Summary
初代マウス心筋細胞培養は、筋原線維組織や機能の調査のための極めて重要なツールの一つである。以下のプロトコルは、新生児マウスの心臓から初代心筋細胞の単離および培養について説明します。得られた心筋細胞培養物は、続いて、生体力学的、生化学的および細胞生物学の種々のアッセイに使用することができる。
Abstract
培養された新生児の心筋細胞は、長いmyofibrillogenesisと筋原線維の機能を研究するために使用されてきた。培養心筋簡単な調査と操作生化学的経路の、そして自然に心筋細胞を破っての生体力学的特性に及ぼす影響を考慮。
次の2日間のプロトコルは、新生児マウスの心筋細胞の単離および培養について説明します。我々は簡単に、新生児の心臓を解剖心臓組織を解離し、心臓の細胞集団から心筋細胞を豊かにする方法を示しています。我々は、細胞分離のために異なる酵素混合物の使用、および細胞生存性に与える影響を議論。孤立した心筋細胞は、その後、形態的、電気生理学的、生化学的、細胞生物学的または生体力学的検定のさまざまな目的で使用することができます。私たちは、商業的に利用可能なソリューションを使用することにより、堅牢性と再現性のためのプロトコルを最適化し、酵素がそのSHをミックスOW少しロット間変動。また、心筋細胞の単離および培養に関連する一般的な問題に対処し、単離および培養条件の最適化のためのさまざまなオプションを提供します。
Introduction
げっ歯類の心臓細胞の正常な解離と文化のための最も初期の報告は、1960年の1,2にさかのぼります。それでも、ハラリィとファーリーは培養心筋細胞は「定期収縮の要件の研究のためのユニークなシステムを提供することができ、[、とあり] [鼓動]プロセスのための様々な代謝経路の寄与を決定する手段を提供する」ことに気づいた。幼若ラット、元のプロトコルからハラリィとファーリー単離し、培養心筋細胞は、長年にわたって適応し、多くの科学者によって変更されているが、一般的な単離·培養手順が大幅に変更されていません。しかし、より良い酵素3、標準化されたソリューションを4,5、および単離手順6-9の間に細胞を保護する可逆チャンネルとミオシンATPアーゼ阻害剤BDMの添加は、細胞収量及び生存率を改善した。
新生児cardiomyo対アダルトcytes
新生児マウスまたはラットから単離し、培養心筋細胞は、成人の心筋細胞の培養液に比べていくつかの利点がある。成体マウスまたはラット10から心筋細胞の単離と比較した場合、まず、新生仔マウスまたはラットの心臓の分離手順は、簡単かつ低コストである。新生児心筋細胞が大幅に細胞収量を増加させる、解離後のカルシウム含有培地中に再導入するためにはるかに敏感である。大人の心筋細胞は、通常、収縮を誘発するためにペーシングが必要ですが、一般的に、めっき後自発的に拍動細胞では20時間後に、その結果、再分化サイクル - もう一つの大きな利点は、新生児マウスの心筋細胞は、より迅速な脱分化を受けることである。新生児の心筋細胞は、成人の心筋細胞は、トランスジェニックDNAの正常な配信のためのウイルスベクターを必要とするのに対して、より容易に、リポソームトランスフェクション法でトランスフェでもある。新生児心筋細胞とは対照的にS、成人の齧歯類心筋細胞11〜13の文化は、筋原線維の劣化と収縮装置の最終的な再構築の検討が可能になります。成人の心筋細胞におけるこれらの特徴的な形態変化は、1〜2週間の期間にわたって発生する。脱分化-再分化サイクルは、それによって人間の心筋症14で観察された病理学的変化を模倣し、胎児の遺伝子プログラムの再発現を伴う。新生児の心筋細胞を培養上の大人のラットの心筋細胞のもう一つの利点は、長期間培養することができることは、これらの細胞である。
マウスの心筋細胞対ラット
ラット新生児心筋細胞の単離および培養は、生細胞のより高い収量の増加、トランスフェクション率を含むマウス新生児の心筋細胞のそれ以上のいくつかの利点があります。しかし、心疾患のため、遺伝子組み換えマウスモデルの幅広い使用方法（ 例えば、</ em>は拡張型心筋症15のモデルとして筋肉LIMタンパク質ノックアウトマウス）は、新生児マウス由来の心筋細胞の分離手順の適応につながっている。新生ラットとマウスの心筋細胞を分離するために使用されるプロトコルは、ほとんど同じですが、より大きな注意が、後者のための適切な酵素ミックスの選択に注意する必要があります。実際、新生児マウスの心筋細胞は、減少した細胞収量および生存度で、その結果、一般的には過剰消化を受けやすい。新生仔マウス由来の心筋細胞が新生児ラット心臓由来の細胞と比較してやや小さいのでさらに、播種密度は、調整されるべきである。
形態的、電気生理学的、生化学的、細胞生物学的および生体力学的パラメータだけでなく、myofibrillogenesisのプロセスのための調査のための多くの用途で、培養された新生児心筋細胞の研究のための最も汎用的なシステムの一つとなっているin vitroでの心臓細胞の機能。成功した検定への第一歩は、しかし、新生児マウスの心筋細胞を分離するための簡単で信頼性の高い方法論に依存します。我々のプロトコルは、多くのソースから、その方法論を引き出し、再現性と堅牢性のために最適化された。我々は心筋細胞の収率および生存率に影響を与える要因について議論し、単離および培養条件の最適化のためのさまざまなオプションを提供しています。
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Protocol
次の手順では、新生児マウスの心筋細胞の単離および培養のための2日間のプロトコル16,17について説明します。すべてのソリューションは、無菌または滅菌濾過される。すべてのツールは、75％エタノールで表面殺菌により滅菌されています。初期の組織摘出を除き、全ての工程を無菌層流細胞培養フード内で行っている。このプロトコルは、ワンツーごみ（S）からの新生児マウス心臓を単離するためのものです - 約5から14匹が、より大きなゴミサイズとラット新生児心筋細胞に適合させることができる。必要に応じて、スケールのメディア/酵素の使用量。
新生児げっ歯類での作業のために、立法府および/または動物のケアプログラムで定められた、あなたの地元の大学のガイドラインやルールを参照し、お使いの制度的に承認動物プロトコルに準拠しています。このプロトコルで説明されているすべてのメソッドは、カリフォルニア州立大学サンディエゴ校の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認され、FEDEに付着されていますRALおよび州の規制。
1日目。
1。新生児マウスからの心臓組織の単離
- 20 mMのBDM 6-8で補充（Ca 2 +や Mg 2 +を含まない）×PBS中の50ミリリットルを用意し、氷の上に配置された2つの滅菌細菌皿に分散させる。
- 50ミリリットルの滅菌コニカルファルコンチューブに分離培地10mlを準備します。氷の上のすべてのソリューションを保管してください。 、鉗子（湾曲し、デュモン7号）、はさみ（1ストレート湾曲した1）を殺菌する。
- 1-3日齢の新生仔マウスは、表面殺菌し、75％エタノール溶液中で速やかにリンスする。子犬は、滅菌ハサミ（ストレート）を使用して断頭し、胸は胸腔へのアクセスと心臓（ 図1A、補足ムービーS1）を可能にするために胸骨に沿って開かれる。
技術的なコメント：3日以上経過した新生マウスを使っていますが、少数の生存細胞2になることがあります。 - 心臓から抽出され湾曲したハサミでボディと氷の上で、20 mMのBDMと（Ca 2 +や Mg 2 +を含まない）1X PBSを含む細菌皿にすぐに移す。以下のすべての工程を無菌細胞培養フード内で行っている。
- （必要に応じて、心房）肺組織、より大きな血管を削除します。血液を除去するために20 mMのBDM（氷上）と（Ca 2 +や Mg 2 +を含まない）1×PBS溶液中での洗浄の心。転送は、鉗子や穴あきスプーン（ 図1B）を使用して、20 mMのBDM（氷上）と（Ca 2 +や Mg 2 +を含まない）1X PBSを含む第二の細菌皿に一皿から心を洗浄した。
- （氷上で）第三の細菌皿に、約0.5〜1ミリメートル3、以下（小さ な断片に心をミンチする湾曲したハサミを使って、転送分離培地のドロップに心（ 図1C、約250μl）を洗浄/洗浄; 図1D、1E）。
- 円錐形に刻んだ心を移すチューブは（氷上で）分離培地10mlを含む、一晩4℃で穏やかに攪拌しながらインキュベートする。
2日目。
2。細胞の酵素組織消化とめっき
- コラゲナーゼ/ディスパーゼ混合物（Roche）を15mgのを計量し、20 mMのBDM（消化培地）を補充した10ミリリットルL15-媒体5に酵素ミックスを溶かす。無菌フィルター新しい滅菌50ミリリットルファルコンチューブに細胞培養フード内消化培地。
- 20 mMのBDMを補足した30ミリリットルのL-15培地を調製し、培地をメッキする。
- 1時間の最小のコラーゲン溶液（Sigma C-8919）で被覆細胞培養プレート。無菌層流細胞培養フード内でコラーゲン溶液（再利用することができます）と乾燥コラーゲンコーティングした細胞培養皿を取り外します。
- 4℃から前消化心を含む円錐管を削除組織片（ 図1G）に集約する必要があります。組織片はに沈むましょうチューブの底部と（いずれの組織片を失うことはないことを確認してください。通常、分離培地の約1ミリリットルは、チューブ内に残っている場合があります）、上清を除去します。消化培地5mlで1分間、酸素または空気を用いて組織フラグメントおよび含酸素化合物の懸濁液に20mMのBDMを補充したL-15を5ml加える。
- 消化溶液の温度を調整するために約2分間37℃の水浴に消化培地中に心臓組織断片を含有する密封された円錐管に移す。
- 20〜30分（60RPM超えないように設定して37℃、で例えばシェーカー）穏やかに撹拌しながら37℃で心臓組織片をインキュベートする。消化時間が大幅に酵素混合物、ロット番号に依存し得る注意：インキュベーション時間を長く又はより高い酵素濃度は、細胞生存率を減少させることができる。
技術的なコメント：102696：我々は（カタログ番号ロシュからコラゲナーゼ/ディスパーゼ混合物の使用をお勧めします38001）非常に少ないロット間のばらつきを有している。マウス心筋細胞の単離のための古典的な酵素は、トリプシンおよび/ またはワージントン（カタログ番号CLS-2）から利用可能なコラゲナーゼII型3,16-20です。しかし、コラゲナーゼIIの性能は、ロット間で大きく異なる可能性があります。ワーシントンは、一般的に消化時間を最適化し、使用量を酵素には、いくつかのコラゲナーゼロットのテストが可能になります。あるいは、ワージントンは、予め試験した酵素混合物を用いて心筋細胞単離キットを販売することは、マウス心筋細胞の単離17（：NCISカタログ番号）に適合させることができる含まれる。
- 新しい滅菌50mlコニカルファルコンチューブに無菌細胞ストレーナー（40〜100ミクロンのナイロンメッシュ）を配置します。 20 mMのBDMを補足した5ミリリットルのL-15で予め湿らセルストレーナー。約10〜20回予め湿らせた10ミリリットルの細胞培養ピペットを用いて穏やかに磨砕組織断片。組織片は、ほとんどサスペンシオに細胞を放出し、このステップの間に分散させる必要がありますN（ 図1H）。
- より大きな組織片が沈降しましょおよび細胞ストレーナー（ 図1I）を介して新鮮なコニカルチューブに懸濁した細胞を含む上清を移す。
- 5ミリリットルの消化培地中で未消化の組織片を再することは、一時停止し、穏やかに攪拌しながら37℃でさらに5〜10分間インキュベートする。
- 残りの組織片の継続的な消化した後、ゆっくりと10〜20倍のための組織を粉末化し、最初のセルストレーナーを通して消化物からの円錐管を含む細胞に加える。すべての消化細胞の通過を可能にするために20 mMのBDMを補足した5ミリリットルのL-15で細胞ストレーナーを洗浄します。
- 300回転（約50〜100×g）で5分間中断した心筋細胞を含む遠心分離コニカルチューブ。 （主に線維芽細胞および内皮細胞を含む）上清を除去し、培地をめっきする10ミリリットル中に再懸濁細胞ペレット。
- 板細胞を10cmの細胞培養皿（ 図2A）へと1インキュベート細胞培養インキュベーター中で-3時間。このプレめっき工程は、コーティングされていない細胞培養皿（ 図2C）に付着した線維芽細胞及び内皮細胞（ 図2B）を除去する。
- インキュベーション後、転送再懸濁した細胞を無菌の円錐形のFalcon遠心分離管（15 mlまたは50ml）中に（繰り返し皿上にプレーティング培地をピペッティングして再懸濁細胞）を10cm培養皿から非付着性心筋細胞を洗浄し、そして。
オプション：細胞懸濁液から、追加の線維芽細胞を除去するためのめっき前の手順を繰り返します。所望であれば、接着性線維芽細胞および内皮細胞をさらに培養することができる。 - （ノイバウエル血球計数器、パンブルー排除染色21を使用することによって）細胞を数える。
- 1cm 2当たり約1.5×10 5細胞（ 図2Dの密度を有する、コラーゲンコートした細胞培養皿にプレート細胞;関連項目メッキの表1のコメントおよびコーティング）。
細胞培養インキュベーターに料理を置き、付着および心筋細胞の拡散を可能にするために12から18時間静置しておきます。
3日目 - 新生児心筋細胞の培養
- 37℃の水浴中で維持培地と予熱して調製する。新生児マウスの心筋細胞のリポソームトランスフェクションのための増殖阻害剤または変剤の添加、あるいは手続きについては、表1を参照してください。
- ある日、めっき後に、心筋細胞は、細胞培養皿に接着し、最適縮小する自然発生的に開始している必要があります（ 図2E、2Fを 、 補足作品S2;分離/培養手順の間に一般的な問題については表2を参照してください）。追加の1-5日間、維持培地、および文化にメッキ培地を交換してください。必要に応じてメディアを変更します。
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Representative Results
このプロトコルを使用して、我々は（ 図1A、1B、補足映画S1）8一日古い新生仔マウスからの心臓を単離した。洗濯やハサミ（ 図1C-1F）と心をミンチした後、組織片を穏やかに撹拌しながら4℃で一晩分離培地で予め消化された。前消化（ 図1G）に続いて、我々は新たに作製した消化培地に組織片を移して、穏やかに攪拌しながら37℃で20分間の組織片を培養した。得られた細胞懸濁液（ 図1H）を、セルストレーナー（ 図1G）を通して濾過した。遠心分離後、ペレット化した細胞を、培地をプレーティング8mlに再懸濁し、10cmの細胞培養皿（ 図2A）にpreplated、および心臓線維芽細胞および内皮細胞（ 図2B、2C）の装着を可能にするために、2時間培養した。急速に添付していなかった細胞が再だったプレーティング培地中に懸濁した。心筋細胞を含む細胞懸濁液10μlをエッペンドルフチューブにpipettetedと1:1の比でトリパンブルー溶液で染色した。細胞を培地にプレーティング約5.1×10 5生細胞/ mlで、その結果、自動細胞カウンターを用いて計数した。計数後、細胞をディッシュ（; 図2D 1.4×10 5細胞/ cm 2）あたり約1×10 6個播種した細胞で得られた4つの30mmコラーゲンコーティングした細胞培養皿（ディッシュ当たり2 ml）中に播種した。 18時間プレーティング後、心筋細胞（約70％コンフルエンシーで）コラーゲンコーティングした細胞培養皿に付着し、自然に（ 図2E、補足映画S2）が収縮し始めた。続いて、心筋細胞のいずれか、リポソームトランスフェクションのために使用した（ 表1を参照）、または細胞を直接維持培地（ 図2F）中にプレーティングから転送されたさらに3日間培養した。培養後、心筋細胞を簡単に4％PFA / PBS中で5分間固定し、我々の最近の刊行22のいずれかに記載の免疫蛍光のために処理し、1×PBS中で洗浄した。免疫学的に描いた代表的な結果を染色した非トランスフェクトし、トランスフェクトされた心筋細胞培養物を、それぞれ図2Gおよび2Hに示されている。培養された新生児心筋細胞は、筋原線維の可視化から明らかなように期待される細胞構築、（ 図2Gの赤い信号）と、インターカレートされた円盤状の構造（ 図2Gの緑色の信号）を表示します。 図2Hに示すように、それらは、また、一過性のトランスフェクションに適している（緑色シグナルがトランスフェクトされたタンパク質であるα-サルコメリックアクチニン抗体を用いて筋原繊維の赤色信号対比）。
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8新生児から分離新生児マウスからの心臓組織の図1。単離A）の心臓を慎重に湾曲したピンセットを用いて胸部から削除された（）も補足ムービーS1を参照してください。B）心臓を（のCa 2 +を含まない1×PBS中で洗浄し、 の Mg 2 +）、氷上で20 mMのBDMを補足した。C）ハーツが湾曲したハサミを使用して、新生児の心の分離培地のドロップ。DE）ミンチに移す。 女）予め湿潤ピペットを用いてみじん切り心臓組織の移転。G）消化とチュレーションの20分後の懸濁液中で4℃、H）心筋細胞での一晩のインキュベーション後の前消化心臓組織。未消化の心臓組織をチューブの底に蓄積する。I）単離されたcは懸濁液をardiomyocytesを細胞ストレーナーを通して濾過する。
心臓線維芽細胞および内皮細胞は1-3時間後にコーティングされていない細胞培養皿に付着し始めるめっき前工程B）の開始時の単離された細胞の新生仔マウスの心筋細胞および代表免疫蛍光画像を図2培養。A）めっき必要に応じて、非接着性心筋細胞の再懸濁後めっき前段階。C）の中の文化の、残りの心臓線維芽細胞や内皮細胞は、さらに培養することができる。コラーゲンコーティングした細胞培養皿で単離精製された新生児マウスの心筋細胞のD）めっき、E）培養液中で18時間後、心筋細胞は、コーティングされたDに付着ishes、最適に（また補足ムービーS2参照）。F）維持培地にプレーティング培地を交換培養物から死細胞を除去し、自発的収縮を始める。ミオメシンに対する抗体で染色した新生児マウスの心筋細胞のA）〜F）スケールバー0.2ミリメートル。G）代表免疫蛍光画像赤（発生研究ハイブリドーマバンク、アイオワ州、MMACのミオメシンB4の、）およびβ-カテニン（シグマ、カタログ番号-いいえ。：C2206、緑色）。赤で表現さGFPタグ緑タンパク質（GFP-タイチン-N2B断片）、およびα-アクチニン（シグマ、カタログ番号：A-7811-）でトランス新生児マウスの心筋細胞のスケールバーは10μm。H）代表免疫蛍光画像。スケールバーは20μm。トランスフェクションおよび2Gに用いられる免疫学的染色のための方法）及び2H） を表1に見出すことができ、我々の最近の刊行22のいずれかにまとめられている。
補足ムービーS1。 補足ムービーS2。 補足ムービーを見るにはここをクリックしてください 。 表1。メッキおよび培養条件の最適化、リポソームトランスフェクション。 表2。トラブルシューティング。多くの要因が、初代細胞の正常な単離および培養に影響を与えることができるS。基本的な細胞培養技術への一般的な紹介として、イアン·フレッシュニー21によって、このような「動物細胞の培養」などのマニュアルを参照してください。我々が最も頻繁に遭遇した新生児マウスcardiomocytesの単離および培養procedurでの問題で考えられる原因は、この表に記載されています。 めっき前 分離後の細胞のプレめっきが大幅に全細胞混合物から心臓線維芽細胞および内皮細胞を除去します。シングルプレメッキ工程は、細胞集団から非心筋細胞の約50から80まで%を削除します。倍以上のめっき前よりの、だけでなく、3時間よりも長いめっき前回の繰り返しは、心筋細胞の追加損失によるものでは推奨されません。パーコール勾配23,24でプレめっきの置換は、心筋細胞集団の純度を向上させることができる。 コーティングおよび細胞培養基板 EXとの細胞培養皿のコーティングコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、複雑なECM混合物（ すなわち、マトリゲル25,26）または人工基質（ すなわち、シリコーンポリマー27、オルガノ28）等tracellularマトリックス（ECM）成分が正に最初のめっき工程中に拡散する心筋細胞の付着、細胞生存率および細胞に影響を与えるおよびその後の培養期間のため。特に、ガラス基板上の心筋細胞の培養は、心筋細胞の適切な付着を達成するために、ECM成分と表面のコーティングを必要とする。
我々は、0.1％コラーゲン溶液（Sigma C-8919）を含む、ECM成分の様々な細胞培養処理プラスチックおよびガラス基材のコーティングを試験し、3 mg / mlのコラーゲン1型の溶液（アドバンストバイオマトリックス、PureCol）、1％ゼラチン溶液（ H 2 Oに溶解、オートクレーブ処理）、ラミニンソリューション（シグマL4544）、またはブタの心臓29または心臓線維芽細胞30から派生した複合のECM混合物、シグマG9391。細胞cultu皿再細胞培養インキュベーター中で、層流細胞培養フード内で乾燥したECMを除去した後に一晩に1時間以上は、ECM溶液と共にインキュベートした。長期間の貯蔵の間、無菌性およびECMタンパク質の完全性が維持されている場合、ECM溶液（4℃以下で凍結例えばストレージ）を多数回（10〜20倍）を再利用することができる。注意によるECMタンパク質を溶解するために使用される緩衝液のいくつかの酸性の性質のために、塗布後の1×PBSで培養皿の洗浄は、細胞のプレーティング前に必要とされてもよい。 技術および密度めっき その後のアッセイに応じて、めっきのための最適な細胞濃度は、近コンフルエント心筋細胞単層をもたらすべきである。低濃度の特殊化した細胞 - 細胞コンタクタを欠く単一、単離された心筋細胞における細胞生存率及び結果を減少させる一方、高濃度での心筋細胞のめっきは、多層の心筋細胞凝集物および低均一性をもたらすTS（インターカレー円盤状の構造）。心筋細胞はかなり大きくて重いし、ファルコンチューブの底に集中する傾向があることに注意して、めっきのための細胞をピペッティングするとき。メッキ工程間での細胞の再懸濁は、あなたの料理全体の細胞が均等に分配されることを保証します。メッキ時の細胞は、図の形で皿を動かす「8」皿の中央に細胞の濃度を回避する。リポソームトランスフェクションのために指定された新生児心筋細胞の最適な細胞集密度は、めっき後の日70〜80％であるべきである。 血清 細胞培養物の使用量は、めっき媒体中の胎児（または新生児）、ウシ血清およびウマ血清を試験し、めっき工程中に心筋細胞の細胞生存率および付着性が必要である。用いた血清の品質は、めっき/培養手順の間の重要な工程の一つであってもよい。血清の低量の維持培地の補充は任意であるが、しかし、大幅IMPROあり培養時間の長さを見る。
注意：血清の添加は、有意に、培養心筋細胞における生化学的シグナル伝達経路を変化させることができ、実験パラメーター、仮説および結果のその後の解釈に関連して判断してもよい。心筋細胞の無血清培養物10,31に記載されており、血清中に存在する未知の成長因子に起因する結果のスキューを防止することができる。 増殖阻害剤 最終的に分化した心筋細胞は通常、細胞分裂を受けない。しかし、このような、10μMのAraC（シトシン-BD-アラビノフラノシド塩酸塩;シグマC6645）などの増殖抑制剤の添加維持培地には、高度な心臓線維芽細胞および内皮細胞の増殖を防ぐことをお勧めします。偶数心臓線維芽細胞および内皮細胞の集団を減少させるプレめっき工程を加えて、残りの線維芽細胞は、細胞proliを受ける大幅ferationとは、時間の経過とともに培養された細胞集団に変える。
注意：遺伝的要因と分離の時点に応じて、胚および新生児マウスの心筋細胞は、まだ増殖の可能性23,32,33を持つことができる。のAraCの使用は実験パラメータ、仮説や結果の解釈に応じて判断されるべきである 。 変剤の添加 このようなフェニレフリン剤34、（優先的に新生児ラット心筋細胞のための0.1 mMの、シグマP6126）で維持培地の補充、またはイソプロテレノール（優先的に新生児マウスの心筋細胞のための1μM、シグマI6501）が大幅に心筋細胞の広がり、sarcomerogenesisが増加プレートだけでなく、細胞の自然鼓動。しかし、これらの薬剤の添加は、所望のアッセイパラメータ（ 例えば、添加は、収縮挙動および生化学的パラメータをゆがめることができる）に対して計量されるべきである。 トランスフェクション 新生仔マウスの心筋細胞へのDNA / RNAのリポソームトランスフェクションは、トランスフェクションの時点、トランスフェクション試薬、培養密度、DNA / RNA濃度及び使用されるDNA構築物に大きく依存する。私たちは、リポソームトランスフェクション試薬の様々なテストし、エスコートIII（Sigma）およびリポフェクタミン2000（Invitrogen）を適用できるが見つかりました。抗生物質フリーの維持培地をトランスフェクション前に、めっき媒体2時間を置き換えることによって、播種後、細胞を24時間後にトランスフェクト。新生児心筋のトランスフェクションは、30ミリメートル皿で培養し、滅菌したエッペンドルフチューブに200μlのDMEMで1〜2μgのDNAを混合し、希釈したDNA混合物にエスコートIIIの4を添加する。穏やかにDNA /リポソーム複合体の形成を可能にするために、無菌フード内で最低5分間混合し、インキュベートする。 800μlの新鮮な抗生物質を含まない維持培地に抗生物質を含まない維持培地を交換し、細胞にDNA /リポソーム混合物を追加します。細胞にCuで細胞をインキュベートltureインキュベーター、24時間後に新鮮な標準維持培地と交換してください。首尾よくトランスフェクトされた新生仔マウスの心筋細胞のための代表的な結果を図2Hに示されている。 DNAのリン酸カルシウム沈殿を用いてトランスフェクションも可能である。新生仔マウスの心筋細胞の形質移入は、1〜20％の範囲の典型的なトランスフェクション効率で、新生児ラット心筋細胞と比較してより困難である。ウイルスベクターは、より高い効率35-37（：アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルスなど ） を達成するのに必要とされる。新生児心筋細胞のエレクトロポレーションは、DNA / RNAの送達に適さない私たちの手の中にある、しかし、いくつかの報告は、胚および新生児心筋細胞38,39のエレクトロポレーションを用い成功を示している。最近の記事38で、Djurovic らは 、いくつかのトランスフェクション法、成功率だけでなく、それぞれの長所と短所をまとめます。 継代凍結/サント激怒 心筋細胞の継代は1をお勧めしません。長期保管のために孤立し、新生児心筋細胞の凍結は、低効率と低回収率に推奨極めて困難とではありません。いくつかの企業はまた、しかし、条件を最適化する必要があるかもしれない、新生児マウスの心筋細胞の凍結保存に適している人間の心筋細胞初代培養（ 例えば celprogen、カタログ番号M36044-15FM）に特化した凍結培地を提供します。心房の心筋細胞の正常な継代および凍結保存は、トランスジェニックマウスモデル32に記載されている。 実行可能なまたは接着細胞1日めっき後 - 酵素濃度および/または消化時間を短縮
- 変更の酵素混合物
- CHAメディアをメッキするNGE血清
- 変化ECM /コーティング媒体および/または細胞培養皿のタイプ
- 絶縁/消化メディアに20 mMのBDMを追加
- 細胞の混入をチェックする低細胞収量 - 消化時間及び/又は酵素濃度を増加させる
- 単離操作中に遠心時間/速度を上げる
- 増加摩期間不均一なメッキ、培養中の細胞の集密度が高い/低すぎる - 単離操作中に細胞をカウントし、めっき中に細胞/皿の数を調整する
- メッキ濃度を調整
- 慎重に遠心分離後の細胞ペレットを再懸濁し、繰り返しピペッティング（2日目ステップ13）で、めっきの前に、必ず目に見える細胞塊が残っていないことを確認してくださいいいえ破っ細胞ません （：フェニレフリン、イソプロテレノールなど ） -維持培地に変時のエージェントを追加
- メディアを交換してください
- CH心臓線維芽細胞/内皮細胞の高い数のECK 線維芽細胞の数が多い - 単離操作中に追加のプレめっきステップを追加
-維持培地（ 表1）増殖抑制剤を追加多くの死細胞 - 細胞培養培地を交換
- 単離手順中に酵素濃度および/または消化時間を短縮
-検査細胞培養インキュベーター（CO 2、温度、湿度）
- 汚染をチェックする汚染 -無菌細胞培養労働条件21に準拠して
- メディアを交換して、新しいペニシリン/ストレプトマイシン溶液を使用
- 表面の75％エタノール溶液での新生仔マウスを滅菌
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Discussion
心疾患を研究するための動物モデルを使用することは、心臓血管研究の標準となっている。クローサー（ すなわち 、生化学的または生体力学的刺激に心臓細胞の直接の反応を研究する）これらのモデルの生化学的特徴は、一般的に、心臓組織または心筋細胞の単離を必要とする。心の生理学的反応を調査した研究は、生体外 （ 例えば 40をアセチルコリンに対する、または虚血再灌流のシナリオで41）は、一般的に心臓組織の断片の44,45の中で、心筋細胞の調査を可能に外植片培養をしながら、ランゲンドルフ灌流心臓全体42,43を利用する三次元組織環境。しかしながら、外植片組織を培養することは、潜在的な組織の壊死性コア内のクラスタを生成する、栄養分の拡散を妨げることができる。また、心筋細胞が組織内で動かない、したがって、外植片のうち細胞の移動はOBSEです線維芽細胞または推定心臓前駆細胞44のような非心筋細胞のためrved。そのため、分離培養手順の確立を必要とした心筋細胞の発達、細胞生物学、生化学的および生物物理学的動作を調べる。哺乳動物の心筋細胞の単離および培養のための初期のプロトコルは、新生ラットの1,2を使用しています。しかし、遺伝学的研究のためのモデル系としてのマウスの上昇（ すなわち遺伝子改変マウスをノックインまたはノックアウト）を設立し、分離し、培養する方法論の適応を必要とした。残念ながら、新生児マウスの心筋細胞の単離は、より伝統的に使用新生児ラット心筋細胞と比較して特に困難である。提示されたプロトコルは、新生児マウスの心筋細胞の単離および培養に最適化された信頼性の高い、堅牢な方法を説明している。私たちは、解離Aでは、最初の組織抽出のために必要な手順を説明しますND心臓線維芽細胞や内皮細胞から心筋細胞を精製、メッキおよび培養条件のため。プロトコルは、標準的な条件での新生児マウスの心筋細胞の単離および培養の基本的な考え方を提供していますが、それは簡単に新生児ラット心筋細胞の単離および培養のためだけでなく、特定のその後の検定の種類に適合させることができる。単離された細胞の、例えば文化を生体力学的特性を調査するための柔軟な膜（ 例えば Bioflex培養プレート）に、生細胞イメージング、またはxCELLigence心臓E-プレート（ACEA、ロシュ、Cat.-No.：06417051001）での心筋細胞の培養のためのガラスボトムディッシュ（マテック）文化収縮機能に対する薬物の効果を研究する。さらに、我々は、単離および培養手順の最適化のためのオプションを提供し、可能性のある問題とその解決のための情報源について説明します。したがって、このプロトコルは、再現性の高い、最新を調べる研究者を支援する必要があり、新生児マウスの心筋細胞培養物を調製するための手頃な価格の方法。
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Disclosures
なし。
Acknowledgments
私たちは、新生ラットとマウスの心筋細胞の分離技術への導入のための名誉教授ジャン=クロード·PerriardとイヴリンPerriard（テクノロジー、スイスのスイス連邦工科大学）に感謝しています。我々は彼らのサポートのために教授チュ陳教授シルビア·エバンス（UCSD、米国）に感謝したいと思います。 EEの実験室での作業は、MRCキャリア設立助成金によって賄われていた。 SLは、NIH / NHLBI（HL107744）からの独立賞にK99/R00経路によってサポートされています。 TMMは、米国心臓協会（11POST7310066）からのポスドクでサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8 | Sigma | B-0753 | prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47. |
| Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | can be substituted with collagenase type II from Worthington |
| Collagenase type II3 | Worthington | CLS-2 | substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche |
| 1x trypsin solution (0.25%) with EDTA | cellgro | 25-053-CI | |
| 1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS | cellgro | 30-002-Cl | |
| 1x PBS (without Ca2+, Mg2+) | e,g, cellgro | 21-040-CV | |
| HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4 | cellgro | 21-022-CV | |
| DMEM high glucose | cellgro | 10-013-CV | |
| M-199 | cellgro | 10-060-CV | |
| fetal bovine serum | cellgro | 35-011-CV | cell-culture grade |
| horse serum | cellgro | 35-030-CV | cell-culture grade |
| Leibovitz L-155 | cellgro | 10-045-CV | |
| AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride) | Sigma | C-6645 | proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C |
| phenylephrine | Sigma | P-6126 | chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
| isoproterenol hydrochloride | Sigma | I-6501 | chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
| 0.1% collagen solution | Sigma | C-8919 | extracellular matrix for coating |
| 3 mg/ml collagen type 1 solution | Advanced BioMatrix | 5005-B | alternative to Sigma collagen solution |
| cell strainer | Fisherbrand | 22363548 | appropriate filter size:40 μm-100 μm |
| syringe filter 0.2 μm | Fisherbrand | 09-719C | for sterile filtration of digestion medium |
| straight scissors | Fine Sciences Tools | 91460-11 | |
| curved scissors | Fine Science Tools | 91461-11 | |
| Dumont No. 7 forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| perforated spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | optional, for transfer of heart tissue |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | live cell staining |
| Neubauer hemocytometer | Prosource Scientific | 3500 | alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems |
| 50 ml Falcon tubes | Fisherbrand | 14-432-23 | |
| 15 ml Falcon tubes | Fisherbrand | 05-527-90 | |
| 20 ml syringe | BD Medical | 14-820-19 | |
| 10 ml serological pipette | Falcon | 357551 | |
| 30 mm cell culture dish | Nunc | 153066 | for standard culture of cardiomyocytes |
| 30 mm cell culture dish, glass bottom | MatTek | P35G-0-10-C | for live cell imaging with inverted microscope |
| 10 cm cell culture dish | Nunc | 172958 | for preplating |
| Escort III | Sigma | L3037 | for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000 |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies, Invitrogen | 52887 | substitute for Escort III |
Buffers and media:
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References
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