Summary
الأولية الثقافات الماوس cardiomyocyte هي واحدة من الأدوات المحورية للتحقيق في منظمة myofibrillar وظيفة. يصف بروتوكول التالية العزلة وثقافة العضلية الأولية من قلوب الماوس حديثي الولادة. ويمكن استخدام الثقافات cardiomyocyte الناتجة لاحقا لمجموعة متنوعة من النشاط الحيوي، فحوصات البيوكيميائية وخلايا البيولوجية.
Abstract
لطالما استخدمت العضلية الولدان مثقف لدراسة myofibrillogenesis وظائف myofibrillar. العضلية مثقف تسمح للتحقيق سهلة والتلاعب من المسارات البيوكيميائية، وتأثيرها على خصائص النشاط الحيوي للضرب عفويا العضلية.
يصف بروتوكول 2 يوما بعد العزلة وثقافة العضلية الماوس حديثي الولادة. وتبين لنا كيفية تشريح بسهولة قلوب من حديثي الولادة، فصل الأنسجة العضلية القلبية وإثراء من القلب خلية السكان. نناقش استخدام انزيم يمزج مختلفة لخلية التفكك، وآثارها على الخلية قدرتها على البقاء. والعضلية معزولة يمكن استخدامها في وقت لاحق لمجموعة متنوعة من المورفولوجية، الكهربية، والكيمياء الحيوية، المقايسات خلية بيولوجية أو النشاط الحيوي. نحن الأمثل لبروتوكول لمتانة والتكاثر، باستخدام الحلول الوحيدة المتاحة تجاريا والتي تختلط انزيم SHآه القليل الكثير إلى الكثير تقلب. نحن أيضا معالجة المشاكل المشتركة المرتبطة العزلة وثقافة العضلية، وتوفر مجموعة متنوعة من الخيارات لتحقيق أقصى استفادة ممكنة من العزلة والثقافة الشروط.
Introduction
أقرب تقارير عن التفكك ناجحة وثقافة خلايا القلب القوارض يعود تاريخها الى عام 1،2 في عام 1960. حتى ذلك الحين، لاحظت Harary وفارلي أن العضلية مثقف "قد توفر نظاما فريدا لدراسة متطلبات انقباض الدوري [ويجوز] توفير وسيلة لتحديد مساهمة مختلف المسارات الأيضية لل[الضرب] العملية". على الرغم من Harary وفارلي العضلية معزولة ومثقف من صغار الفئران، والبروتوكول الأصلي قد تم تكييفها وتعديلها من قبل العديد من العلماء على مر السنين، لم يتغير كثيرا من العزلة وزراعة الإجراء العام. ومع ذلك، والانزيمات أفضل 3 حلول موحدة 4،5، وإضافة قناة عكسها والميوسين أتباز المانع BDM لحماية الخلايا أثناء إجراء العزل 6-9 قد تحسنت بشكل ملحوظ الخلوي العائد والجدوى.
الكبار مقابل cardiomyo حديثي الولادةcytes
العضلية معزولة ومثقف من الفئران او الجرذان حديثي الولادة لديها العديد من المزايا ثقافات العضلية الكبار. قبل كل شيء، وإجراء العزل لحديثي الولادة الماوس أو الفئران القلوب هو أسهل وأقل تكلفة، إذا ما قورنت إلى عزل العضلية من الماوس الكبار أو الفئران 10. حديثي الولادة العضلية هي أقل حساسية بكثير لإعادة إلى المتوسطة التي تحتوي على الكالسيوم بعد التفكك، وزيادة كبيرة الخلوي العائد. ميزة كبيرة أخرى هي أن العضلية الماوس حديثي الولادة الخضوع لفقد التمايز أسرع - دورة عودة التمايز الذي ينتج عادة في ضرب الخلايا عفويا 20 ساعة بعد الطلاء، في حين تتطلب العضلية الكبار عادة للحث على سرعة الانكماش. العضلية حديثي الولادة هي أيضا أكثر بسهولة transfectable مع أساليب الليبوسومال ترنسفكأيشن، في حين العضلية الكبار تتطلب النواقل الفيروسية للتسليم ناجحة من الحمض النووي المعدل وراثيا. وعلى النقيض من cardiomyocyte حديثي الولادةق، ثقافة العضلية القوارض الكبار 11-13 يسمح للتحقيقات من تدهور myofibrillar وإعادة في نهاية المطاف من جهاز مقلص. هذه التغييرات شكلية متميزة في العضلية الكبار تحدث على مدى فترات من 1-2 أسابيع. ويرافق عودة التمايز من خلال دورة reexpression من البرنامج الجيني الجنين، وبالتالي محاكاة التغيرات المرضية التي لوحظت في الإنسان بعضلة القلب 14 - وفقد التمايز. ميزة أخرى من الفئران العضلية الكبار على ثقافة العضلية حديثي الولادة هو القدرة على ثقافة هذه الخلايا لفترات طويلة من الزمن.
الفئران مقابل العضلية الماوس
العزلة وثقافة العضلية الفئران حديثي الولادة لديها بعض الفوائد من خلال تلك الماوس العضلية حديثي الولادة، بما في ذلك عائدات أعلى من خلايا قابلة للحياة وزيادة معدلات ترنسفكأيشن. ومع ذلك، فإن استخدام واسعة من نماذج الماوس المعدلة وراثيا لعلاج أمراض القلب (على سبيل المثال <م /> وليم العضلات بروتين بالضربة القاضية الماوس كنموذج للتمدد عضلة القلب 15) قد أدى إلى التكيف من إجراء العزل لالعضلية المستمدة من الفئران حديثي الولادة. على الرغم من أن البروتوكولات المستخدمة لعزل الجرذان والفئران حديثي الولادة العضلية هي متطابقة تقريبا، يجب توخي الحذر أكبر في اختيار مزيج انزيم المناسبة لهذا الأخير. في الواقع، العضلية الماوس حديثي الولادة عادة ما تكون أكثر عرضة للoverdigestion، مما أدى إلى انخفاض العائد الخلية وقدرتها على البقاء. علاوة على ذلك، ينبغي تعديل كثافة الطلاء، لأن العضلية المستمدة من الفئران حديثي الولادة هي أصغر نوعا ما مقارنة مع الخلايا المشتقة من قلوب الفئران حديثي الولادة.
مع العديد من الاستخدامات للتحقيق في، الكهربية، والكيمياء الحيوية، المعلمات الخلية البيولوجية والمورفولوجية النشاط الحيوي وكذلك لعملية myofibrillogenesis، أصبحت العضلية الولدان مثقف واحد من أكثر الأنظمة تنوعا لدراسةوظائف الخلية القلبية في المختبر. الخطوة الأولى لمقايسة ناجحة ومع ذلك، يعتمد على منهجية سهلة وموثوقة لعزل العضلية الماوس حديثي الولادة. بروتوكول لدينا توجه منهجيته من مصادر عديدة، وكان الأمثل لاستنساخ ومتانة. نناقش العوامل التي تؤثر cardiomyocyte الغلة وقدرتها على البقاء، وتوفير مجموعة متنوعة من الخيارات لتحقيق أقصى استفادة ممكنة من العزلة والثقافة الشروط.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يصف الإجراء التالي ل16،17 بروتوكول لمدة يومين للعزلة وثقافة العضلية الماوس حديثي الولادة. كل الحلول هي معقمة أو معقمة تصفيتها. يتم تعقيم جميع الأدوات التي كتبها تعقيم السطح مع 75٪ من الإيثانول. باستثناء لاستخراج الأنسجة الأولية، يتم تنفيذ جميع الخطوات في العقيمة خلية تدفق الصفحي هود الثقافة. ويهدف هذا البروتوكول لعزل قلوب الماوس حديثي الولادة 1-2 القمامة (ق) - ما يقرب من 5-14 الجراء، ولكن يمكن تكييفها لأحجام أكبر القمامة والفئران حديثي الولادة العضلية. استخدام الوسائط على نطاق و/ انزيم حسب الاقتضاء.
للعمل مع القوارض الولدان، والرجوع إلى المبادئ التوجيهية الجامعة المحلية والقواعد المنصوص عليها من قبل الهيئة التشريعية و / أو برامج رعاية الحيوان، والتمسك بروتوكول حيوانك افق مؤسسيا. وقد وافق كل الأساليب المذكورة في هذا البروتوكول من قبل لجنة جامعة كاليفورنيا في سان دييغو المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC)، والتمسك المدرسيهاللوائح راؤول والدولة.
اليوم 1.
1. عزل أنسجة القلب من الفئران حديثي الولادة
- إعداد 50 مل من برنامج تلفزيوني 1X (دون كا 2 +، والمغنيسيوم 2 +) تستكمل مع 20 ملي BDM 6-8، وتفريق في اثنين من الأطباق البكتيرية العقيمة وضعت على الجليد.
- تحضير 10 مل من العزلة المتوسطة في 50 مل العقيمة المخروطية أنبوب فالكون. إبقاء جميع الحلول على الجليد. تعقيم مقص (واحد المنحني، مستقيم واحد)، وملقط (المنحني، دومون NO.7).
- يتم شطف الفئران حديثي الولادة 1-3 أيام القديمة بسرعة في 75٪ من محلول الإيثانول في التعقيم السطح. ومقطوعة الرأس الجراء باستخدام مقص العقيمة (على التوالي)، ويتم فتح الصدر على طول عظمة القص للسماح بالوصول إلى تجويف الصدر والقلب (الشكل 1A، فيلم التكميلي S1).
تعليق فني: الفئران حديثي الولادة مضى عليها أكثر من 3 أيام يمكن استخدامها، ولكن ينتج في الخلايا أقل قابلة للحياة 2. - يتم استخراج قلوب منالجسم مع مقص منحني ونقل على الفور في طبق البكتيرية التي تحتوي على برنامج تلفزيوني 1X (دون كا 2 +، والمغنيسيوم 2 +) مع 20 ملي BDM، على الجليد. يتم تنفيذ كافة الخطوات التالية في العقيمة خلية غطاء الثقافة.
- إزالة أنسجة الرئة، سفن أكبر حجما (والأذينين، إذا رغبت في ذلك). قلوب يغسل في برنامج تلفزيوني 1X الحل (دون كا 2 +، والمغنيسيوم 2 +) مع 20 ملي BDM (على الجليد) لإزالة الدم. نقل غسلها القلوب من أول طبق في طبق البكتيرية الثانية تحتوي على برنامج تلفزيوني 1X (دون كا 2 +، والمغنيسيوم 2 +) مع 20 ملي BDM (على الجليد) باستخدام ملقط أو ملعقة مثقوبة (الشكل 1B).
- نقل تنظيفها / تغسل قلوب إلى قطرة من العزلة المتوسطة (حوالي 250 ميكرولتر؛ الشكل 1C) في طبق البكتيرية الثالث (على الجليد) واستخدام مقص منحني لتخطر على القلوب الى قطع صغيرة (حوالي 0.5-1 مم 3، أو أصغر؛ الرقم 1D، 1E).
- نقل القلوب المفروم إلى المخروطيةأنبوب تحتوي على 10 مل من المتوسط العزلة (على الجليد)، واحتضان مع الإثارة لطيف في 4 درجات مئوية خلال الليل.
اليوم 2.
2. الأنسجة الأنزيمية الهضم وتصفيح خلايا
- في وزن 15 ملغ من خليط كولاجيناز / dispase (روش)، وحل مزيج الانزيم في 10 مل L15 المتوسطة 5 تستكمل مع 20 ملي BDM (متوسطة الهضم). تصفية العقيمة المتوسطة الهضم في هود زراعة الخلايا في العقيمة 50 مل أنبوب فالكون الجديدة.
- تحضير 30 مل L-15 متوسطة تستكمل مع 20 ملي BDM، وتصفيح المتوسط.
- لوحات معطف خلية الثقافة مع الحل الكولاجين (سيغما C-8919) مدة لا تقل عن 1 ساعة. إزالة حل الكولاجين (يمكن إعادة استخدامها) والكولاجين المغلفة أطباق خلية ثقافة جافة معقمة في تدفق الصفحي خلية غطاء الثقافة.
- إزالة أنبوب مخروطي يحتوي على قلوب مهضوم من 4 درجات مئوية. وينبغي تجميع شظايا الأنسجة (الشكل 1G). السماح للشظايا الأنسجة تغرق لالجزء السفلي من الأنبوب وإزالة طاف (تأكد من عدم تفقد أي شظايا الأنسجة؛ عادة، قد تبقى تقريبا 1 مل من المتوسط العزلة في الأنبوب). إضافة 5 مل من الهضم المتوسطة و 5 مل من L-15 تستكمل مع 20 ملي BDM إلى شظايا الأنسجة وتعليق الأوكسجين باستخدام الأكسجين أو الهواء لمدة 1 دقيقة.
- نقل أنبوب مخروطي مختومة تحتوي على شظايا أنسجة القلب في الهضم المتوسط إلى 37 درجة مئوية حمام الماء لمدة 2 دقيقة لضبط درجة الحرارة من الحل الهضم.
- احتضان شظايا أنسجة القلب عند 37 درجة مئوية مع الإثارة لطيف لمدة 20-30 دقيقة (على سبيل المثال شاكر عند 37 درجة مئوية، لتعيين ما لا يزيد عن 60rpm). قد تعتمد إلى حد كبير على الهضم مرات خليط انزيم والكثير عدد تحذير: فترات حضانة أطول أو تركيزات أعلى الانزيم قد يقلل من بقاء الخلية.
تعليق فني: نوصي استخدام خليط كولاجيناز / dispase من روش (رقم الكاتالوج: 10269638001) الذي يحتوي على القليل جدا تقلب الكثير إلى الكثير. الانزيم الكلاسيكية لعزل العضلية الماوس التربسين و / أو نوع كولاجيناز الثاني 3،16-20 المتاحة من رثينجتون (القط لا CLS-2). ومع ذلك، أداء كولاجيناز الثاني قد تختلف جوهريا عن الكثير إلى الكثير. ورثينجتون يسمح عادة لاختبار الكثير عدة مرات كولاجيناز لتحسين الهضم وانزيم الاستخدام. بدلا من ذلك، ورثينجتون تبيع العزلة عدة cardiomyocyte مع خليط الانزيم اختبار مسبق شملت التي يمكن تكييفها لعزل العضلية الماوس 17 (القط رقم: NCIS).
- وضع العقيمة خلية مصفاة (40-100 ميكرون شبكة النايلون) في جديدة معقمة 50 مل المخروطية أنبوب الصقر. مصفاة الخلية قبل الرطب مع 5 مل L-15 تستكمل مع 20 ملي BDM. شظايا الأنسجة يسحن بلطف باستخدام المبللة قبل 10 مل خلية ثقافة ماصة لحوالي 10-20 مرة. يجب شظايا الأنسجة تفريق معظمها خلال هذه الخطوة، والإفراج عن الخلايا في suspensioن (الشكل 1H).
- السماح شظايا الأنسجة أكبر الرواسب ونقل طاف تحتوي الخلايا علقت في أنبوب مخروطي جديدة من خلال خلية مصفاة (الشكل 1I).
- اعادة تعليق شظايا الأنسجة غير مهضوم في 5 مل الهضم المتوسطة واحتضان ل5-10 دقيقة إضافية عند 37 درجة مئوية مع الإثارة لطيف.
- بعد الهضم المستمر لتبقى شظايا الأنسجة، يسحن بلطف الأنسجة لمدة 10-20 مرات، وإضافة إلى أنبوب مخروطي يحتوي على خلايا من أول هضم من خلال مصفاة الخلية. شطف الخلايا مصفاة مع 5 مل L-15 تستكمل مع 20 ملي BDM للسماح بمرور جميع خلايا هضمها.
- أنبوب مخروطي يحتوي نباذة العضلية وقف التنفيذ لمدة 5 دقائق في 300 دورة في الدقيقة (حوالي 50-100 x ج). إزالة طاف (يحتوي معظمها الخلايا الليفية والخلايا البطانية) وإعادة تعليق بيليه خلية في 10 مل تصفيح المتوسط.
- لوحة الخلايا في خلية 10 سم صحن الثقافة (الشكل 2A)، واحتضان لمدة 1-3 ساعة في الثقافة الخلية الحاضنة. هذه الخطوة ما قبل الطلاء يزيل الخلايا الليفية والخلايا البطانية (الشكل 2B)، والذي ستلتزم طبق خلية ثقافة غير المصقول (الشكل 2C).
- بعد الحضانة، وغسل العضلية غير ملتصقة من 10 سم الطبق الثقافة (اعادة تعليق الخلايا بواسطة pipetting مرارا المتوسطة الطلاء على طبق)، ونقل خلايا معلق إلى العقيمة المخروطية أنبوب فالكون الطرد المركزي (15 مل أو 50 مل).
اختياري: كرر الخطوة قبل الطلاء لإزالة الخلايا الليفية إضافية من خلايا تعليق. إذا رغبت في ذلك، يمكن أن الخلايا الليفية والبطانية تمسكا يكون أبعد مثقف. - عد الخلايا (على سبيل المثال باستخدام عدادة الكريات نويباور، التريبان الأزرق الاستبعاد تلطيخ 21).
- لوحة الخلايا في الكولاجين المغلفة أطباق زراعة الخلايا مع كثافة حوالي 1.5 × 10 5 خلايا لكل سم 2 (الشكل 2D، وانظر أيضا التعليقات الواردة في الجدول 1 على الطلاءوالطلاء).
وضع الأطباق في الثقافة الخلية الحاضنة وتترك لمدة 12-18 ساعة دون عائق للسماح لالتزام ونشر العضلية.
اليوم 3 - ثقافة العضلية حديثي الولادة
- إعداد المتوسطة الصيانة وprewarm في 37 ° C حمام الماء. الرجوع إلى الجدول رقم 1 لإضافة مثبطات انتشار أو وكلاء ميقاتية، أو إجراء ترنسفكأيشن الليبوسومال من العضلية الماوس حديثي الولادة.
- بعد يوم واحد والطلاء، ويجب العضلية انضمت إلى الطبق الثقافة الخلية وتبدأ على النحو الأمثل تلقائيا إلى التعاقد (الشكل 2E، 2F؛ التكميلي فيلم S2؛ الرجوع إلى الجدول رقم 2 للمشاكل المشتركة أثناء إجراء العزل / الثقافة). استبدال الطلاء المتوسطة مع المتوسطة والصيانة، والثقافة لمدة 1-5 أيام إضافية. تغيير المتوسطة حسب الضرورة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام هذا البروتوكول، ونحن عزل قلوب من 8 يوم واحد الفئران حديثي الولادة القديمة (أرقام 1A، 1B، خلفية فيلم S1). بعد الغسيل وتنميق قلوب مع مقص (أرقام 1C-1F)، ومهضوم شظايا الأنسجة في عزلة المتوسطة أكثر من ليلة في 4 درجات مئوية مع الإثارة لطيف. بعد هضم مسبق (الشكل 1G)، نقلنا شظايا الأنسجة في تقدم طازجة متوسطة الهضم، وحضنت شظايا الأنسجة لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع الإثارة لطيف. تم تصفيتها تعليق الخلية الناتجة (الشكل 1H) من خلال مصفاة الخلية (الشكل 1G). بعد الطرد المركزي، ومعلق الخلايا في مكعبات 8 مل تصفيح المتوسطة وpreplated في طبق ثقافة 10 سم الخلية (الشكل 2A)، وتربيتها لمدة 2 ساعة للسماح لمرفق من الخلايا الليفية القلب والخلايا البطانية (أرقام 2B، 2C). وكانت الخلايا التي لم نعلق بسرعة إعادةعلقت في المتوسط الطلاء. تم pipetteted 10 ميكرولتر من تعليق خلية تحتوي على العضلية في أنبوب إيبندورف وملطخة حل التريبان الأزرق في نسبة 1:1. احصي الخلايا باستخدام عداد الخلية الآلي، مما أدى إلى ما يقرب من 5.1 × 10 5 الخلايا الحية / مل تصفيح المتوسط. بعد العد، كانت مطلية الخلايا إلى أربع الكولاجين المغلفة أطباق زراعة الخلايا 30 مم (2 مل لكل طبق)، مما أدى إلى ما يقرب من 1 × 10 6 خلايا مطلي لكل طبق (1.4 × 10 5 خلية / سم 2؛ الشكل 2D). 18 ساعة بعد الطلاء، وكانت تعلق العضلية إلى الكولاجين المغلفة أطباق زراعة الخلايا (مع ما يقرب من 70٪ confluency) وبدأت في العقد تلقائيا (الشكل 2E، خلفية فيلم S2). في وقت لاحق، استخدمت العضلية إما لالليبوسومال ترنسفكأيشن (انظر الجدول رقم 1) أو تم نقل الخلايا مباشرة من الطلاء في المتوسط الصيانة (الشكل 2F) وتربيتها لمدة 3 أيام أخرى. التالية والثقافة، وكانت تغسل العضلية لفترة وجيزة في برنامج تلفزيوني 1X، الثابتة لمدة 5 دقائق في PFA 4٪ / برنامج تلفزيوني ومعالجتها لالمناعي كما هو موضح في واحدة من منشوراتنا الأخيرة 22. وتظهر نتائج ممثلة تصور الملون مناعيا الثقافات cardiomyocyte untransfected وtransfected في أرقام 2G و 2H، على التوالي. عرض العضلية الولدان مثقف والتهندس الخلوي المتوقع، كما يتضح من التصور من اللييفات العضلية (إشارة حمراء في الشكل 2G) وهياكل تشبه قرص مقحم (إشارة خضراء في الشكل 2G). بل هي أيضا قابلة للtransfections عابرة، كما رأينا في الشكل 2H (إشارة خضراء هو البروتين transfected؛ الاشارة الحمراء counterstaining من اللييفات العضلية باستخدام الأجسام المضادة actinin ألفا الساركومير).
"FO: SRC =" / files/ftp_upload/50154/50154fig1highres.jpg "سرك =" / files/ftp_upload/50154/50154fig1.jpg "/>
يتم غسلها الشكل 1. عزل أنسجة القلب من الفئران حديثي الولادة. A) تتم إزالة القلب من الصدر بعناية باستخدام ملقط المنحني (انظر أيضا التكميلي فيلم S1). B) قلوب معزولة عن 8 حديثي الولادة في برنامج تلفزيوني 1X (دون كا 2 +، 2 ملغ +) تستكمل مع 20 ملي BDM على الجليد. C) يتم نقل القلوب إلى قطرة من العزلة المتوسط. DE) الثرم من قلوب الأطفال حديثي الولادة باستخدام مقص منحني. F) نقل أنسجة القلب المفروم باستخدام ماصة المبللة مسبقا. G) أنسجة القلب مهضوم بعد أكثر من ليلة الحضانة في 4 درجات مئوية H) العضلية في تعليق بعد 20 دقيقة من عملية الهضم وسحن. يتراكم أنسجة القلب عسر الهضم في الجزء السفلي من الأنبوب. الأول) وتعليق ج معزولةيتم تصفية ardiomyocytes من خلال مصفاة الخلية.
الشكل 2. ثقافة العضلية الماوس الولدان والصور المناعي ممثل. A) تصفيح خلايا معزولة في بداية مرحلة ما قبل الطلاء خطوة. ب) الخلايا الليفية القلب والخلايا البطانية بدء التمسك غير المصقول صحن الثقافة الخلية بعد 1-3 ساعة الثقافة خلال فترة ما قبل الطلاء خطوة. C) بعد إعادة تعليق الخلايا العضلية غير ملتصقة، يمكن أن تبقى الخلايا الليفية القلب والخلايا البطانية يكون أبعد مثقف، إذا رغبت في ذلك. D) تصفيح من العضلية الماوس حديثي الولادة معزولة وتنقيته في الكولاجين المغلفة أطباق خلية ثقافة هاء) بعد 18 ساعة في الثقافة، العضلية التمسك د المغلفةيتضاءل المجموع المذكور أعلاه، وعلى النحو الأمثل بدء تقلصات عفوية (انظر أيضا فيلم التكميلي S2). F) استبدال المتوسطة مع الطلاء الصيانة المتوسطة يزيل الخلايا الميتة من الثقافة. A)-F) Scalebar 0.2 مم. G) صورة المناعي ممثل العضلية الماوس حديثي الولادة، ملطخة أجسام مضادة ضد myomesin (البنك التنموي الدراسات ورم هجين، أيوا، mMaC myomesin B4، باللون الأحمر) وبيتا catenin (سيغما، Cat.، لا : C2206، باللون الأخضر). Scalebar 10 ميكرون. H) صورة المناعي ممثل transfected العضلية الماوس حديثي الولادة مع البروتين أعرب GFP الموسومة باللون الأخضر (GFP-titin-N2B جزء)، وألفا actinin (سيغما، Cat.-NO.A-7811) في الحمراء . Scalebar 20 ميكرون. وهناك طريقة لترنسفكأيشن وتلطيخ المناعية المستخدمة في 2G) و2H) يمكن العثور عليها في الجدول رقم 1، ويتم تلخيصها في واحدة من منشوراتنا الأخيرة 22.
تكميلية فيلم S1. تكميلية فيلم S2. اضغط هنا لمشاهدة الفيلم تكميلية . الجدول 1. الأمثل من الطلاء والثقافة الشروط، الليبوسومال ترنسفكأيشن. الجدول 2. استكشاف الأخطاء وإصلاحها. ويمكن لعوامل كثيرة تؤثر العزلة الناجحة وثقافة الخلية الأوليةق. يرجى الرجوع إلى كتيبات مثل "ثقافة الخلايا الحيوانية" إيان Freshney 21، ومقدمات عامة في تقنيات زراعة الخلايا الأساسية. الأسباب المحتملة للمشاكل في العزلة والثقافة الاجراء من cardiomocytes الماوس الولدان التي واجهناها في معظم الأحيان يتم سردها في هذا الجدول. قبل الطلاء قبل الطلاء من الخلايا بعد العزلة يزيل الخلايا الليفية إلى حد كبير القلب والخلايا البطانية من الخليط خلية كاملة. خطوة واحدة قبل الطلاء يزيل ما يقرب من 50-80٪ من غير العضلية، من الخلية السكان. لا ينصح تكرار ما قبل الطلاء أكثر من مرتين، وكذلك من عصور ما قبل الطلاء لفترة أطول من 3 ساعة، ويرجع ذلك إلى خسارة إضافية من myocytes القلب. استبدال ما قبل الطلاء مع percoll التدرج 23،24 قد تحسين نقاء السكان الخلية cardiomyocyte. الطلاء وزراعة الخلايا الركيزة طلاء من الأطباق خلية ثقافة مع السابقينمصفوفة tracellular (ECM) مكونات مثل الكولاجين، فبرونيكتين، laminin، مخاليط معقدة ECM (أي matrigel 25،26) أو ركائز الاصطناعي (أي سيليكون البوليمر 27، organosilane 28) يؤثر إيجابا الالتزام cardiomyocyte، بقاء الخلية والخلية تنتشر خلال الخطوة الأولي الطلاء والثقافة للفترة اللاحقة. ولا سيما ثقافة العضلية على ركائز الزجاج يتطلب طلاء السطح مع مكونات ECM لتحقيق الالتزام السليم العضلية.
اختبرنا طلاء الثقافة الخلية تعامل ركائز البلاستيك والزجاج مع مجموعة متنوعة من مكونات ECM، بما في ذلك 0.1٪ محلول الكولاجين (سيغما C-8919)، اكتب 3 ملغ / مل الكولاجين 1 الحل (المتقدم Biomatrix، PureCol)، 1٪ محلول الجيلاتين ( سيغما G9391؛ الذائبة في H 2 O، تعقيمها)، وحلول laminin (سيغما L4544)، أو مخاليط معقدة ECM المستمدة من قلوب الخنازير 29 أو الخلايا الليفية القلب 30. cultu الخليةإعادة الأطباق وحضنت مع حلول ECM مدة لا تقل عن 1 ساعة إلى أكثر من ليلة في حاضنة الثقافة الخلية، وبعد إزالة ECM المجففة في تدفق الصفحي خلية غطاء الثقافة. يمكن إعادة استخدامها مرات عديدة حلول ECM (10-20 مرات) إذا استمر العقم ووحدة البروتين ECM أثناء التخزين لفترات طويلة (مثل تخزين عند 4 درجات مئوية أو المجمدة). الحذر، نظرا لطبيعة حمضية بعض المخازن المؤقتة المستخدمة لإذابة البروتينات ECM، غسل الأطباق الثقافة مع برنامج تلفزيوني 1X بعد طلاء قد يكون مطلوبا قبل الطلاء من الخلايا. تصفيح تقنية وكثافة اعتمادا على فحوصات لاحقة، ينبغي أن تركيزات الخلية المثلى لطلاء يؤدي إلى شبه متموجة الطبقات الوحيدة cardiomyocyte. الطلاء من العضلية بتركيزات عالية يؤدي إلى المجاميع cardiomyocyte متعدد الطبقات المنخفضة والتجانس، في حين أن تركيزات منخفضة يقلل من بقاء الخلية والنتائج في واحدة، العضلية معزولة خالية من كونتاك المتخصصة خلية خليةالخبر (هياكل تشبه قرص مقحم). عندما pipetting لخلايا لتصفيح تضع في اعتبارها أن العضلية هي كبيرة نوعا ما، والثقيلة، وتميل للتركيز على الجزء السفلي من أنبوب الصقر. إعادة تعليق الخلايا في الخطوات بين الطلاء حتى يضمن توزيع الخلايا في جميع أنحاء الأطباق الخاصة بك. عند نقل الخلايا تصفيح الأطباق في شكل الرقم "8" لتجنب تركيز الخلايا إلى وسط الطبق. يجب أن يكون confluency الأمثل لحديثي الولادة العضلية المخصصة لالليبوسومال ترنسفكأيشن حول 70-80٪ بعد يوم من الطلاء. مصل الدم استخدام زراعة الخلايا اختبار الجنين (أو حديثي الولادة) مصل بقري ومصل الحصان في متوسطة الطلاء هو ضروري لبقاء الخلية والتزام العضلية خلال خطوة الطلاء. نوعية المصل المستخدمة قد تكون واحدة من الخطوات الحاسمة أثناء إجراء الطلاء / الثقافة. مكملات من المتوسط الصيانة مع كميات قليلة من المصل هو اختياري، ولكن قد المنتجعا كثيرالقد مدة من الزمن الثقافة.
الحذر: إضافة المصل قد يغير كثيرا مسارات الإشارات البيوكيميائية في العضلية مثقف ويجوز الحكم فيما يتعلق المعلمات التجريبية، الفرضية وتفسير لاحق من النتائج. وقد وصفت الثقافات المصل خالية من 10،31 العضلية، وربما منع انحراف النتائج نظرا لعوامل النمو غير معروفة موجودة في المصل. مثبطات الانتشار العضلية متباينة عضال لا تخضع عادة الخلية الانقسام. ومع ذلك، فإن إضافة مثبطات الانتشار، مثل 10 ميكرومتر أراك (السيتوزين-BD-arabino furanoside هيدروكلوريد؛ سيغما C6645) ينصح بشدة إلى متوسطة صيانة لمنع انتشار الخلايا الليفية القلب والخلايا البطانية. حتى مع إضافة خطوات ما قبل الطلاء للحد من السكان من الخلايا الليفية القلب والخلايا البطانية، فإن الخلايا الليفية المتبقية الخضوع proli الخليةferation وإحداث تغيير كبير في مثقف الخلايا السكان مع مرور الوقت.
الحذر: اعتمادا على العوامل الوراثية والعزلة الوقت نقطة، العضلية الجنينية الماوس وحديثي الولادة قد يكون لا يزال انتشار 23،32،33 المحتملة. يجب أن يحكم استخدام أراك اعتمادا على المعلمات التجريبية، الفرضية وتفسير النتائج. بالإضافة إلى ذلك من وكلاء ميقاتية مكملات من المتوسطة صيانة مع وكلاء 34، مثل فينيليفرين (0.1 ملي، تفضيلي للالعضلية الفئران حديثي الولادة؛ سيغما P6126)، أو ايزوبروتيرينول (1 ميكرومتر، لتفضيلي العضلية الماوس حديثي الولادة؛ سيغما I6501) يزيد كثيرا sarcomerogenesis، نشر العضلية على لوحة فضلا عن الضرب العفوي للخلايا. ومع ذلك، ينبغي أن يكون وزنه إضافة هذه العوامل فيما يخص المعلمات الفحص المطلوب (على سبيل المثال بالإضافة إلى ذلك قد تحرف السلوك مقلص والمعلمات البيوكيميائية). ترنسفكأيشن الليبوسومال ترنسفكأيشن من الحمض النووي / الحمض النووي الريبي في العضلية الماوس حديثي الولادة يعتمد إلى حد كبير على ترنسفكأيشن الوقت نقطة، ترنسفكأيشن الكاشف، الكثافة والثقافة، وتركيز الحمض النووي / الحمض النووي الريبي وتستخدم بناء الحمض النووي. نحن اختبار مجموعة متنوعة من الليبوسومال الكواشف ترنسفكأيشن وجدت ESCORT الثالث (سيغما) وlipofectamine لعام 2000 (إينفيتروجن) المعمول بها. بالنقل الخلايا 24 ساعة بعد الطلاء عن طريق استبدال الطلاء متوسطة 2 ساعة قبل ترنسفكأيشن مع المضادات الحيوية الحرة المتوسطة الصيانة. لترنسفكأيشن من حديثي الولادة العضلية مثقف في أطباق 30 ملم، مزيج 1-2 ميكروغرام الحمض النووي مع 200 ميكرولتر DMEM في أنبوب إيبندورف العقيمة، وإضافة 4 ميكرولتر من مرافقة الثالث إلى خليط الحمض النووي المخفف. مزيج بلطف واحتضان لمدة لا تقل عن 5 دقائق في غطاء العقيمة للسماح DNA / الحويصلية تشكيل المعقدة. استبدال المضادات الحيوية خالية من الصيانة المتوسطة مع 800 حرة المضادات الحيوية الطازجة ميكرولتر الصيانة المتوسطة وإضافة خليط الحمض النووي / الحويصلية إلى الخلايا. احتضان الخلايا في خلية مكعبحاضنة LTURE واستبدالها مع الطازجة المتوسطة الصيانة المعتادة بعد 24 ساعة. ويرد نتيجة ممثل لtransfected بنجاح العضلية الماوس حديثي الولادة في الشكل 2H. ترنسفكأيشن باستخدام هطول الكالسيوم من الحمض النووي هو ممكن أيضا. ترنسفكأيشن من العضلية الماوس حديثي الولادة هو أكثر صعوبة مقارنة العضلية الفئران حديثي الولادة، مع الكفاءة ترنسفكأيشن نموذجية تتراوح 1-20٪. ويلزم ناقلات فيروسية لتحقيق الكفاءة أعلى 35-37 (على سبيل المثال: اتش، فيروس الغدة المرتبطة، الفيروسة البطيئة). التثقيب الكهربائي من حديثي الولادة العضلية في أيدينا غير مناسبة لإيصال الحمض النووي / الحمض النووي الريبي، ولكن تظهر عدة تقارير النجاح باستخدام التثقيب الكهربائي من العضلية الجنينية والوليدية 38،39. في مقال نشر مؤخرا 38، Djurovic وآخرون. تلخيص العديد من الأساليب ترنسفكأيشن، ومعدلات النجاح وكذلك مزاياها وعيوبها. الركض تجميد / ستوغضب لا ينصح الركض من 1 العضلية. تجميد العضلية الولدان معزولة لتخزين لفترات طويلة أمر صعب للغاية ولا يوصى بسبب انخفاض الكفاءة ومعدلات الاسترداد منخفضة. العديد من الشركات تقدم المتخصصة تجميد المتوسطة للثقافات البشرية cardiomyocyte الأولية (مثل celprogen، القط. رقم M36044-15FM) التي قد تكون مناسبة أيضا لمن الحفظ بالتبريد العضلية الماوس حديثي الولادة، ولكن قد تحتاج إلى أن يكون الأمثل الظروف. وقد وصفت والركض ناجحة والحفظ بالتبريد من العضلية الأذيني في نموذج الفأر وراثيا 32. لا خلايا قابلة للحياة أو ملتصقة 1 يوم بعد الطلاء - الحد من تركيز الانزيم و / أو الوقت الهضم
- تغيير خليط انزيم
- تشامصل لنجى تصفيح المتوسطة
- متوسطة تغيير ECM / طلاء و / أو أي نوع من الأطباق خلية ثقافة
- إضافة 20 ملي BDM إلى وسائل الإعلام العزل / الهضم
- التحقق من وجود تلوث من الخلايا العائد الخلية منخفضة - زيادة الوقت الهضم و / أو تركيز انزيم
- زيادة وقت الطرد المركزي / السرعة أثناء إجراء العزل
- فترة ارتفاع سحن Confluency من الخلايا في الثقافة منخفض جدا / عالية؛ متفاوتة الطلاء - عد الخلايا أثناء إجراء العزل وضبط عدد من الخلايا / طبق خلال تصفيح
- ضبط تركيز الطلاء
- في resuspend بعناية بيليه الخلية بعد الطرد المركزي وقبل الطلاء من قبل pipetting المتكررة (يوم 2 الخطوة 13)، تأكد تبقى لا مرئية خلية كتل أي خلايا الضرب - إضافة إلى صيانة وكلاء ميقاتية المتوسطة (على سبيل المثال: فينيليفرين، ايزوبروتيرينول)
- استبدال المتوسطة
- الفصلإيك لعدد كبير من الخلايا الليفية القلب / الخلايا البطانية ارتفاع عدد الخلايا الليفية - إضافة خطوة إضافية preplating خلال إجراء العزل
- إضافة إلى انتشار المانع الصيانة المتوسطة (الجدول 1) العديد من الخلايا الميتة - استبدال مستنبت الخلية
- الحد من تركيز الانزيم و / أو الوقت الهضم أثناء إجراء العزل
- ثقافة الخلية الحاضنة الاختيار (CO 2، ودرجة الحرارة، الرطوبة)
- التحقق من وجود تلوث تلوث - التمسك ظروف العمل خلية ثقافة عقيمة 21
- استبدال المتوسطة، استخدم الحل الجديد البنسلين / الستربتوميسين
- سطح تعقيم الفئران حديثي الولادة مع 75٪ محلول الإيثانول
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أصبح استخدام نماذج حيوانية لدراسة أمراض القلب القياسية في مجال البحوث القلب والأوعية الدموية. توصيف البيوكيميائية أقرب من هذه النماذج (أي دراسة الاستجابات المباشرة للخلايا القلب للمؤثرات الكيميائية الحيوية أو النشاط الحيوي) وعادة ما يتطلب عزل أنسجة القلب أو العضلية. دراسات التحقيق الاستجابات الفسيولوجية للقلب خارج الجسم (على سبيل المثال إلى 40 أستيل، أو في سيناريوهات نقص التروية، ضخه 41) الاستفادة عموما-perfused langendorff القلوب كلها 42،43، بينما الثقافات ازدراع 44،45 من شظايا الأنسجة القلبية تسمح للتحقيقات العضلية في بيئة الأنسجة ثلاثي الأبعاد. ومع ذلك، زراعة الأنسجة ازدراع قد تعيق انتشار المواد الغذائية، مما قد يولد مجموعة نخرية داخل نواة من الأنسجة. علاوة على ذلك، غير قادرة على الحركة العضلية داخل الأنسجة، وبالتالي هجرة الخلايا من إإكسبلنتس هو obse فقطrved لغير العضلية، مثل الخلايا الليفية أو الخلايا الاصلية القلب المفترضة 44. التحقيق في وسلوك الخلايا البيولوجية، والكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية التنموية العضلية المطلوبة وبالتالي إنشاء العزلة والإجراءات زراعة. بروتوكولات المبكر للعزلة وثقافة العضلية الثدييات استخدام الفئران حديثي الولادة 1،2. ومع ذلك، فإن صعود الماوس كنظام نموذج للدراسات الجينية (أي المعدلة وراثيا أو الضربة القاضية في الفئران خروج المغلوب) استلزم التكيف من العزلة الراسخة ومنهجيات زراعة. للأسف، وعزل العضلية الماوس حديثي الولادة هو تحديا من نوع خاص مقارنة مع تلك الفئران من العضلية حديثي الولادة تستخدم أكثر تقليديا. يصف بروتوكول المعروضة طريقة موثوقة وقوية الأمثل للعزلة وثقافة العضلية الماوس حديثي الولادة. نحن تصف الخطوات اللازمة لاستخراج الأنسجة الأولية، لتفارق والثانية تنقية الخلايا الليفية العضلية من القلب والخلايا البطانية، والطلاء والثقافة الشروط. في حين أن البروتوكول يوفر النهج الأساسي إلى العزلة وثقافة العضلية الماوس حديثي الولادة في الظروف القياسية، ويمكن تكييفها بسهولة للعزلة وثقافة العضلية الفئران حديثي الولادة، وكذلك لأنواع محددة مقايسة لاحقة: مثل ثقافة الخلايا المعزولة على الأغشية المرنة (مثل لوحات Bioflex الثقافة) للتحقيق في خصائص النشاط الحيوي والثقافة في أطباق زجاجية القاع (ماتيك) لتصوير الخلايا الحية، أو ثقافة العضلية في xCELLigence لوحات ه القلب (ACEA، روش، Cat.-No.: 06417051001) لدراسة آثار المخدرات على وظائف مقلص. وعلاوة على ذلك، ونحن نقدم خيارات لتعظيم الاستفادة من العزلة والإجراءات والثقافة، ومناقشة مصادر المشاكل المحتملة وإيجاد الحلول لها. وبالتالي، يجب أن هذا البروتوكول مساعدة الباحثين على دراسة ما يصل إلى التاريخ، وتكرار للغايةطريقة معقولة لإعداد الأطفال حديثي الولادة الثقافات الماوس cardiomyocyte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لا شيء.
Acknowledgments
نحن ممتنون للبروفيسور الفخري جان كلود Perriard وإيفلين Perriard (المعهد الاتحادي السويسري للتكنولوجيا، سويسرا) لإدخال تقنيات في عزلة عن الفئران حديثي الولادة والعضلية الماوس. نود أن نشكر الأستاذ جو تشن والبروفيسور سيلفيا إيفانز (جامعة كاليفورنيا سان دييغو، الولايات المتحدة الأمريكية) لدعمهم. وقد تم تمويل العمل في المختبر من قبل لجنة نهر الميكونج EE الوظيفي مؤسسة غرانت. ويدعم SL قبل K99/R00 الطريق إلى جائزة الاستقلال من المعاهد الوطنية للصحة / NHLBI (HL107744). وأيد TMM بواسطة زمالة ما بعد الدكتوراه من جمعية القلب الأمريكية (11POST7310066).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8 | Sigma | B-0753 | prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47. |
| Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | can be substituted with collagenase type II from Worthington |
| Collagenase type II3 | Worthington | CLS-2 | substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche |
| 1x trypsin solution (0.25%) with EDTA | cellgro | 25-053-CI | |
| 1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS | cellgro | 30-002-Cl | |
| 1x PBS (without Ca2+, Mg2+) | e,g, cellgro | 21-040-CV | |
| HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4 | cellgro | 21-022-CV | |
| DMEM high glucose | cellgro | 10-013-CV | |
| M-199 | cellgro | 10-060-CV | |
| fetal bovine serum | cellgro | 35-011-CV | cell-culture grade |
| horse serum | cellgro | 35-030-CV | cell-culture grade |
| Leibovitz L-155 | cellgro | 10-045-CV | |
| AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride) | Sigma | C-6645 | proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C |
| phenylephrine | Sigma | P-6126 | chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
| isoproterenol hydrochloride | Sigma | I-6501 | chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
| 0.1% collagen solution | Sigma | C-8919 | extracellular matrix for coating |
| 3 mg/ml collagen type 1 solution | Advanced BioMatrix | 5005-B | alternative to Sigma collagen solution |
| cell strainer | Fisherbrand | 22363548 | appropriate filter size:40 μm-100 μm |
| syringe filter 0.2 μm | Fisherbrand | 09-719C | for sterile filtration of digestion medium |
| straight scissors | Fine Sciences Tools | 91460-11 | |
| curved scissors | Fine Science Tools | 91461-11 | |
| Dumont No. 7 forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| perforated spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | optional, for transfer of heart tissue |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | live cell staining |
| Neubauer hemocytometer | Prosource Scientific | 3500 | alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems |
| 50 ml Falcon tubes | Fisherbrand | 14-432-23 | |
| 15 ml Falcon tubes | Fisherbrand | 05-527-90 | |
| 20 ml syringe | BD Medical | 14-820-19 | |
| 10 ml serological pipette | Falcon | 357551 | |
| 30 mm cell culture dish | Nunc | 153066 | for standard culture of cardiomyocytes |
| 30 mm cell culture dish, glass bottom | MatTek | P35G-0-10-C | for live cell imaging with inverted microscope |
| 10 cm cell culture dish | Nunc | 172958 | for preplating |
| Escort III | Sigma | L3037 | for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000 |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies, Invitrogen | 52887 | substitute for Escort III |
Buffers and media:
|
|||
References
- Harary, I., Farley, B. In vitro studies of single isolated beating heart cells. Science. 131, 1674-1675 (1960).
- Harary, I., Farley, B. In vitro studies on single beating rat heart cells. I. Growth and organization. Exp. Cell Res. 29, 451-465 (1963).
- Worthington Biochemical Corp. Worthington Enzyme Manual. , Freehold. N.J. Available from: http://www.worthington-biochem.com/index/manual.html (2012).
- Hanks, J. H., Wallace, R. E. Relation of oxygen and temperature in the preservation of tissues by refrigeration. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 71, 196-200 (1949).
- Leibovitz, A. The Growth and Maintenance of Tissue-Cell Cultures in Free Gas Exchange with the Atmosphere. Am. J. Hyg. 78, 173-180 (1963).
- Mulieri, L. A., Hasenfuss, G., Ittleman, F., Blanchard, E. M., Alpert, N. R. Protection of human left ventricular myocardium from cutting injury with 2,3-butanedione monoxime. Circ. Res. 65, 1441-1449 (1989).
- Thum, T., Borlak, J. Butanedione monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures. Cardiovasc Toxicol. 1, 61-72 (2001).
- Verrecchia, F., Herve, J. C. Reversible blockade of gap junctional communication by 2,3-butanedione monoxime in rat cardiac myocytes. Am. J. Physiol. 272, 875-885 (1997).
- Allen, T. J., Chapman, R. A. The effect of a chemical phosphatase on single calcium channels and the inactivation of whole-cell calcium current from isolated guinea-pig ventricular myocytes. Pflugers Arch. 430, 68-80 (1995).
- Mitcheson, J. S., Hancox, J. C., Levi, A. J. Cultured adult cardiac myocytes: future applications, culture methods, morphological and electrophysiological properties. Cardiovasc. Res. 39, 280-300 (1998).
- Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 14, 397-412 (1982).
- Claycomb, W. C., Palazzo, M. C. Culture of the terminally differentiated adult cardiac muscle cell: a light and scanning electron microscope study. Dev. Biol. 80, 466-482 (1980).
- Eppenberger, M. E., et al. Immunocytochemical analysis of the regeneration of myofibrils in long-term cultures of adult cardiomyocytes of the rat. Dev. Biol. 130, 1-15 (1988).
- Eppenberger, H. M., Hertig, C., Eppenberger-Eberhardt, M. Adult rat cardiomyocytes in culture A model system to study the plasticity of the differentiated cardiac phenotype at the molecular and cellular levels. Trends Cardiovasc Med. 4, 187-193 (1994).
- Arber, S., et al. MLP-deficient mice exhibit a disruption of cardiac cytoarchitectural organization, dilated cardiomyopathy, and heart failure. Cell. 88, 393-403 (1997).
- Toraason, M., Luken, M. E., Breitenstein, M., Krueger, J. A., Biagini, R. E. Comparative toxicity of allylamine and acrolein in cultured myocytes and fibroblasts from neonatal rat heart. Toxicology. 56, 107-117 (1989).
- Worthington Biochemical Corp. Worthington Tissue Dissection Guide. , Freehold. N.J. Available from: http://www.worthington-biochem.com/tissuedissociation (2012).
- Bashor, M. M. Dispersion and disruption of tissues. Methods Enzymol. 58, 119-131 (1979).
- Speicher, D. W., McCarl, R. L. Pancreatic enzyme requirements for the dissociation of rat hearts for culture. In Vitro. 10, 30-41 (1974).
- Gross, W. O., Schopf-Ebner, E., Bucher, O. M. Technique for the preparation of homogeneous cultures of isolated heart muscle cells. Exp Cell Res. 53, 1-10 (1968).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells : a manual of basic technique and specialized applications. , 6th, Wiley-Blackwell. (2010).
- Lange, S., Perera, S., Teh, P., Chen, J. Obscurin and KCTD6 regulate cullin-dependent small ankyrin-1 (sAnk1.5) protein turnover. Mol Biol Cell. , (2012).
- Sen, A., Dunnmon, P., Henderson, S. A., Gerard, R. D., Chien, K. R. Terminally differentiated neonatal rat myocardial cells proliferate and maintain specific differentiated functions following expression of SV40 large T antigen. J. Biol. Chem. 263, 19132-19136 (1988).
- Evans, H. J., Goodwin, R. L. Western array analysis of cell cycle protein changes during the hyperplastic to hypertrophic transition in heart development. Mol. Cell Biochem. 303, 189-199 (2007).
- Bakunts, K., Gillum, N., Karabekian, Z., Sarvazyan, N. Formation of cardiac fibers in Matrigel matrix. Biotechniques. 44, 341-348 (2008).
- Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. FASEB J. 14, 669-679 (2000).
- Nawroth, J. C., et al. A tissue-engineered jellyfish with biomimetic propulsion. Nat. Biotechnol. 30, 792-797 (2012).
- Das, M., et al. Long-term culture of embryonic rat cardiomyocytes on an organosilane surface in a serum-free medium. Biomaterials. 25, 5643-5647 (2004).
- DeQuach, J. A., et al. Simple and high yielding method for preparing tissue specific extracellular matrix coatings for cell culture. PLoS One. 5, e13039 (2010).
- VanWinkle, W. B., Snuggs, M. B., Buja, L. M. Cardiogel: a biosynthetic extracellular matrix for cardiomyocyte culture. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 32, 478-485 (1996).
- Karliner, J. S., Simpson, P. C., Taylor, J. E., Honbo, N., Woloszyn, W. Adrenergic receptor characteristics of cardiac myocytes cultured in serum-free medium: comparison with serum-supplemented medium. Biochem Biophys Res Commun. 128, 376-382 (1985).
- Steinhelper, M. E., et al. Proliferation in vivo and in culture of differentiated adult atrial cardiomyocytes from transgenic mice. Am. J. Physiol. 259, H1826-H1834 (1990).
- Ahuja, P., Perriard, E., Perriard, J. C., Ehler, E. Sequential myofibrillar breakdown accompanies mitotic division of mammalian cardiomyocytes. J. Cell Sci. 117, 3295-3306 (2004).
- Iwaki, K., Sukhatme, V. P., Shubeita, H. E., Chien, K. R. Alpha- beta-adrenergic stimulation induces distinct patterns of immediate early gene expression in neonatal rat myocardial cells. fos/jun expression is associated with sarcomere assembly; Egr-1 induction is primarily an alpha 1-mediated response. J. Biol. Chem. 265, 13809-13817 (1990).
- Kirshenbaum, L. A., MacLellan, W. R., Mazur, W., French, B. A., Schneider, M. D. Highly efficient gene transfer into adult ventricular myocytes by recombinant adenovirus. J. Clin. Invest. 92, 381-387 (1993).
- Maeda, Y., et al. Adeno-associated virus-mediated transfer of endothelial nitric oxide synthase gene inhibits protein synthesis of rat ventricular cardiomyocytes. Cardiovasc Drugs Ther. 15, 19-24 (2001).
- Zhao, J., et al. Lentiviral vectors for delivery of genes into neonatal and adult ventricular cardiac myocytes in vitro and in vivo. Basic Res. Cardiol. 97, 348-358 (2002).
- Djurovic, S., Iversen, N., Jeansson, S., Hoover, F., Christensen, G. Comparison of nonviral transfection and adeno-associated viral transduction on cardiomyocytes. Mol. Biotechnol. 28, 21-32 (2004).
- van Bever, L., et al. Pore loop-mutated rat KIR6.1 and KIR6.2 suppress KATP current in rat cardiomyocytes. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 287, 850-859 (2004).
- Sakai, K., Akima, M., Tsuyama, K. Evaluation of the isolated perfused heart of mice, with special reference to vasoconstriction caused by intracoronary acetylcholine. J. Pharmacol Methods. 10, 263-270 (1983).
- Reichelt, M. E., Willems, L., Hack, B. A., Peart, J. N., Headrick, J. P. Cardiac and coronary function in the Langendorff-perfused mouse heart model. Exp Physiol. 94, 54-70 (2009).
- Tian, R. Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy. J. Vis. Exp. (42), e2069 (2010).
- Liao, R., Podesser, B. K., Lim, C. C. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303, H156-H167 (2012).
- Zakharova, L., Nural-Guvener, H., Gaballa, M. A. Cardiac explant-derived cells are regulated by Notch-modulated mesenchymal transition. PLoS One. 7, e37800 (2012).
- Rudy, D. E., Yatskievych, T. A., Antin, P. B., Gregorio, C. C. Assembly of thick, thin, and titin filaments in chick precardiac explants. Dev. Dyn. 221, 61-71 (2001).
- Thum, T., Borlak, J. Reprogramming of gene expression in cultured cardiomyocytes and in explanted hearts by the myosin ATPase inhibitor butanedione monoxime. Transplantation. 71, 543-552 (2001).
- Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 294, H1667-H1674 (2008).
