिसंवेदनशील होते हैं. नवजात चूहों से व्युत्पन्न cardiomyocytes नवजात चूहे दिल से ली गई कोशिकाओं की तुलना में कुछ हद तक छोटे होते हैं इसके अलावा, चढ़ाना घनत्व, समायोजित किया जाना चाहिए.

रूपात्मक, electrophysiological, जैव रासायनिक, सेल जैविक और biomechanical मापदंडों के साथ ही myofibrillogenesis की प्रक्रिया के लिए की जांच के लिए कई प्रयोग के साथ, सुसंस्कृत नवजात cardiomyocytes के अध्ययन के लिए सबसे बहुमुखी प्रणालियों में से एक बन गए हैंइन विट्रो में हृदय सेल काम करता है. एक सफल परख करने के लिए पहला कदम हालांकि, नवजात माउस cardiomyocytes अलग करने के लिए एक आसान और विश्वसनीय पद्धति पर निर्भर करता है. हमारे प्रोटोकॉल कई स्रोतों से अपनी कार्यप्रणाली ड्रॉ और reproducibility और मजबूती के लिए अनुकूलित किया गया था. हम cardiomyocyte उपज और व्यवहार्यता को प्रभावित करने वाले कारकों पर चर्चा, और अलगाव और संस्कृति शर्तों के अनुकूलन के लिए विकल्प की एक किस्म प्रदान करते हैं.

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Protocol

निम्नलिखित प्रक्रिया नवजात माउस cardiomyocytes के अलगाव और संस्कृति के लिए एक दो दिवसीय प्रोटोकॉल 16,17 वर्णन करता है. सभी समाधान बाँझ या बाँझ छान रहे हैं. सभी उपकरण 75% इथेनॉल के साथ सतह नसबंदी द्वारा निष्फल रहे हैं. प्रारंभिक ऊतक निकासी के लिए छोड़कर, सभी कदम एक बाँझ लामिना का प्रवाह सेल संस्कृति हुड में प्रदर्शन कर रहे हैं. इस प्रोटोकॉल एक दो कूड़े (एस) से नवजात माउस दिलों के अलगाव के लिए करना है - लगभग 5-14 पिल्ले, लेकिन बड़े कूड़े के आकार और चूहे नवजात cardiomyocytes के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. के रूप में उपयुक्त पैमाने पर मीडिया / एंजाइम उपयोग.

नवजात कृन्तकों के साथ काम के लिए, विधायिका और / या जानवरों की देखभाल कार्यक्रमों द्वारा उल्लिखित अपने स्थानीय विश्वविद्यालय के दिशा निर्देशों और नियमों को देखें और अपने संस्थागत अनुमोदित पशु प्रोटोकॉल का पालन करें. इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी तरीकों यूसी सैन डिएगो संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) ने मंजूरी दे दी, और Fede का पालन करने के लिए किया गया हैRAL और राज्य के नियमों.

दिन 1.

1. नवजात चूहों से हृदय ऊतक का अलगाव

  1. 20 मिमी BDM 6-8 के साथ पूरक (सीए 2 +, 2 मिलीग्राम + बिना) 1x पीबीएस के 50 मिलीलीटर की तैयारी, और बर्फ पर रखा दो बाँझ बैक्टीरियल व्यंजन में फैलाने.
  2. 50 मिलीलीटर बाँझ शंक्वाकार फाल्कन ट्यूब में अलगाव माध्यम के 10 एमएल तैयार करें. बर्फ पर सभी समाधान रखें. , और संदंश (घुमावदार, ड्यूमॉन्ट .7), कैंची (एक सीधे घुमावदार एक) जीवाणुरहित.
  3. 1-3 दिन पुराने नवजात चूहों सतह नसबंदी के लिए 75% इथेनॉल के समाधान में जल्दी से rinsed हैं. पिल्ले बाँझ कैंची (सीधे) का उपयोग decapitated कर रहे हैं, और छाती छाती गुहा के लिए उपयोग और दिल (चित्रा 1 ए, पूरक मूवी S1) की अनुमति देने के उरोस्थि साथ खोला जाता है.
    तकनीकी टिप्पणी: 3 दिनों से अधिक उम्र के नवजात चूहों का इस्तेमाल किया है, लेकिन कम व्यवहार्य कोशिकाओं 2 में परिणाम हो सकता है.
  4. दिल से निकाले जाते हैंघुमावदार कैंची से शरीर और 20 मिमी BDM साथ (सीए 2 +, 2 मिलीग्राम + बिना) 1x पीबीएस युक्त जीवाणु डिश में तुरंत तबादला, बर्फ पर. सभी निम्नलिखित कदम बाँझ सेल संस्कृति हुड में प्रदर्शन कर रहे हैं.
  5. (अगर वांछित, और अटरिया) फेफड़े के ऊतकों, बड़े जहाजों को हटा दें. 1x पीबीएस समाधान में धो दिल (सीए बिना 2, 2 मिलीग्राम +) 20 मिमी BDM (बर्फ पर) के साथ रक्त को निकालने के लिए. स्थानांतरण 20 मिमी (बर्फ पर) BDM संदंश का उपयोग या एक छिद्रित चम्मच (चित्रा 1 बी) के साथ (सीए 2 +, 2 मिलीग्राम + बिना) 1x पीबीएस युक्त दूसरा बैक्टीरियल डिश में पहला पकवान से दिलों को धोया.
  6. स्थानांतरण साफ / अलगाव माध्यम की एक बूंद (लगभग 250 μl, चित्रा 1C) में दिल धोया (बर्फ पर) एक तिहाई बैक्टीरियल पकवान में और छोटे टुकड़ों (लगभग 0.5-1 मिमी 3, या छोटे में दिल कीमा घुमावदार कैंची का उपयोग करें; चित्रा -1, 1E).
  7. एक शंक्वाकार में कीमा बनाया हुआ दिल स्थानांतरणट्यूब (बर्फ पर) अलगाव माध्यम के 10 मिलीलीटर युक्त, और रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर कोमल आंदोलन के साथ सेते हैं.

दिन 2.

2. प्रकोष्ठों के enzymatic ऊतक पाचन और चढ़ाना

  1. Collagenase / dispase मिश्रण (रॉश) के 15 मिलीग्राम में तौलना, और 20 मिमी BDM (पाचन मध्यम) के साथ पूरक 10 मिलीलीटर L15 मध्यम 5 में एंजाइम मिश्रण भंग. बाँझ फिल्टर एक नया बाँझ 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में सेल संस्कृति हुड में पाचन मध्यम.
  2. 30 मिलीलीटर एल 15 20 मिमी BDM के साथ पूरक मध्यम, और चढ़ाना मध्यम तैयार.
  3. 1 घंटा की एक न्यूनतम के लिए कोलेजन समाधान (सिग्मा सी 8919) के साथ कोट सेल संस्कृति प्लेटों. बाँझ लामिना का प्रवाह सेल संस्कृति हुड में कोलेजन समाधान (पुनः उपयोग किया जा सकता है) और शुष्क कोलेजन लेपित सेल संस्कृति बर्तन निकालें.
  4. 4 डिग्री सेल्सियस से predigested दिल युक्त शंक्वाकार ट्यूब निकालें ऊतक टुकड़े (चित्रा 1G) एकत्रित किया जाना चाहिए. ऊतक टुकड़े करने के लिए सिंकट्यूब के नीचे और (किसी भी ऊतक टुकड़े ढीला करने के लिए नहीं सुनिश्चित करें., सामान्य रूप से, अलगाव माध्यम के लगभग 1 मिलीलीटर ट्यूब में रह सकती है) पर तैरनेवाला हटा दें. पाचन माध्यम की 5 मिलीग्राम और 1 मिनट के लिए ऑक्सीजन या हवा का उपयोग ऊतक टुकड़े और आक्सीजन के निलंबन के लिए 20 मिमी BDM के साथ पूरक L-15 के 5 मिलीलीटर जोड़ें.
  5. पाचन समाधान के तापमान को समायोजित करने के बारे में 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान के लिए पाचन माध्यम में कार्डियक ऊतक टुकड़े युक्त सील शंक्वाकार ट्यूब स्थानांतरण.
  6. 20-30 मिनट के लिए कोमल आंदोलन (60rpm से अधिक नहीं करने के लिए सेट 37 डिग्री सेल्सियस पर जैसे प्रकार के बरतन,) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कार्डियक ऊतक टुकड़े सेते हैं. . पाचन बार बहुत एंजाइम मिश्रण और बहुत संख्या सावधानी पर निर्भर हो सकता है: अब ऊष्मायन अवधि या उच्च एंजाइम सांद्रता सेल व्यवहार्यता को कम कर सकते हैं.

तकनीकी टिप्पणी: 102696: हम (Cat.No. रॉश से एक collagenase / dispase मिश्रण के उपयोग की सिफारिश38001) बहुत कम है कि बहुत से बहुत कुछ परिवर्तनशीलता है. माउस cardiomyocytes के अलगाव के लिए शास्त्रीय एंजाइम trypsin और / या वर्थिंगटन (कैट नहीं सीएलएस -2) से उपलब्ध collagenase प्रकार द्वितीय 3,16-20 है. हालांकि, collagenase द्वितीय का प्रदर्शन बहुत से बहुत से काफी अलग हो सकता है. वर्थिंगटन आमतौर पर पाचन बार अनुकूलन और उपयोग एंजाइम को कई collagenase लाट के परीक्षण के लिए अनुमति देता है. वैकल्पिक रूप से, वर्थिंगटन एक पूर्व परीक्षण एंजाइम मिश्रण के साथ एक cardiomyocyte अलगाव किट बेचता है कि माउस cardiomyocytes 17 (: NCIS बिल्ली सं) के अलगाव के लिए अनुकूलित किया जा सकता शामिल थे.

  1. ताजा बाँझ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार बाज़ ट्यूब में बाँझ सेल झरनी (40-100 माइक्रोन नायलॉन जाल) रखें. 20 मिमी BDM के साथ पूरक 5 मिलीलीटर एल -15 के साथ पूर्व गीला सेल झरनी. के बारे में 10-20 बार के लिए एक पूर्व गीला 10 मिलीलीटर सेल संस्कृति पिपेट का उपयोग धीरे महीन चुर्ण बनाना ऊतक टुकड़े. ऊतक टुकड़े ज्यादातर suspensio में कोशिकाओं को रिहा, इस कदम के दौरान फैलाने चाहिएN (चित्रा 1H).
  2. बड़ा ऊतक टुकड़े तलछट करते हैं और सेल झरनी (चित्रा 1 मैं) के माध्यम से ताजा शंक्वाकार ट्यूब में निलंबित कोशिकाओं से युक्त स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला.
  3. 5 एमएल पाचन माध्यम में पचाया नहीं ऊतक टुकड़े पुनः निलंबित और कोमल आंदोलन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक अतिरिक्त 5-10 मिनट के लिए सेते हैं.
  4. शेष ऊतक टुकड़े की सतत पाचन के बाद, धीरे 10-20 बार के लिए ऊतक triturate और पहली सेल झरनी के माध्यम से पचाने से शंक्वाकार ट्यूब युक्त कोशिकाओं को जोड़ने. सभी पचा कोशिकाओं के पारित होने की अनुमति के लिए 20 मिमी BDM के साथ पूरक 5 मिलीलीटर एल -15 के साथ सेल झरनी कुल्ला.
  5. Centrifugate शंक्वाकार ट्यूब 300 rpm पर 5 मिनट (लगभग 50-100 XG) के लिए निलंबित कर दिया cardiomyocytes युक्त. (ज्यादातर fibroblasts और endothelial कोशिकाओं से युक्त) सतह पर तैरनेवाला निकालें और मध्यम चढ़ाना 10 मिलीलीटर में फिर से निलंबित सेल गोली.
  6. 10 सेमी सेल संस्कृति पकवान (2A चित्रा) में और 1 के लिए सेते प्लेट कोशिकाओंसेल कल्चर इनक्यूबेटर में -3 ​​घंटा. इस पूर्व चढ़ाना कदम uncoated सेल संस्कृति पकवान (चित्रा -2) का पालन करना होगा, जो fibroblasts और endothelial कोशिकाओं (चित्रा 2 बी) को हटा.
  7. ऊष्मायन के बाद, स्थानांतरण resuspended कोशिकाओं एक बाँझ शंक्वाकार बाज़ अपकेंद्रित्र ट्यूब (15 मिलीलीटर या 50 मिलीलीटर) से (बार बार पकवान पर चढ़ाना मध्यम pipetting द्वारा फिर से निलंबित कोशिकाओं) 10 सेमी संस्कृति डिश से गैर पक्षपाती cardiomyocytes धोने, और.
    वैकल्पिक: सेल निलंबन से अतिरिक्त fibroblasts दूर करने के लिए पूर्व चढ़ाना चरण को दोहराएँ. अगर वांछित, पक्षपाती fibroblast और endothelial कोशिकाओं आगे संवर्धित किया जा सकता है.
  8. (Neubauer hemocytometer का उपयोग करके जैसे, 21 धुंधला नीला बहिष्कार trypan) कोशिकाओं की गणना.
  9. 2 सेमी (चित्रा 2 डी के अनुसार लगभग 1.5 x 10 5 कोशिकाओं के घनत्व के साथ कोलेजन लेपित सेल संस्कृति बर्तन में प्लेट कोशिकाओं, देख भी चढ़ाना पर तालिका 1 में टिप्पणीऔर कोटिंग).
    सेल कल्चर इनक्यूबेटर में बर्तन प्लेस और पालन और cardiomyocytes के प्रसार के लिए अनुमति देने के लिए 12-18 घंटे तक अछूता छोड़ दें.

दिन 3 - नवजात cardiomyocytes की संस्कृति

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखरखाव मध्यम और prewarm तैयार करें. नवजात माउस cardiomyocytes की लिपोसोमल अभिकर्मक के लिए प्रसार inhibitors या क्रोनोट्रॉपिक एजेंटों के अलावा, या प्रक्रिया के लिए 1 टेबल को देखें.
  2. एक दिन चढ़ाना के बाद, cardiomyocytes सेल संस्कृति डिश का पालन किया और बेहतर अनुबंध करने के लिए अनायास शुरू हो जाना चाहिए था (चित्रा 2 ई, 2 एफ, पूरक मूवी S2; अलगाव / संस्कृति प्रक्रिया के दौरान आम समस्याओं के लिए 2 टेबल देखें). अतिरिक्त 1-5 दिनों के लिए रखरखाव मध्यम, और संस्कृति के साथ मध्यम चढ़ाना बदलें. आवश्यक के रूप में मध्यम बदलें.

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम 8 एक दिन पुराने नवजात चूहों (आंकड़े 1 ए, 1 बी, पूरक मूवी S1) से दिलों को अलग किया. धोने और कैंची (आंकड़े 1C-1F) के साथ दिलों क़ीमा के बाद, ऊतक टुकड़े कोमल आंदोलन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात में अलगाव मध्यम में predigested गया. सुपाच्यीकरण (चित्रा 1G) के बाद, हम ताजा बना पाचन माध्यम में ऊतक टुकड़े का तबादला, और कोमल आंदोलन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए ऊतक टुकड़े incubated. परिणामस्वरूप सेल निलंबन (चित्रा 1H) एक सेल झरनी (चित्रा 1G) के माध्यम से हटा दिया गया था. Centrifugation के बाद, pelleted कोशिकाओं मध्यम चढ़ाना 8 मिलीलीटर में resuspended थे और एक 10 सेमी सेल संस्कृति पकवान (2A चित्रा) में preplated, और हृदय fibroblasts और endothelial कोशिकाओं (आंकड़े 2 बी, 2 सी) की कुर्की के लिए अनुमति देने के लिए 2 घंटे के लिए सुसंस्कृत. तेजी से संलग्न नहीं किया कि कोशिकाओं फिर थेचढ़ाना माध्यम में निलंबित कर दिया. Cardiomyocytes युक्त सेल निलंबन के 10 μl एक Eppendorf ट्यूब में pipetteted और एक 1:1 के अनुपात में एक trypan नीले समाधान के साथ सना हुआ था. प्रकोष्ठ / मध्यम चढ़ाना एमएल लगभग 5.1 x 10 5 जीवित कोशिकाओं में जिसके परिणामस्वरूप, एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग गिना रहे थे. गिनती के बाद, कोशिकाओं पकवान (चित्रा 2 डी 1.4 x 10 5 कोशिकाओं / 2 सेमी) के अनुसार लगभग 1 एक्स 10 6 चढ़ाया कोशिकाओं में जिसके परिणामस्वरूप, चार 30 मिमी कोलेजन लेपित सेल संस्कृति व्यंजन (पकवान प्रति 2 मिलीलीटर) में चढ़ाया गया. 18 घंटा चढ़ाना के बाद, cardiomyocytes (लगभग 70% confluency साथ) कोलेजन लेपित सेल संस्कृति व्यंजन से जुड़ी है और अनायास (चित्रा 2 ई, पूरक मूवी S2) अनुबंध करने के लिए शुरू किए गए. बाद में, cardiomyocytes या तो (1 टेबल देखें) लिपोसोमल अभिकर्मक के लिए इस्तेमाल किया गया या कोशिकाओं सीधे रखरखाव मध्यम (चित्रा 2 एफ) में चढ़ाना से स्थानांतरित कर दिया गया और एक और 3 दिनों के लिए सुसंस्कृत. संस्कृति के बाद, cardiomyocytes संक्षेप में 4% पीएफए ​​/ पीबीएस में 5 मिनट के लिए तय की और हमारे हाल के प्रकाशनों 22 में से एक के रूप में वर्णित immunofluorescence के लिए कार्रवाई, 1x पीबीएस में धोया गया. प्रतिरक्षा दाग untransfected और ट्रांसफ़ेक्ट cardiomyocyte संस्कृतियों का चित्रण प्रतिनिधि परिणाम क्रमश: आंकड़े 2 जी और 2H में दिखाया गया. सुसंस्कृत नवजात cardiomyocytes myofibrils के दृश्य से स्पष्ट रूप में उम्मीद cytoarchitecture, (चित्रा 2 जी में लाल संकेत) और intercalated डिस्क संरचनाओं की तरह (चित्रा 2 जी में हरी झंडी) प्रदर्शित करते हैं. चित्रा 2H में देखा, क्योंकि वे भी क्षणिक transfections के लिए उत्तरदायी हैं (हरी झंडी ट्रांसफ़ेक्ट प्रोटीन है, एक अल्फा sarcomeric actinin एंटीबॉडी का उपयोग myofibrils का रेड सिग्नल counterstaining).

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8 नवजात शिशुओं से अलग नवजात चूहों से हृदय के ऊतकों की चित्रा 1. अलगाव. ए) दिल ध्यान से घुमावदार संदंश का उपयोग छाती से निकाल दिया जाता है () भी पूरक मूवी S1 देखें. बी) दिल (सीए 2 + बिना 1x पीबीएस में धो रहे हैं 2 मिलीग्राम +)) बर्फ. सी पर 20 मिमी BDM के साथ पूरक दिल अलगाव माध्यम की एक बूंद में स्थानांतरित कर रहे हैं. डे) एक पूर्व गीला पिपेट का उपयोग घुमावदार कैंची कीमा बनाया हुआ हृदय ऊतक की. एफ) हस्तांतरण का उपयोग नवजात दिलों की क़ीमा. जी) पाचन और विचूर्णन के 20 मिनट के बाद निलंबन में 4 डिग्री सेल्सियस एच) cardiomyocytes पर पर रात ऊष्मायन के बाद predigested हृदय ऊतक. पचाया हृदय ऊतक) ट्यूब. मैं के तल पर अलग सी के निलंबन जमardiomyocytes एक सेल झरनी के माध्यम से फ़िल्टर किया जाता है.

चित्रा 2
कार्डिएक fibroblasts और endothelial कोशिकाओं 1-3 घंटे के बाद uncoated सेल संस्कृति डिश का पालन करना शुरू पूर्व चढ़ाना कदम. बी) की शुरुआत में अलग कक्षों की नवजात माउस cardiomyocytes और प्रतिनिधि immunofluorescence छवियों का चित्रा 2. संस्कृति. ए) चढ़ाना अगर वांछित गैर पक्षपाती cardiomyocytes के मेजबान के बाद पूर्व चढ़ाना कदम. सी) के दौरान संस्कृति की, शेष हृदय fibroblasts और endothelial कोशिकाओं, आगे संवर्धित किया जा सकता है. कोलेजन लेपित सेल संस्कृति बर्तन में अलग और शुद्ध नवजात माउस cardiomyocytes की डी) चढ़ाना . ई) संस्कृति में 18 घंटे के बाद, cardiomyocytes लेपित डी का पालन करनाISHES, और बेहतर (भी पूरक मूवी S2 देखें). एफ) के रखरखाव के माध्यम के साथ चढ़ाना मध्यम जगह संस्कृति से मृत कोशिकाओं को हटा सहज संकुचन शुरू करते हैं. Myomesin के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग नवजात माउस cardiomyocytes, के ए) एफ) Scalebar 0.2 मिमी. जी) प्रतिनिधि immunofluorescence छवि लाल रंग में (विकासात्मक अध्ययन हाइब्रिडोमा बैंक, आयोवा, mMaC myomesin बी 4,) और बीटा catenin (सिग्मा, Cat.-नहीं .: C2206, हरे रंग में). लाल रंग में व्यक्त GFP टैग हरे रंग में प्रोटीन (GFP-titin-N2B टुकड़ा), और अल्फा actinin (सिग्मा, Cat.-No.A-7811) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट नवजात माउस cardiomyocytes की Scalebar 10 माइक्रोन. एच) प्रतिनिधि immunofluorescence छवि . 20 माइक्रोन Scalebar. अभिकर्मक और प्रतिरक्षाविज्ञानी 2 जी में इस्तेमाल किया धुंधला) और 2H) के लिए एक विधि 1 टेबल में पाया जा सकता है, और हमारे हाल के प्रकाशनों 22 में से एक में संक्षेप.

पूरक मूवी S1.

पूरक मूवी S2. पूरक फिल्म देखने के लिए यहां क्लिक करें .

पूर्व चढ़ाना अलगाव के बाद कोशिकाओं की पूर्व चढ़ाना बहुत पूरे सेल मिश्रण से हृदय fibroblasts और endothelial कोशिकाओं को हटा. एक एकल पूर्व चढ़ाना कदम सेल जनसंख्या से गैर cardiomyocytes की लगभग 50-80% हटा. दो बार से अधिक पूर्व चढ़ाना, साथ ही 3 घंटा से अधिक समय पूर्व चढ़ाना बार के रूप में की पुनरावृत्ति के कारण हृदय myocytes की अतिरिक्त हानि के लिए अनुशंसित नहीं है. साथ पूर्व चढ़ाना का प्रतिस्थापन Percoll ढाल 23,24 cardiomyocyte सेल आबादी की शुद्धता में सुधार हो सकता है.
कोटिंग और सेल संस्कृति सब्सट्रेट पूर्व के साथ सेल संस्कृति व्यंजन की कोटिंगकोलेजन, fibronectin, laminin, जटिल ईसीएम मिश्रण (यानी Matrigel 25,26) या कृत्रिम substrates (यानी सिलिकॉन बहुलक 27, organosilane 28) की तरह tracellular मैट्रिक्स (ईसीएम) घटकों सकारात्मक प्रारंभिक चढ़ाना चरण के दौरान प्रसार cardiomyocyte पालन, सेल व्यवहार्यता और सेल को प्रभावित करती है और बाद में संस्कृति की अवधि के लिए. विशेष रूप से ग्लास substrates पर cardiomyocytes की संस्कृति cardiomyocytes के उचित पालन प्राप्त करने के ईसीएम घटकों के साथ सतह की कोटिंग की आवश्यकता है.
हम 0.1% कोलेजन समाधान (सिग्मा सी 8919), 3 मिलीग्राम / एमएल कोलेजन टाइप 1 समाधान (उन्नत Biomatrix, PureCol), 1% जिलेटिन समाधान सहित (ईसीएम घटकों, की एक किस्म के साथ सेल संस्कृति इलाज प्लास्टिक और कांच substrates के कोटिंग का परीक्षण किया सिग्मा G9391, एच 2 हे, autoclaved में भंग), laminin समाधान (सिग्मा L4544), या सुअर दिलों 29 या हृदय fibroblasts 30 व्युत्पन्न जटिल ईसीएम मिश्रण. सेल cultuव्यंजन सेल कल्चर इनक्यूबेटर में रात खत्म करने के लिए 1 घंटे की एक न्यूनतम के लिए ईसीएम समाधान के साथ incubated रहे थे, और फिर से लामिना का प्रवाह सेल संस्कृति हुड में सूखे ईसीएम को हटाने के बाद. लंबे समय तक भंडारण के दौरान बाँझपन और ईसीएम प्रोटीन अखंडता (4 डिग्री सेल्सियस या फ्रोजन पर जैसे भंडारण) बनाए रखा है अगर ईसीएम समाधान कई बार (10-20 बार) पुनः उपयोग किया जा सकता है. सतर्कता की वजह से ईसीएम प्रोटीन भंग करने के लिए इस्तेमाल किया बफ़र्स में से कुछ की अम्लीय प्रकृति के कारण, कोटिंग के बाद 1x पीबीएस के साथ संस्कृति बर्तन धोने कोशिकाओं के चढ़ाना से पहले आवश्यक हो सकता है.
तकनीक और घनत्व चढ़ाना बाद में assays पर निर्भर करता है, चढ़ाना के लिए इष्टतम सेल सांद्रता के पास मिला हुआ cardiomyocyte monolayers में परिणाम चाहिए. कम मात्रा विशेष सेल सेल contac से रहित एकल, अलग cardiomyocytes में सेल व्यवहार्यता और परिणाम कम कर देता है, जबकि उच्च सांद्रता में cardiomyocytes की चढ़ाना, बहुस्तरीय cardiomyocyte समुच्चय और कम एकरूपता में परिणामटीएस (intercalated डिस्क संरचनाओं की तरह). Cardiomyocytes बल्कि बड़े और भारी हैं, और फाल्कन ट्यूब के तल पर ध्यान केंद्रित करते हैं कि मन में भालू चढ़ाना के लिए कोशिकाओं pipetting है. चढ़ाना कदम के बीच में कोशिकाओं का मेजबान अपने बर्तन में कोशिकाओं का भी वितरण सुनिश्चित करता है. चढ़ाना कोशिकाओं को एक आंकड़ा के आकार में बर्तन ले जाते हैं "8" पकवान के केंद्र के लिए कक्षों की एकाग्रता से बचने के लिए. लिपोसोमल अभिकर्मक के लिए नामित नवजात cardiomyocytes के इष्टतम confluency चढ़ाना के बाद सुबह लगभग 70-80% होना चाहिए.
सीरम सेल संस्कृति का उपयोग भ्रूण (या नवजात) चढ़ाना मध्यम में गोजातीय सीरम और घोड़े सीरम चढ़ाना चरण के दौरान सेल व्यवहार्यता और cardiomyocytes के पालन के लिए आवश्यक है परीक्षण किया गया. इस्तेमाल किया सीरम की गुणवत्ता चढ़ाना / संस्कृति प्रक्रिया के दौरान महत्वपूर्ण कदमों में से एक हो सकता है. सीरम की कम मात्रा के साथ रखरखाव मध्यम की पूरकता वैकल्पिक है, हालांकि बहुत impro सकता हैसंस्कृति समय की अवधि की है.
सावधानी: सीरम के अलावा काफी सभ्य cardiomyocytes में जैव रासायनिक संकेत दे रास्ते को बदल सकता है और प्रयोगात्मक मानकों, परिकल्पना और परिणाम के बाद व्याख्या करने के लिए सम्मान के साथ न्याय किया जा सकता है. Cardiomyocytes के सीरम मुक्त संस्कृतियों 10,31 में वर्णित किया गया है, और कारण सीरम में मौजूद अज्ञात वृद्धि कारकों के परिणाम की skewing रोक सकता है.
प्रसार संदमक टर्मिनली विभेदित cardiomyocytes आमतौर पर सेल डिवीजन से गुजरना नहीं है. हालांकि, इस तरह के 10 माइक्रोन ARAC (साइटोसिन-BD-arabino-furanoside हाइड्रोक्लोराइड, सिग्मा C6645) के रूप में प्रसार निरोधक, के अलावा रखरखाव मध्यम करने के लिए अत्यधिक हृदय fibroblast और endothelial कोशिकाओं के प्रसार को रोकने के लिए सिफारिश की है. यहां तक ​​कि हृदय fibroblasts और endothelial कोशिकाओं की आबादी को कम करने के लिए पूर्व चढ़ाना कदम के अलावा के साथ, शेष fibroblasts सेल proli से गुजरना होगाferation और समय के साथ काफी सभ्य सेल आबादी बदल जाते हैं.
सावधानी: आनुवांशिक कारक और अलगाव समय बिंदु, भ्रूण और नवजात माउस cardiomyocytes अभी प्रसार संभावित 23,32,33 हो सकता है पर निर्भर करता है. Arac का उपयोग प्रयोगात्मक मापदंडों, परिकल्पना और परिणामों की व्याख्या के आधार पर न्याय किया जाना चाहिए.
क्रोनोट्रॉपिक एजेंटों के अलावा (Preferentially नवजात माउस cardiomyocytes के लिए 1 माइक्रोन,, सिग्मा I6501), या isoproterenol, ऐसे phenylephrine (सिग्मा P6126 0.1 preferentially नवजात चूहे cardiomyocytes के लिए मिमी,) के रूप में एजेंट 34, साथ रखरखाव मध्यम की पूरकता बहुत पर cardiomyocytes के प्रसार, sarcomerogenesis बढ़ जाती है थाली के साथ ही कोशिकाओं का सहज पिटाई. हालांकि, इन एजेंटों के अलावा वांछित परख मापदंडों (जैसे अलावा सिकुड़ा व्यवहार और जैव रासायनिक मापदंडों तिरछा हो सकते हैं) के लिए सम्मान के साथ तौला जाना चाहिए.
अभिकर्मक नवजात माउस cardiomyocytes में डीएनए / आरएनए के Liposomal अभिकर्मक अभिकर्मक समय बिंदु, अभिकर्मक अभिकर्मक, संस्कृति घनत्व, डीएनए / आरएनए एकाग्रता और इस्तेमाल किया डीएनए का निर्माण पर बहुत निर्भर है. हम लिपोसोमल अभिकर्मक अभिकर्मकों की एक किस्म का परीक्षण किया और अनुरक्षण तृतीय (सिग्मा) और 2000 Lipofectamine (Invitrogen) लागू पाया. एंटीबायोटिक दवाओं के मुफ्त रखरखाव मध्यम के साथ पहले अभिकर्मक को चढ़ाना मध्यम 2 घंटा की जगह से चढ़ाना के बाद कोशिकाओं 24 घंटा Transfect. नवजात cardiomyocytes की अभिकर्मक 30 मिमी व्यंजन में संवर्धित के लिए, एक बाँझ Eppendorf ट्यूब में 200 μl DMEM के साथ 1-2 ग्राम डीएनए मिश्रण, और पतला डीएनए मिश्रण करने के लिए एस्कॉर्ट III के 4 μl जोड़ें. धीरे मिश्रण और डीएनए / liposome जटिल गठन की अनुमति के लिए बाँझ हुड में 5 मिनट की एक न्यूनतम के लिए सेते हैं. 800 μl ताजा एंटीबायोटिक दवाओं से मुक्त रखरखाव मध्यम साथ एंटीबायोटिक दवाओं से मुक्त रखरखाव के माध्यम से बदलें और कोशिकाओं के डीएनए / liposome मिश्रण जोड़ें. सेल घन में कोशिकाओं को सेते24 घंटे के बाद नए सिरे से मानक रखरखाव मध्यम साथ lture इनक्यूबेटर और जगह. सफलतापूर्वक ट्रांसफ़ेक्ट नवजात माउस cardiomyocytes के लिए एक प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 2H में दिखाया गया है. डीएनए की कैल्शियम वर्षा का उपयोग अभिकर्मक भी संभव है. नवजात माउस cardiomyocytes की अभिकर्मक 1-20% से लेकर ठेठ अभिकर्मक क्षमता के साथ, नवजात चूहे cardiomyocytes की तुलना में अधिक मुश्किल है. (: Adenovirus, एडिनो से जुड़े वायरस, lentivirus जैसे) वायरल वैक्टर उच्च क्षमता 35-37 प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं. नवजात cardiomyocytes के electroporation डीएनए / आरएनए के वितरण के लिए अनुपयुक्त हमारे हाथ में है, हालांकि कई रिपोर्टों भ्रूण और नवजात cardiomyocytes 38,39 की electroporation का उपयोग कर सफलता दिखा. हाल के एक लेख 38 में, Djurovic एट अल. कई अभिकर्मक तरीकों, सफलता दर के साथ ही अपने फायदे और नुकसान संक्षेप.
Passaging बर्फ़ीली / एसटूक्रोध Cardiomyocytes की passaging 1 अनुशंसित नहीं है. लंबे समय तक भंडारण के लिए पृथक नवजात cardiomyocytes की ठंड के कारण कम क्षमता और कम वसूली की दरों के लिए सिफ़ारिश बेहद मुश्किल और नहीं है. कई कंपनियों ने हालांकि स्थितियां अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है, यह भी नवजात माउस cardiomyocytes की cryopreservation के लिए उपयुक्त हो सकता है कि मानव cardiomyocyte प्राथमिक संस्कृतियों (जैसे celprogen, बिल्ली. नहीं. M36044-15FM) के लिए विशेष ठंड मध्यम प्रदान करते हैं. आलिंद cardiomyocytes की सफल Passaging और cryopreservation एक ट्रांसजेनिक माउस मॉडल 32 में वर्णित किया गया है.

चढ़ाना और संस्कृति की स्थिति की तालिका 1. अनुकूलन, लिपोसोमल अभिकर्मक.

कोई व्यवहार्य या पक्षपाती कोशिकाओं 1 दिन चढ़ाना के बाद - एंजाइम एकाग्रता और / या पाचन समय कम
- परिवर्तन एंजाइम मिश्रण
- चामध्यम चढ़ाना के लिए nge सीरम
- परिवर्तन ईसीएम / कोटिंग मध्यम और / या सेल संस्कृति व्यंजन के प्रकार
- अलगाव / पाचन मीडिया को 20 मिमी BDM जोड़
- कोशिकाओं के संक्रमण के लिए जाँच
कम सेल उपज - पाचन समय और / या एंजाइम एकाग्रता में वृद्धि
- अलगाव की प्रक्रिया के दौरान वृद्धि centrifugation समय / गति
- वृद्धि विचूर्णन अवधि
असमान चढ़ाना; संस्कृति में कोशिकाओं की confluency उच्च / बहुत कम है - अलगाव की प्रक्रिया के दौरान कोशिकाओं की गिनती और चढ़ाना दौरान कोशिकाओं / पकवान की संख्या को समायोजित
- चढ़ाना एकाग्रता समायोजित
- ध्यान से Centrifugation के बाद सेल गोली resuspend और दोहराया pipetting (2 दिन चरण 13) द्वारा चढ़ाना पहले, यकीन नहीं दिखाई सेल clumps रहना बनाना
कोई धड़कन कोशिकाओं (: Phenylephrine, isoproterenol उदाहरण के लिए) - रखरखाव मध्यम करने क्रोनोट्रॉपिक एजेंट जोड़ना
- मध्यम जगह
- CHहृदय fibroblasts / endothelial कोशिकाओं की उच्च संख्या के लिए Eck
Fibroblasts की उच्च संख्या - अलगाव की प्रक्रिया के दौरान अतिरिक्त preplating कदम जोड़
- रखरखाव मध्यम करने के लिए प्रसार अवरोध करनेवाला जोड़ने (1 टेबल)
कई मृत कोशिकाओं - सेल संस्कृति माध्यम की जगह
- अलगाव की प्रक्रिया के दौरान एंजाइम एकाग्रता और / या पाचन समय कम
- चेक सेल कल्चर इनक्यूबेटर (सीओ 2, तापमान, आर्द्रता)
- संदूषण के लिए जाँच
दूषण - बाँझ सेल संस्कृति काम करने की स्थिति में 21 का पालन करना
- नई पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान का उपयोग, मध्यम जगह
- सतह के 75% इथेनॉल के समाधान के साथ नवजात चूहों बाँझ

तालिका 2. समस्या निवारण. कई कारकों प्राथमिक सेल के सफल अलगाव और संस्कृति को प्रभावित कर सकते हैंएस. बुनियादी सेल कल्चर तकनीक में सामान्य परिचय के रूप में, इयान Freshney 21 द्वारा इस तरह के "पशु कोशिकाओं की संस्कृति" के रूप में मैनुअल से परामर्श करें. हम का सामना करना पड़ा है कि नवजात माउस cardiomocytes के अलगाव और संस्कृति procedur में समस्याओं के लिए संभावित कारणों में सबसे अधिक बार इस तालिका में सूचीबद्ध हैं.

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Discussion

हृदय रोगों का अध्ययन करने के लिए पशु मॉडल का उपयोग हृदय अनुसंधान में मानक बन गया है. इन मॉडलों में से करीब जैव रासायनिक लक्षण वर्णन (यानी जैव रासायनिक या biomechanical उत्तेजनाओं को हृदय कोशिकाओं की प्रत्यक्ष प्रतिक्रियाओं का अध्ययन) आम तौर पर हृदय के ऊतकों या cardiomyocytes के अलगाव की आवश्यकता है. दिल की शारीरिक प्रतिक्रियाओं की जांच के अध्ययन पूर्व vivo (जैसे 40 acetylcholine के लिए, या ischemia-reperfusion परिदृश्यों में 41) आम तौर पर हृदय ऊतक टुकड़े की 44,45 में cardiomyocytes की जांच के लिए अनुमति देने के explant संस्कृतियों, whilst langendorff-perfused पूरे दिल 42,43, उपयोग एक तीन आयामी ऊतक वातावरण. हालांकि, explant ऊतकों संवर्धन संभावित ऊतक के कोर के भीतर एक परिगलित क्लस्टर पैदा करने, पोषक तत्वों के प्रसार में बाधा हो सकती है. इसके अलावा, cardiomyocytes ऊतक के भीतर स्थिर हैं, इसलिए explants के बाहर कोशिकाओं के प्रवास केवल obse हैfibroblasts या ख्यात हृदय कोशिकाओं पूर्वज 44 जैसे गैर cardiomyocytes, के लिए rved. इसलिए अलगाव और संवर्धन प्रक्रियाओं की स्थापना के लिए आवश्यक cardiomyocytes के विकास, सेल जैविक, जैव रासायनिक और biophysical व्यवहार की जांच. स्तनधारी cardiomyocytes के अलगाव और संस्कृति के लिए प्रारंभिक प्रोटोकॉल नवजात चूहों 1,2 का उपयोग. हालांकि, आनुवंशिक अध्ययन के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में माउस की वृद्धि (यानी आनुवंशिक रूप में दस्तक या नाक आउट चूहों संशोधित) स्थापित अलगाव और संवर्धन तरीकों का अनुकूलन जरूरी हो गया. दुर्भाग्य से, नवजात माउस cardiomyocytes के अलगाव अधिक पारंपरिक रूप से इस्तेमाल नवजात चूहे cardiomyocytes के साथ तुलना में विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण है. प्रस्तुत प्रोटोकॉल नवजात माउस cardiomyocytes के अलगाव और संस्कृति के लिए अनुकूलित एक विश्वसनीय और मजबूत विधि का वर्णन करता है. हम हदबंदी एक के लिए, प्रारंभिक ऊतक निकासी के लिए आवश्यक कदम का वर्णनएन डी हृदय fibroblasts और endothelial कोशिकाओं से cardiomyocytes की शुद्धि, और चढ़ाना और संस्कृति स्थितियों के लिए. प्रोटोकॉल मानक स्थितियों में नवजात माउस cardiomyocytes के अलगाव और संस्कृति के लिए एक बुनियादी दृष्टिकोण प्रदान करता है, यह आसानी से नवजात चूहे cardiomyocytes के अलगाव और संस्कृति के लिए अनुकूलित है, साथ ही विशिष्ट बाद परख प्रकार के लिए किया जा सकता है: अलग कक्षों की जैसे संस्कृति xCELLigence कार्डियो ई प्लेटों में cardiomyocytes की लाइव सेल इमेजिंग, या संस्कृति के लिए लचीला झिल्ली biomechanical गुणों की जांच करने के लिए (जैसे Bioflex संस्कृति प्लेटों), गिलास नीचे बर्तन में संस्कृति (MatTek) पर (ACEA, रॉश, Cat.-No.: 06417051001) सिकुड़ा कार्यों पर दवाओं के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए. इसके अलावा, हम अलगाव और संस्कृति प्रक्रिया का अनुकूलन के लिए विकल्प प्रदान करते हैं और संभावित समस्याओं और उनके समाधान के लिए स्रोत पर चर्चा. इसलिए, इस प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं ने एक अप करने की तारीख, अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और जांच की सहायता करनी चाहिएनवजात माउस cardiomyocyte संस्कृतियों की तैयारी के लिए सस्ती विधि.

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Disclosures

नहीं.

Acknowledgments

हम प्रो अवकाश प्राप्त ज्यां क्लाड Perriard और एवलिन Perriard नवजात चूहे और माउस cardiomyocytes के लिए अलगाव की तकनीक में परिचय के लिए (प्रौद्योगिकी, स्विट्जरलैंड के स्विस फेडरल इंस्टीट्यूट) के लिए आभारी हैं. हम उनके समर्थन के लिए प्रो जू चेन और प्रो सिल्विया इवांस (UCSD, यूएसए) धन्यवाद देना चाहूंगा. ई की प्रयोगशाला में काम एक एमआरसी कैरियर स्थापना अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था. एसएल एनआईएच / NHLBI (HL107744) से स्वतंत्रता पुरस्कार के लिए एक K99/R00 मार्ग द्वारा समर्थित है. TMM अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (11POST7310066) से एक postdoctoral फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8 Sigma B-0753 prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47.
Collagenase/Dispase Roche 10269638001 can be substituted with collagenase type II from Worthington
Collagenase type II3 Worthington CLS-2 substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche
1x trypsin solution (0.25%) with EDTA cellgro 25-053-CI
1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS cellgro 30-002-Cl
1x PBS (without Ca2+, Mg2+) e,g, cellgro 21-040-CV
HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4 cellgro 21-022-CV
DMEM high glucose cellgro 10-013-CV
M-199 cellgro 10-060-CV
fetal bovine serum cellgro 35-011-CV cell-culture grade
horse serum cellgro 35-030-CV cell-culture grade
Leibovitz L-155 cellgro 10-045-CV
AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride) Sigma C-6645 proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C
phenylephrine Sigma P-6126 chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C
isoproterenol hydrochloride Sigma I-6501 chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C
0.1% collagen solution Sigma C-8919 extracellular matrix for coating
3 mg/ml collagen type 1 solution Advanced BioMatrix 5005-B alternative to Sigma collagen solution
cell strainer Fisherbrand 22363548 appropriate filter size:40 μm-100 μm
syringe filter 0.2 μm Fisherbrand 09-719C for sterile filtration of digestion medium
straight scissors Fine Sciences Tools 91460-11
curved scissors Fine Science Tools 91461-11
Dumont No. 7 forceps Fine Science Tools 91197-00
perforated spoon Fine Science Tools 10370-19 optional, for transfer of heart tissue
Trypan blue Gibco 15250-061 live cell staining
Neubauer hemocytometer Prosource Scientific 3500 alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems
50 ml Falcon tubes Fisherbrand 14-432-23
15 ml Falcon tubes Fisherbrand 05-527-90
20 ml syringe BD Medical 14-820-19
10 ml serological pipette Falcon 357551
30 mm cell culture dish Nunc 153066 for standard culture of cardiomyocytes
30 mm cell culture dish, glass bottom MatTek P35G-0-10-C for live cell imaging with inverted microscope
10 cm cell culture dish Nunc 172958 for preplating
Escort III Sigma L3037 for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000
Lipofectamine 2000 Life Technologies, Invitrogen 52887 substitute for Escort III
Buffers and media:
  • Isolation medium (filter sterilize)
    20 mM BDM
    0.0125% trypsin
    in HBSS4 (without Ca2+, Mg2+)
  • Digestion medium (filter sterilize)
    20 mM BDM
    1.5 mg/ml Roche Collagenase/Dispase enzyme mix
    in L15 medium
  • Plating medium
    65% DMEM high glucose
    19% M-199
    10% horse serum
    5% fetal calf serum
    1% penicillin/streptomycin
  • Maintenance medium
    78% DMEM high glucose
    17% M-199
    4% horse serum
    1% penicillin/streptomycin
    optional:
    1 μM AraC
    1 μM isoproterenol or 0.1 mM phenylephrine
The plating and maintenance medium can be stored at 4 °C for up to 6 months.

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Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (79), e50154, doi:10.3791/50154 (2013).

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