Summary
Culturas rato cardiomiócitos primários são uma das ferramentas fundamentais para a investigação da organização e função miofibrilar. O protocolo a seguir descreve o isolamento e cultura de cardiomiócitos primários de corações neonatais do mouse. As culturas de cardiomiócitos resultantes podem ser subsequentemente utilizados para uma variedade de biomecânicas, ensaios bioquímicos e celulares biológica.
Abstract
Cardiomiócitos neonatais cultivadas têm sido muito utilizados para estudar myofibrillogenesis e funções miofibrilares. Cardiomiócitos cultivados permitir a fácil manipulação e investigação das vias bioquímicas, e seu efeito sobre as propriedades biomecânicas do batimento espontâneo cardiomiócitos.
O protocolo de 2 dias a seguir descreve o isolamento e cultura de cardiomiócitos neonatais do mouse. Mostramos como dissecar facilmente corações de recém-nascidos, dissociar o tecido cardíaco e enriquecer cardiomiócitos a partir da população de células cardíacas. Discute-se o uso de diferentes misturas de enzimas para a célula-dissociação, e seus efeitos sobre células-viabilidade. Os cardiomiócitos isolado pode ser posteriormente utilizado para uma variedade de,, ensaios com células-biológica ou bioquímica biomecânico electrofisiológicos morfológicas. Nós otimizamos o protocolo para a robustez e reprodutibilidade, usando soluções só comercialmente disponíveis e enzima mistura que show variabilidade pouco de lote para lote. Nós também tratar de problemas comuns associados com o isolamento e cultura de cardiomiócitos, e oferecem uma variedade de opções para a otimização das condições de isolamento e de cultura.
Introduction
Os primeiros relatórios para a dissociação de sucesso e cultura de células cardíacas de roedores remonta à década de 1960 1,2. Mesmo então, Harary e Farley notado que os cardiomiócitos cultivados "pode fornecer um sistema único para o estudo dos requisitos da contractilidade periódica [, e podem] fornecem um meio para determinar a contribuição de diversas vias metabólicas para a [bater] processo". Embora Harary e Farley cardiomiócitos isolados e cultivados de ratos jovens, bem como o protocolo original foi adaptado e modificado por muitos cientistas ao longo dos anos, o procedimento de isolamento e cultura geral não mudou muito. No entanto, os melhores enzimas 3, soluções padronizadas de 4,5, e a adição do canal reversível e miosina ATPase BDM para proteger as células durante o procedimento de isolamento de 6-9 melhorou significativamente célula-produtividade e viabilidade.
Adulto miocardiopatia vs neonatalcitos
Cardiomiócitos isoladas e cultivadas a partir de murganhos ou ratos recém-nascidos têm várias vantagens sobre as culturas de cardiomiócitos adultos. Em primeiro lugar, o procedimento de isolamento para neonatais do rato ou do rato corações é mais fácil e menos dispendiosa, quando comparada com o isolamento de cardiomiócitos de rato ou um rato adulto 10. Cardiomiócitos neonatais são muito menos sensíveis a reintrodução de um meio contendo cálcio após dissociação, aumentando consideravelmente o rendimento celular. Outra grande vantagem é que os cardiomiócitos neonatais do mouse passar por uma desdiferenciação mais rápida - ciclo rediferenciaï que normalmente resulta em bater espontaneamente células 20 horas após o plaqueamento, enquanto cardiomiócitos adultos normalmente exigem estimulação para induzir contração. Cardiomiócitos neonatais também são mais facilmente transfectable com os métodos de transfecção lipossomal, enquanto cardiomiócitos adultos necessitam de vetores virais para a entrega bem sucedida de DNA transgênico. Em contraste com cardiomiócitos neonataiss, a cultura de cardiomiócitos de roedores adultos 11-13 permite investigações de degradação miofibrilar e eventual restabelecimento do aparelho contrátil. Estas alterações morfológicas características em cardiomiócitos adultos ocorrem em períodos de 1-2 semanas. A desdiferenciação - ciclo rediferenciaï é acompanhado por reexpressão do programa gene fetal, imitando assim alterações patológicas observadas em cardiomiopatias humanos 14. Outra vantagem de cardiomiócitos de rato adulto durante a cultura de cardiomiócitos neonatais é a capacidade de cultura destas células por longos períodos de tempo.
Rato vs cardiomiócitos de rato
O isolamento e cultura de cardiomiócitos de ratos recém-nascidos tem algumas vantagens sobre o de cardiomiócitos neonatais rato, incluindo rendimentos mais elevados de células viáveis e aumento das taxas de transfecção. No entanto, a ampla utilização de modelos de ratos geneticamente modificados para doenças cardíacas (por exemplo, </ Em> a lim muscular rato knockout proteína como modelo para cardiomiopatia dilatada 15) levou à adaptação do procedimento de isolamento de cardiomiócitos derivados de camundongos recém-nascidos. Embora os protocolos usados para isolar neonatais cardiomiócitos de ratos e camundongos são quase idênticas, maior cuidado deve ser tomado na seleção de uma mistura de enzimas apropriadas para o último. Com efeito, os cardiomiócitos neonatais de rato são geralmente mais susceptíveis a overdigestion, resultando numa redução de rendimento celular e viabilidade. Além disso, a densidade do revestimento deve ser ajustado, por cardiomiócitos derivados de ratinhos neonatais são um tanto menor em comparação com células derivadas a partir de corações de ratos recém-nascidos.
Com muitos usos para a investigação de parâmetros morfológicos, eletrofisiológicos, bioquímicos, celulares e biológicos e biomecânicos, bem como para o processo de myofibrillogenesis, cardiomiócitos neonatais cultivadas tornaram-se um dos sistemas mais versáteis para o estudo dafunções das células cardíacas in vitro. O primeiro passo para um ensaio bem sucedido no entanto, depende de uma metodologia simples e de confiança para isolar cardiomiócitos neonatais de rato. Nosso protocolo tira a sua metodologia de muitas fontes e foi otimizada para a reprodutibilidade e robustez. Discutimos fatores que influenciam cardiomiócitos-rendimento e viabilidade, e fornecer uma variedade de opções para a otimização de condições de isolamento e de cultura.
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Protocol
O seguinte procedimento descreve um protocolo de 16,17 de dois dias para o isolamento e cultura de cardiomiócitos neonatais de rato. Todas as soluções são estéreis ou esterilizadas por filtração. Todas as ferramentas são esterilizados por esterilização da superfície com etanol a 75%. Exceto para a extração do tecido inicial, todas as etapas são realizadas em uma cultura de células de fluxo laminar capô estéril. Este protocolo destina-se ao isolamento de corações neonatais de rato 1-2 ninhada (s) - de aproximadamente 5-14 filhotes, mas pode ser adaptado para os tamanhos maiores de areia e de rato cardiomiócitos neonatais. Uso de mídia Escala / enzima, conforme apropriado.
Para o trabalho com roedores neonatais, consulte as diretrizes da universidade local e regras estabelecidas pelo legislador e / ou programas de cuidados de animais e aderir ao seu protocolo de animais aprovado institucionalmente. Todos os métodos descritos neste protocolo foram aprovados pelo Animal Care e Use Comitê de UC San Diego Institucional (IACUC), e aderir a federegulamentos ral e estadual.
Dia 1.
1. Isolamento de tecido cardíaco de ratos Neonatal
- Preparar 50 ml de 1x PBS (sem Ca 2 +, Mg 2 +) suplementado com 20 mM de BDM 6-8, e dispersar em dois pratos de bactérias estéreis colocados em gelo.
- Preparar 10 ml de meio de isolamento, em 50 mL de tubos Falcon cónicos estéreis. Mantenha todas as soluções no gelo. Esterilizar tesoura (uma curva, uma reta) e fórceps (curvas, Dumont No.7).
- Ratinhos neonatais de 1-3 dias de idade são lavados rapidamente em solução de etanol a 75% para a esterilização da superfície. Os filhotes de cachorro são decapitados com uma tesoura estéril (em linha reta), eo peito é aberto ao longo do esterno para permitir o acesso à cavidade torácica eo coração (Figura 1A, Suplementar filme S1).
Comentário Técnico: ratos neonatais com mais de 3 dias ser utilizado, mas resulta em menor número de células viáveis 2. - Os corações são extraídoso corpo com uma tesoura curva e transferidos imediatamente para o prato bacteriana contendo 1x PBS (sem Ca 2 +, Mg 2 +) com BDM 20 mM, em gelo. Todos os seguintes passos são realizados no capuz de cultura de células estéril.
- Remover o tecido pulmonar, embarcações maiores (e átrios, se desejar). Corações na solução de lavagem de PBS 1x (sem Ca 2 +, Mg 2 +) com BDM 20 mM (em gelo) para remover o sangue. Transferência lavada corações de primeiro prato para o segundo prato bacteriana contendo 1x PBS (sem Ca 2 +, Mg 2 +) com BDM 20 mM (em gelo), com a pinça ou uma colher perfurada (Figura 1B).
- Transferência limpo corações / lavado em uma gota de meio de isolamento (cerca de 250 mL; Figura 1C) em um terceiro prato bacteriana (no gelo) e use a tesoura curva para picar corações em pedaços pequenos (aproximadamente 0,5-1 mm 3, ou menores; Figura 1D, 1E).
- Transferir corações picados num cónicatubo contendo 10 ml de meio de isolamento (em gelo), e incuba-se com agitação suave a 4 ° C durante a noite.
Dia 2.
2. Tissue digestão enzimática e chapeamento de Células
- Pesa-se 15 mg de mistura de colagenase / dispase (Roche), e dissolve-se a mistura de enzima em 10 ml de meio L15-5 complementado com BDM (meio de digestão) 20 mM. Filtro esterilizado o meio de digestão na capa de cultura de células para um novo tubo de 50 ml estéril Falcon.
- Preparar 30 ml de meio L-15 suplementado com BDM 20 mM, e meio de plaqueamento.
- Placas de cultura de células casaco com solução de colagénio (Sigma C-8919) para um mínimo de 1 hora. Remover solução de colágeno (pode ser reutilizada) e de colágeno revestido pratos de cultura de células secas em fluxo laminar estéril de cultura celular capô.
- Remover o tubo cónico contendo os corações pré-digeridas a partir de 4 ° C. Os fragmentos devem ser agregados (Figura 1G). Deixe os fragmentos de tecido para afundaro fundo do tubo e remover o sobrenadante (a certeza de não perder quaisquer fragmentos de tecido;. normalmente, cerca de 1 ml do meio de isolamento pode permanecer no tubo). Adicionar 5 ml de meio de digestão e 5 mL de L-15 suplementado com 20 mM de BDM para fragmentos de tecido e a suspensão oxigenado usando oxigénio ou ar, durante 1 minuto.
- Transferir o tubo cónico selado contendo os fragmentos de tecido cardíaco em meio de digestão a 37 ° C num banho de água durante cerca de 2 minutos para ajustar a temperatura da solução de digestão.
- Incubar fragmentos de tecidos cardíacos, a 37 ° C com agitação suave durante 20-30 minutos (por exemplo, agitador a 37 ° C, definida como não mais do que 60 rpm). Tempos de digestão pode depender muito mistura de enzimas e número de lote Cuidado:. Períodos de incubação mais longos ou concentrações mais elevadas de enzimas pode reduzir a viabilidade celular.
Comentário técnico: Recomendamos o uso de uma mistura de colagenase / dispase de Roche (Ref. ª: 10269638001), que tem muito pouca variabilidade de lote para lote. A enzima clássico para o isolamento de cardiomiócitos de rato é tripsina e / ou colagenase tipo II 3,16-20 disponível a partir de Worthington (Cat No CLS-2). No entanto, o desempenho da colagenase II podem diferir substancialmente de lote para lote. Worthington normalmente permite o teste de vários lotes de colagenase para otimizar os tempos de digestão enzimática e uso. Alternativamente, Worthington vende um kit de isolamento de cardiomiócitos com uma mistura de enzima de pré-testada incluído, que pode ser adaptado para o isolamento de cardiomiócitos de rato 17 (Cat No.: NCIS).
- Coloque célula-filtro estéril (40-100 mM malha de nylon) em frescos estéreis de 50 ml de tubo falcon cônico. Coador de células pré-molhado com 5 ml de L-15 suplementado com 20 mM de BDM. Tritura-se fragmentos do tecido gentilmente através de um pré-humedecido de 10 ml de cultura de células de pipeta para cerca de 10-20 vezes. Os fragmentos de tecido deve dispersar principalmente durante este passo, libertando as células em suspension (Figura 1H).
- Vamos maiores fragmentos de tecido de sedimentos e sobrenadante transferência contendo células suspensas em tubo cônico fresco através de células-filtro (Figura 1I).
- Re-suspender os fragmentos de tecido não digeridas em 5 ml de meio de digestão e incubar durante um adicional de 5-10 minutos a 37 ° C com agitação suave.
- Depois de continuar a digestão dos fragmentos de tecido restantes, gentilmente triturar tecido por 10-20 vezes e adicionar tubo contendo células cônicas a partir do primeiro digerir através de filtro de células. Lavar células-filtro com 5 ml de L-15 suplementado com 20 mM de BDM para permitir a passagem de todas as células digeridos.
- Centrifugado tubo cónico contendo cardiomiócitos em suspensão durante 5 minutos a 300 rpm (aprox. 50-100 xg). Retirar o sobrenadante (contendo principalmente fibroblastos e células endoteliais), e re-suspensão da pelota celular em 10 ml de meio de placagem.
- Células da placa em 10 centímetros de células prato de cultura (Figura 2A) e incubar durante 1H -3 em cultura de células incubadora. Este passo de pré-plaqueamento remove os fibroblastos e as células endoteliais (Figura 2B), que irá aderir ao prato de cultura de células não revestido (Figura 2C).
- Após incubação, lavam cardiomiócitos não aderentes de 10 centímetros prato de cultura (re-suspender as células pipetando repetidamente o meio de plaqueamento em cima do prato), e as células ressuspensas transferência para um tubo Falcon de centrífuga estéril cónica (15 ml ou 50 ml).
Opcional: Repita o passo de pré-chapeamento para remover fibroblastos adicionais a partir de células-suspensão. Se desejado, as células de fibroblastos e endoteliais aderentes podem ser ainda cultivadas. - Contagem de células (por exemplo, usando Neubauer hemocitômetro, tripan exclusão do azul de coloração 21).
- Células da placa em colágeno revestido placas de cultura de células com uma densidade de cerca de 1,5 x 10 5 células por cm 2 (Figura 2D, ver também comenta na Tabela 1 na chapariae revestimento).
Coloque os pratos em cultura de células incubadora e deixar em repouso por 12-18 horas para permitir a aderência e disseminação de cardiomiócitos.
Dia 3 - Cultura de cardiomiócitos neonatais
- Prepare meio de manutenção e Pré-aquecer em 37 ° C banho-maria. Consulte a Tabela 1 para a adição de inibidores da proliferação ou agentes cronotrópicos, ou o processo para a transfecção lipossómica de cardiomiócitos neonatais de rato.
- Um dia após o plaqueamento, cardiomiócitos deveria ter aderido à placa de cultura de células e de forma otimizada começar a se contrair espontaneamente (Figura 2E, 2F; Suplementar filme S2; consulte a Tabela 2 para problemas comuns durante o procedimento de isolamento / cultura). Substitua chapeamento meio com meio de manutenção, e da cultura por mais 1-5 dias. Mudança de meio, conforme necessário.
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Representative Results
Usando este protocolo, foram isoladas a partir de 8 corações um dia de idade ratos neonatal (Figuras 1A, 1B, Suplementar filme S1). Após a lavagem e picagem dos corações com a tesoura (Figuras 1C-1F), fragmentos de tecido foram pré-digeridas em meio de isolamento durante a noite a 4 ° C com agitação suave. Após a pré-digestão (Figura 1G), transferimos os fragmentos de tecidos em meio de digestão acabado de fazer, e incubou-se os fragmentos de tecido durante 20 minutos a 37 ° C com agitação suave. A suspensão celular resultante (Figura 1H), foi filtrada através de um filtro celular (Figura 1G). Após centrifugação, as células peletizadas foram novamente suspensas em 8 mL de meio de placagem e preplated num prato de cultura de 10 centímetros de células (Figura 2A), e cultivadas durante 2 horas para permitir a fixação dos fibroblastos cardíacos e células endoteliais (Figuras 2b, 2c). Células que não ligam rapidamente foram resuspenso no meio de plaqueamento. 10 ul da suspensão de células contendo cardiomiócitos foi pipetteted para um tubo eppendorf e coradas com uma solução de azul de tripano, em uma proporção de 1:1. As células foram contadas utilizando um contador de células automatizado, o que resulta em cerca de 5,1 x 10 5 células vivas / mL de meio de plaqueamento. Após a contagem, as células foram plaqueadas em quatro 30 milímetros de colagénio revestidas placas de cultura celular (2 ml por placa), o que resulta em cerca de 1 x 10 6 células plaqueadas por placa (1,4 x 10 5 células / cm 2 e a figura 2D). 18 horas após o plaqueamento, os cardiomiócitos foram ligados às placas de cultura revestidas de colagénio celular (com aproximadamente 70% de confluência) e começou a contrair espontaneamente (Figura 2E, Supplemental filme S2). Subsequentemente, os cardiomiócitos foram tanto utilizados para a transfecção lipossómica (ver Tabela 1) ou as células foram directamente transferidos do plaqueamento em meio de manutenção (Figura 2F) e cultivadas durante mais 3 dias. Após a cultura, os cardiomiócitos foram brevemente lavado em 1x PBS, fixadas durante 5 min em PFA a 4% / PBS e processadas para imunof luorescência como descrito em uma das nossas recentes publicações 22. Os resultados representativos que descrevem coradas imunologicamente culturas de cardiomiócitos não transfectadas e transfectadas são mostrados nas Figuras 2G e 2H, respectivamente. Os cardiomiócitos neonatais cultivadas exibir a citoarquitetura esperado, como é evidente a partir da visualização das miofibrilas (sinal vermelho na Figura 2G) e as estruturas de disco-como intercalados (sinal verde na Figura 2G). Eles também são passíveis de transfecções transientes, como pode ser visto na Figura 2H (sinal verde é a proteína transf; contracoloração sinal vermelho de miofibrilas, utilizando um anticorpo de alfa-actinina sarcomérica).
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Figura 1. Isolamento do tecido cardíaco de ratinhos neonatais. A) O coração é cuidadosamente removido do tórax, utilizando um fórceps curvo (ver também Suplementar filme S1). B) Os corações isolados de 8 neonatos são lavadas em 1x PBS (sem Ca 2 +, Mg 2 +) suplementado com 20 mM BDM no gelo. C) Corações são transferidos para uma gota de meio de isolamento. DE) Picar de corações neonatais utilizando tesoura curva. F) Transferência do tecido cardíaco picada com uma pipeta de pré-molhada. G) tecido cardíaco Predigested após incubação durante a noite a 4 ° C. H) cardiomiócitos em suspensão, depois de 20 min de digestão e trituração. Tecido cardíaco não digerida, se acumula no fundo do tubo. I) A suspensão de isolado cardiomyocytes é filtrada através de um filtro de células.
Figura 2. Cultura de cardiomiócitos neonatais de rato e representativas das imagens de imunofluorescência. UM) chapeamento de células isoladas no início da pré-plaqueamento passo. B) fibroblastos cardíacos e células endoteliais começam a aderir à placa de cultura de células não revestidos após 1-3 hr da cultura durante o pré-chapeamento passo. C) Após ressuspensão dos cardiomiócitos não aderentes, remanescentes fibroblastos cardíacos e células endoteliais pode ser mais culto, se desejar. D) chapeamento de isoladas e purificadas cardiomiócitos neonatais do mouse em colágeno revestido pratos de cultura celular . E) Depois de 18 horas em cultura, cardiomiócitos aderir ao d revestidoparóquias, e de forma otimizada começar contrações espontâneas (ver também S2 filme Suplementar). F) Substituir o meio de chapeamento com meio de manutenção remove as células mortas da cultura. A)-F) barra de escala de 0,2 mm. G) imagem imunofluorescência Representante dos cardiomiócitos de rato neonatal, corados com anticorpos contra myomesin (Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa, MMAC myomesin B4, em vermelho) e beta-catenina (Sigma, Cat.-No .: C2206, em verde). Barra de escala de 10 mM. H) imagem imunofluorescência Representante transfectadas cardiomiócitos neonatais do mouse com a proteína expressa GFP-tagged em verde (GFP-titina-N2B fragmento), e alfa-actinin (Sigma, Cat.-No.A-7811) em vermelho . Barra de escala de 20 um. Um método para a transfecção e coloração imunológica utilizados em 2G) e 2H) podem ser encontrados na Tabela 1, e é resumida em uma das nossas recentes publicações 22.
Suplementar filme S1. Suplementar filme S2. Clique aqui para ver filme suplementar . Tabela 1. Otimização das condições de revestimento e de cultura, lipossomal transfecção. Tabela 2. Solução de problemas. Muitos fatores podem afetar o isolamento bem sucedido e cultura de células primáriass. Por favor, consulte os manuais, tais como "Cultura de Células Animais", de Ian Freshney 21, como introduções gerais em técnicas básicas de cultura de células. As possíveis causas para problemas no isolamento e cultivo de procedur cardiomocytes neonatais rato que encontramos na maioria das vezes são listados nesta tabela. Pré-chapeamento Pré-plaqueamento das células após o isolamento elimina grandemente os fibroblastos cardíacos e células endoteliais a partir da mistura de células inteiras. Um único passo de pré-plaqueamento remove cerca de 50-80% de não-cardiomiócitos a partir da população de células. Repetição de pré-plaqueamento mais do que duas vezes, bem como dos tempos de pré-plaqueamento mais longos do que 3 horas não é recomendada, devido à perda adicional de miócitos cardíacos. Substituição de pré-plaqueamento com Percoll-gradiente 23,24 pode melhorar a pureza da população celular de cardiomiócitos. Revestimento e substrato de cultura de células Revestimento de pratos de cultura celular com excomponentes da matriz intracelular (ECM), como colágeno, fibronectina, laminina, misturas complexas de ECM (ie Matrigel 25,26) ou substratos artificiais (polímero de silicone ou seja, 27, organosilano 28) influencia positivamente a adesão de cardiomiócitos, a viabilidade celular ea célula se espalhando durante a fase inicial do chapeamento e para o período subsequente cultura. Em particular, a cultura de cardiomiócitos em substratos de vidro requer o revestimento da superfície com os componentes da ECM para conseguir a aderência adequada de cardiomiócitos.
Testamos revestimento de cultura de células de plástico e de vidro substratos tratados com uma variedade de componentes da matriz extracelular, incluindo a solução de colagénio a 0,1% (Sigma C-8919), tipo 3 mg / mL de colagénio uma solução (Advanced Biomatriz, PureCol), solução de gelatina a 1% ( Sigma G9391; dissolvido em H 2 O, autoclavada), soluções de laminina (Sigma L4544), ou misturas de ECM complexos derivados de coração de suíno 29 ou 30 fibroblastos cardíacos. Cultu celularre pratos foram incubados com as soluções de ECM para um mínimo de 1 hora a durante a noite na incubadora de cultura de células, e após a remoção de ECM seco no fluxo laminar de cultura celular capa. Soluções de ECM podem ser reutilizadas muitas vezes (10-20 vezes) se a esterilidade e a integridade da proteína durante a armazenagem prolongada de ECM é mantida (por exemplo, armazenamento a 4 ° C ou congelados). Cuidado, devido à natureza ácida do alguns dos tampões utilizados para dissolver as proteínas da MEC, a lavagem de pratos de cultura com 1x PBS após o revestimento pode ser necessária antes do plaqueamento das células. Chapeamento técnica e densidade Dependendo ensaios seguintes, as concentrações de células óptimas para revestimento deve resultar em monocamadas confluentes próximos dos cardiomiócitos. Chapeamento de cardiomiócitos em altas concentrações resultar em agregados cardiomiócitos multicamadas e baixa homogeneidade, enquanto que baixas concentrações reduz a viabilidade das células e resulta em cardiomiócitos, único, isolado, desprovido de contac-célula especializadats (estruturas em forma de disco intercalados). Quando pipetar células para chapeamento ter em mente que os cardiomiócitos são bastante grandes e pesados, e tendem a concentrar-se na parte inferior do tubo falcon. A ressuspensão das células entre as etapas de revestimento garante uma distribuição uniforme das células ao longo de seus pratos. Quando as células de placagem mover pratos em forma de um "8", para evitar a concentração das células para o centro do prato. A confluência ideal de cardiomiócitos neonatais designado para lipossomal transfecção deve ser em torno de 70-80% no dia após o plaqueamento. Soro O uso de culturas celulares testadas fetal (ou recém-nascido) de soro de bovino e soro de cavalo no meio de revestimento é necessária para a viabilidade da célula e adesão de cardiomiócitos durante o passo de chapeamento. A qualidade do soro utilizado pode ser um dos passos críticos durante o processo de revestimento / cultura. A suplementação do meio de manutenção com baixas quantidades de soro é opcional, no entanto, pode muito improve a duração do tempo de cultura.
Cuidado: a adição de soro podem alterar significativamente as vias de sinalização bioquímicas em cardiomiócitos em cultura e pode ser julgado com base em parâmetros experimentais, hipótese e posterior interpretação dos resultados. Culturas isentas de soro de cardiomiócitos foram descritos 10,31, e podem evitar a distorção dos resultados, devido a factores de crescimento de desconhecidos existentes no soro. Inibidores da proliferação Cardiomiócitos terminalmente diferenciadas normalmente não passam por divisão celular. No entanto, a adição de inibidores de proliferação, tais como 10 uM AraC (citosina-BD-arabino-furanósido cloridrato; Sigma C6645) para o meio de manutenção é altamente recomendado para evitar a proliferação de fibroblastos cardíacos e células endoteliais. Mesmo com a adição de passos de pré-plaqueamento para reduzir a população de fibroblastos cardíacos e as células endoteliais, os fibroblastos restantes serão submetidos a proli celularesferation e alterar significativamente a população de células-cultivadas ao longo do tempo.
Atenção: dependendo de fatores genéticos e do tempo de ponto isolamento, cardiomiócitos embrionários e neonatal do mouse ainda podem ter potencial proliferação 23,32,33. Uso de AraC devem ser julgados de acordo com parâmetros experimentais, hipótese e interpretação dos resultados. A adição de agentes cronotrópicos A suplementação do meio de manutenção com agentes 34, como a fenilefrina (0,1 mM, preferencialmente para cardiomiócitos de ratos neonatos; Sigma P6126) ou isoproterenol (1 mM, preferencialmente para cardiomiócitos neonatais do mouse; Sigma I6501) aumenta sarcomerogenesis, espalhando dos cardiomiócitos no placa, bem como o batimento espontâneo das células. No entanto, a adição destes agentes devem ser ponderados em relação aos parâmetros de ensaio desejados (por exemplo, adição pode enviesar comportamento contráctil e parâmetros bioquímicos). A transfecção Liposomal transfecção de DNA / RNA em cardiomiócitos neonatais do mouse é muito dependente do tempo de ponto-transfecção, reagentes de transfecção, a densidade de cultura, concentração de DNA / RNA e construção de DNA usado. Foi testada uma variedade de reagentes de transfecção de lipossomas e encontrou escolta III (Sigma) e Lipofectamine 2000 (Invitrogen) aplicável. Transfectar as células 24 horas após o plaqueamento, substituindo o chapeamento meio 2 h antes da transfecção com o meio de manutenção isento de antibióticos. Para a transfecção de cardiomiócitos neonatais cultivadas em pratos de 30 mm, misturar 1-2 ug de ADN com 200 ul de DMEM em um tubo eppendorf estéril e adicionar 4 mL de escolta III para a mistura de ADN diluída. Misturar suavemente e incuba-se durante um mínimo de 5 minutos na capa estéril para permitir ADN / lipossoma a formação do complexo. Substituir o meio de manutenção de antibióticos livres com meio de manutenção de 800 antibióticos livres ul frescos e adicione a mistura de ADN / lipossoma para as células. Incubar as células em cu célulaincubadora LTURE e substituir por meio de manutenção fresco padrão após 24 horas. Um resultado representativo para transfectadas com sucesso cardiomiócitos neonatais do mouse é mostrada na Figura 2H. A transfecção utilizando precipitação com cálcio do DNA também é possível. A transfecção de cardiomiócitos neonatais do rato é mais difícil em comparação com cardiomiócitos de ratos neonatos, com eficiências típicas de transfecção que vão 1-20%. Os vectores virais são necessários para atingir uma maior eficiência de 35-37 (por exemplo: adenovírus, vírus adeno-associado, lentivírus). Eletroporação de cardiomiócitos neonatais está em nossas mãos inadequadas para a entrega de DNA / RNA, no entanto vários relatórios mostram sucesso usando eletroporação de embriões e neonatais cardiomiócitos 38,39. Em um recente artigo 38, Djurovic et al. Resumir vários métodos de transfecção, as taxas de sucesso, bem como suas vantagens e desvantagens. Passaging congelamento / Storaiva Passaging dos cardiomiócitos não é recomendado 1. Congelamento de cardiomiócitos neonatais isoladas para um armazenamento prolongado é extremamente difícil e não é recomendável devido à baixa eficiência e baixas taxas de recuperação. Várias empresas oferecem médio congelamento especializado para as culturas humanas cardiomiócitos primários (por exemplo celprogen, gato. No. M36044-15FM), que também podem ser adequados para a criopreservação de cardiomiócitos neonatais do rato, no entanto condições pode precisar de ser otimizado. A passagem em sucesso e criopreservação de cardiomiócitos atriais tenha sido descrita em um modelo de ratinho transgénico 32. Não há células viáveis ou aderentes um dia após o plaqueamento - Reduzir a concentração de enzima e / ou tempo de digestão
- Mistura de enzimas mudança
- Chasoro ESL para chapeamento médio
- Médio e / ou o tipo de placas de cultura de células mudança ECM / revestimento
- Adicionar BDM 20 mM de meios de isolamento / digestão
- Verificar se há contaminação de células Baixo rendimento celular - Aumentar o tempo de digestão e / ou concentração de enzima
- Tempo de aumento de centrifugação / velocidade durante procedimento de isolamento
- Período de aumento de trituração Confluência de células em cultura é muito baixa / alta; desigual chapeamento - Contagem de células durante o processo de isolamento e ajustar o número de células / prato durante chapeamento
- Ajustar concentração chapeamento
- Ressuspender pellet celular com cuidado após a centrifugação e antes do plaqueamento por pipetagem repetida (dia 2 passo 13), certifique-se não-aglomerados de células visíveis permanecem Nenhuma célula batendo - Adicionar agentes cronotrópica ao meio de manutenção (por exemplo: fenilefrina, isoproterenol)
- Substituir médio
- Check para elevado número de fibroblastos cardíacos células / endoteliais Elevado número de fibroblastos - Adicionar passo adicional preplating durante procedimento de isolamento
- Adicionar inibidor da proliferação de meio de manutenção (Tabela 1) Muitas células mortas - Substituir o meio de cultura celular
- Reduzir a concentração de enzima e / ou tempo de digestão durante procedimento de isolamento
- Célula cheque cultura incubadora (CO 2, temperatura, umidade)
- Verificar se há contaminação Contaminação - Aderir às condições de trabalho de cultura de células estéril 21
- Substituir médio, use nova solução de penicilina / estreptomicina
- Superfície esterilizar ratos neonatal com solução de etanol a 75%
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Discussion
O uso de modelos animais para estudar doenças cardíacas se tornou padrão na pesquisa cardiovascular. Mais perto caracterização bioquímica desses modelos (ou seja, estudando as respostas diretas de células cardíacas a estímulos bioquímicos ou biomecânicos) normalmente requer o isolamento de tecidos cardíacos ou cardiomiócitos. Estudos que investigam as respostas fisiológicas do coração ex vivo (por exemplo, a acetilcolina 40, ou em cenários de isquemia-reperfusão 41) geralmente utilizam corações inteiros perfusão-Langendorff 42,43, enquanto as culturas de explante 44,45 de fragmentos de tecido cardíaco permitem investigações de cardiomiócitos em um ambiente do tecido tridimensional. No entanto, a cultura de tecidos de explante pode impedir a difusão de nutrientes, podendo gerar um conjunto de necrose no interior do núcleo do tecido. Além disso, os cardiomiócitos são imóveis dentro do tecido, portanto, a migração de células para fora de explantes é apenas observed para não cardiomiócitos, como fibroblastos ou células progenitoras cardíacas putativos 44. Investigando o comportamento do desenvolvimento, células-biológica, bioquímica e biofísica de cardiomiócitos necessários, portanto, o estabelecimento de isolamento e procedimentos de cultivo. Os primeiros protocolos para o isolamento e cultura de cardiomiócitos de mamíferos utilizam ratos recém-nascidos 1,2. No entanto, o aumento do mouse como um sistema modelo para estudos genéticos (ou seja, geneticamente modificado knock-in ou knock-out mice) exigiu a adaptação do isolamento metodologias comprovadas e cultura. Infelizmente, o isolamento de cardiomiócitos neonatais rato é particularmente desafiador em comparação com a dos cardiomiócitos de ratos neonatos utilizadas mais tradicionalmente. O protocolo apresentado descreve um método confiável e robusto otimizado para o isolamento e cultura de cardiomiócitos neonatais do mouse. Nós descrevemos os passos necessários para a extração do tecido inicial, para a dissociação de umª purificação de cardiomiócitos a partir de fibroblastos cardíacos e células endoteliais, e para as condições de revestimento e de cultura. Embora o protocolo oferece uma abordagem básica para o isolamento e cultura de cardiomiócitos neonatais de rato em condições normais, que pode ser facilmente adaptado para o isolamento e cultura de cardiomiócitos de ratos neonatais, bem como para os tipos específicos de ensaios subsequentes: por exemplo, a cultura de células isoladas em membranas flexíveis (por exemplo, placas Bioflex cultura) para investigar as propriedades biomecânicas, cultura em pratos com fundo de vidro (Mattek) para imagens de células vivas, ou cultura de cardiomiócitos em xCELLigence cardio e-placas (Acea, Roche, Cat.-No.: 06417051001) para estudar os efeitos das drogas sobre as funções contráteis. Além disso, oferecemos opções para a otimização do processo de isolamento e cultura e discutir fontes para possíveis problemas e suas soluções. Assim, este protocolo deve ajudar os pesquisadores a examinar um up-to-date, altamente reprodutível emétodo barato para preparar neonatais culturas rato cardiomiócitos.
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Disclosures
Nenhum.
Acknowledgments
Somos gratos ao Prof emérito Jean-Claude Perriard e Evelyn Perriard (Instituto Federal Suíço de Tecnologia, Suíça) para a introdução de técnicas de isolamento para rato neonatal e cardiomiócitos de rato. Gostaríamos de agradecer ao Prof Ju Chen e Prof Sylvia Evans (UCSD, EUA) para o seu apoio. Trabalho no laboratório de EE foi financiado por um MRC Carreira Estabelecimento Grant. SL é apoiado por uma K99/R00 caminho para a independência do prêmio NIH / NHLBI (HL107744). TMM foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado da American Heart Association (11POST7310066).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8 | Sigma | B-0753 | prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47. |
| Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | can be substituted with collagenase type II from Worthington |
| Collagenase type II3 | Worthington | CLS-2 | substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche |
| 1x trypsin solution (0.25%) with EDTA | cellgro | 25-053-CI | |
| 1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS | cellgro | 30-002-Cl | |
| 1x PBS (without Ca2+, Mg2+) | e,g, cellgro | 21-040-CV | |
| HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4 | cellgro | 21-022-CV | |
| DMEM high glucose | cellgro | 10-013-CV | |
| M-199 | cellgro | 10-060-CV | |
| fetal bovine serum | cellgro | 35-011-CV | cell-culture grade |
| horse serum | cellgro | 35-030-CV | cell-culture grade |
| Leibovitz L-155 | cellgro | 10-045-CV | |
| AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride) | Sigma | C-6645 | proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C |
| phenylephrine | Sigma | P-6126 | chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
| isoproterenol hydrochloride | Sigma | I-6501 | chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
| 0.1% collagen solution | Sigma | C-8919 | extracellular matrix for coating |
| 3 mg/ml collagen type 1 solution | Advanced BioMatrix | 5005-B | alternative to Sigma collagen solution |
| cell strainer | Fisherbrand | 22363548 | appropriate filter size:40 μm-100 μm |
| syringe filter 0.2 μm | Fisherbrand | 09-719C | for sterile filtration of digestion medium |
| straight scissors | Fine Sciences Tools | 91460-11 | |
| curved scissors | Fine Science Tools | 91461-11 | |
| Dumont No. 7 forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| perforated spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | optional, for transfer of heart tissue |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | live cell staining |
| Neubauer hemocytometer | Prosource Scientific | 3500 | alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems |
| 50 ml Falcon tubes | Fisherbrand | 14-432-23 | |
| 15 ml Falcon tubes | Fisherbrand | 05-527-90 | |
| 20 ml syringe | BD Medical | 14-820-19 | |
| 10 ml serological pipette | Falcon | 357551 | |
| 30 mm cell culture dish | Nunc | 153066 | for standard culture of cardiomyocytes |
| 30 mm cell culture dish, glass bottom | MatTek | P35G-0-10-C | for live cell imaging with inverted microscope |
| 10 cm cell culture dish | Nunc | 172958 | for preplating |
| Escort III | Sigma | L3037 | for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000 |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies, Invitrogen | 52887 | substitute for Escort III |
Buffers and media:
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References
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