Summary
Los cultivos primarios de cardiomiocitos de ratón son una de las herramientas fundamentales para la investigación de la organización miofibrilar y la función. El siguiente protocolo describe el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos primarios de corazones de ratón neonatales. Los cultivos de cardiomiocitos resultantes pueden usarse posteriormente para una variedad de ensayos biomecánicos, bioquímicos y de células biológica.
Abstract
Cardiomiocitos neonatales cultivadas han sido utilizados para estudiar myofibrillogenesis y funciones miofibrilares. Cardiomiocitos cultivados permiten una fácil investigación y manipulación de las vías bioquímicas, y su efecto sobre las propiedades biomecánicas de latido espontáneo cardiomiocitos.
El siguiente protocolo 2-día describe el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos neonatales de ratón. Mostramos cómo diseccionar fácilmente corazones de los recién nacidos, se disocia el tejido cardíaco y enriquecer los cardiomiocitos de la población celular cardiaca. Se discute el uso de diferentes mezclas de enzima para disociación celular, y sus efectos sobre la viabilidad celular. Los cardiomiocitos aislados se pueden utilizar posteriormente para una variedad de ensayos morfológicos, bioquímicos, electrofisiológicos, de células biológica o biomecánico. Hemos optimizado el protocolo para la robustez y reproducibilidad, mediante el uso de soluciones disponibles en el mercado único y la enzima se mezcla que shpoca variabilidad ujo de lote a lote. También nos ocupamos de los problemas más comunes asociados con el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos, y ofrecemos una variedad de opciones para la optimización de las condiciones de aislamiento y cultivo.
Introduction
Los primeros informes de la disociación de éxito y la cultura de las células del corazón de roedores se remonta a la década de 1960 1,2. Incluso entonces, Harary y Farley notaron que los cardiomiocitos en cultivo "pueden proporcionar un sistema único para el estudio de los requisitos de la contractilidad periódica [, y pueden] proporcionar un medio de determinar la contribución de las diversas vías metabólicas para el proceso [golpes]". Aunque Harary y Farley cardiomiocitos aislados y cultivados de ratas jóvenes, y el protocolo original se ha adaptado y modificado por muchos científicos en los últimos años, el procedimiento de aislamiento y el cultivo en general no ha cambiado mucho. Sin embargo, mejores enzimas 3, soluciones normalizadas de 4,5, y la adición del canal reversible y la miosina ATPasa inhibidor de la BDM para proteger las células durante el procedimiento de aislamiento 6-9 ha mejorado significativamente celular rendimiento y la viabilidad.
Adultos vs miocardiopatía neonatalcitos
Cardiomiocitos aislados y cultivadas a partir de ratones o ratas neonatales tienen varias ventajas sobre los cultivos de cardiomiocitos adultos. Ante todo, el procedimiento de aislamiento para neonatales de ratón o rata corazones es más fácil y menos costoso, en comparación con el aislamiento de cardiomiocitos de rata o ratón adulto 10. Cardiomiocitos neonatales son mucho menos sensibles a la reintroducción en un medio que contiene calcio después de la disociación, aumentando enormemente de células-rendimiento. Otra gran ventaja es que los cardiomiocitos de ratones neonatales se someten a una desdiferenciación más rápido - ciclo de re-diferenciación que da lugar típicamente a latir espontáneamente células 20 horas después de la siembra, mientras que los cardiomiocitos adultos suelen requerir de estimulación para inducir la contracción. Cardiomiocitos neonatales son también más fácilmente transfectable con métodos de transfección liposomal, mientras que los cardiomiocitos adultos requieren vectores virales para la entrega exitosa de ADN transgénico. En contraste con los cardiomiocitos neonataless, la cultura de los cardiomiocitos de roedores adultos 11-13 permite para las investigaciones de la degradación miofibrilar y eventual restablecimiento del aparato contráctil. Estos cambios morfológicos característicos en cardiomiocitos adultos ocurren en períodos de 1 a 2 semanas. La desdiferenciación - ciclo de re-diferenciación está acompañado por la reexpresión del programa genético fetal, imitando así los cambios patológicos observados en las miocardiopatías humanos 14. Otra ventaja de los cardiomiocitos de ratas adultas sobre la cultura de los cardiomiocitos neonatales es la capacidad de estas células de cultivo durante largos períodos de tiempo.
Rata vs cardiomiocitos de ratón
El aislamiento y cultivo de cardiomiocitos neonatales de rata tiene algunas ventajas sobre el de los cardiomiocitos neonatales de ratón, incluyendo mayores rendimientos de células viables y aumento de las tasas de transfección. Sin embargo, el amplio uso de los modelos de ratones genéticamente modificados para las enfermedades cardíacas (por ejemplo </ Em> la lim muscular nocaut proteína de ratón como modelo para la miocardiopatía dilatada 15) ha dado lugar a la adaptación del procedimiento de aislamiento de cardiomiocitos derivados de ratones recién nacidos. Aunque los protocolos utilizados para aislar de rata y ratón cardiomiocitos neonatales son casi idénticos, mayor se debe tener cuidado en la selección de una mezcla de enzima apropiado para este último. De hecho, los cardiomiocitos neonatales de ratón son generalmente más susceptibles a overdigestion, resultando en una célula rendimiento y la viabilidad reducida. Por otra parte, la densidad de placas se debe ajustar, ya que los cardiomiocitos derivados de ratones recién nacidos son algo más pequeñas en comparación con las células derivadas de corazones de ratas neonatales.
Con muchas aplicaciones para la investigación de los parámetros morfológicos, electrofisiológicos, bioquímicos, de células biológicas y biomecánicas, así como para el proceso de myofibrillogenesis, cardiomiocitos neonatales cultivados se han convertido en uno de los sistemas más versátiles para el estudio defunciones de las células cardíacas in vitro. El primer paso para un ensayo de éxito, sin embargo, depende de una metodología sencilla y fiable para aislar los cardiomiocitos de ratones neonatales. Nuestro protocolo se basa su metodología de muchas fuentes y se ha optimizado para la reproducibilidad y robustez. Se discuten los factores que influyen en los cardiomiocitos rendimiento y viabilidad, y ofrecemos una variedad de opciones para la optimización de las condiciones de aislamiento y cultivo.
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Protocol
El siguiente procedimiento describe un 16,17 protocolo de dos días para el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos de ratones neonatales. Todas las soluciones son estériles o estéril filtrada. Todas las herramientas se esterilizan mediante esterilización de la superficie con etanol al 75%. Excepto para la extracción inicial del tejido, todas las medidas se llevan a cabo en una campana de cultivo de células de flujo laminar estéril. Este protocolo está diseñado para el aislamiento de corazones neonatales de ratón desde uno hasta dos camada (s) - aproximadamente 5-14 cachorros, pero puede ser adaptado para tamaños de las camadas más grandes y de rata cardiomiocitos neonatales. Uso de los medios de la escala / de la enzima en su caso.
Para el trabajo con los roedores neonatales, consulte las directrices de la universidad local y las normas establecidas por el poder legislativo y / o programas de cuidado de los animales, y se adhieren a su animal protocolo aprobado institucionalmente. Todos los métodos descritos en este protocolo han sido aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión Institucional de la UC San Diego (IACUC), y se adhieren a federeglamentos rales y estatales.
Día 1.
1. El aislamiento del tejido cardiaco de ratones recién nacidos
- Preparar 50 ml de 1x PBS (sin Ca 2 +, Mg 2 +) suplementado con 20 mM de BDM 6-8, y se disperse en dos platos bacterianas estériles colocados en hielo.
- Preparar 10 ml de medio de aislamiento en 50 ml tubo Falcon estéril cónico. Mantenga todas las soluciones en hielo. Esterilizar tijeras (una curva, una recta), y pinzas (curvas, Dumont N º 7).
- Ratones recién nacidos de 1-3 días de edad se aclaran rápidamente en solución de etanol al 75% para la esterilización de la superficie. Los cachorros son decapitados con unas tijeras estériles (heterosexuales), y el pecho se abre a lo largo del esternón para poder acceder a la cavidad torácica y el corazón (Figura 1A, Supplemental Película S1).
Comentario técnico: los ratones neonatales mayores de 3 días se pueden usar, pero dan lugar a un menor número de células viables 2. - Corazones se extraen deel cuerpo con tijeras curvas y se trasladará inmediatamente a la placa bacteriana que contiene 1x PBS (sin Ca 2 +, Mg 2 +) con 20 mM BDM, en hielo. Todos los pasos siguientes se realizan en la campana de cultivo celular estéril.
- Retire el tejido pulmonar, los buques más grandes (y aurículas, si se desea). Corazones Lave la solución 1x PBS (sin Ca 2 +, Mg 2 +) con 20 mM BDM (en hielo) para quitar la sangre. Transferencia lavó corazones de primer plato en el segundo plato bacteriano que contiene 1x PBS (sin Ca 2 +, Mg 2 +) con 20 mM de BDM (en hielo) el uso de fórceps o una cuchara perforada (Figura 1B).
- Transferencia limpiado / lavado corazones en una gota de medio de aislamiento (aproximadamente 250 l; Figura 1C) en un tercer plato bacteriana (en hielo) y el uso de las tijeras curvadas para picar corazones en trozos pequeños (aproximadamente 0,5-1 mm 3, o más pequeñas; Figura 1D, 1E).
- Traslado corazones picados en una cónicatubo que contiene 10 ml del medio de aislamiento (en hielo), y se incuba con agitación suave a 4 ° C durante la noche.
Día 2.
2. Tissue digestión enzimática y Plating de células
- Pesar en 15 mg de mezcla de colagenasa / dispasa (Roche), y disolver la mezcla de enzima en 10 ml de L15-medio suplementado con 5 mM de BDM 20 (medio de la digestión). Filtro estéril el medio de la digestión en la campana de cultivo de células en un nuevo tubo Falcon de 50 ml estéril.
- Preparar 30 ml de medio L-15 suplementado con 20 mM de BDM, y medio en placa.
- Se recubren las placas de cultivo celular con solución de colágeno (Sigma C-8919) durante un mínimo de 1 hora. Retire la solución de colágeno (puede ser reutilizado) y de colágeno recubierto platos de cultivo de células secas en la campana de flujo laminar de cultivo celular estéril.
- Retire el tubo cónico que contiene el corazón predigested de 4 ° C. Fragmentos de tejido deben ser agregados (Figura 1G). Deje que los fragmentos de tejido se hunden hastala parte inferior del tubo y eliminar el sobrenadante (asegurarse de no perder ningún fragmentos de tejido;. normalmente, aproximadamente 1 ml del medio de aislamiento pueden permanecer en el tubo). Añadir 5 ml de medio de digestión y 5 ml de L-15 suplementado con 20 mM de BDM para fragmentos de tejido y la suspensión de compuestos oxigenados que utilizan oxígeno o aire durante 1 min.
- Transferir el tubo cónico de sellado que contiene los fragmentos de tejido cardíaco en medio de la digestión a 37 ° C baño de agua durante aproximadamente 2 min para ajustar la temperatura de la solución de digestión.
- Incubar los fragmentos de tejido cardiaco a 37 ° C con agitación suave durante 20-30 min (por ejemplo agitador a 37 ° C, se establece en no más de 60 rpm). Tiempos de digestión pueden depender en gran medida de la mezcla de enzimas y número de lote Precaución:. Periodos de incubación más largos o más altas concentraciones de enzimas pueden reducir la viabilidad celular.
Comentarios técnicos: Se recomienda el uso de una mezcla de colagenasa / dispasa de Roche (Cat.No.: 10269638001), que tiene muy poca variabilidad de lote a lote. La enzima clásica para el aislamiento de cardiomiocitos de ratón es la tripsina y / o colagenasa tipo II 3,16-20 disponible de Worthington (Cat. n CLS-2). Sin embargo, el rendimiento de la colagenasa II puede diferir sustancialmente de lote a lote. Worthington típicamente permite el ensayo de varios lotes de colagenasa para optimizar los tiempos de digestión y el uso de enzimas. Alternativamente, Worthington vende un kit de aislamiento de cardiomiocitos con una mezcla de enzimas previamente probado incluido que se puede adaptar para el aislamiento de los cardiomiocitos de ratones 17 (Cat. No.: NCIS).
- Coloque células colador estéril (40-100 malla de nylon micras) en frescos estériles de 50 ml tubo Falcon cónica. Filtro de células pre-mojado con 5 ml L-15 suplementado con 20 mM BDM. Fragmentos de tejido se tritura suavemente utilizando una pre-humedecida 10 ml de cultivo celular de la pipeta durante aproximadamente 10-20 veces. Los fragmentos de tejido deben dispersar todo durante este paso, la liberación de las células en suspensioN (Figura 1H).
- Deje que los fragmentos de tejido más grandes de sedimento y sobrenadante de transferencia que contiene células suspendidas en el tubo cónico fresco a través de células colador (Figura 1I).
- Vuelva a suspender los fragmentos de tejido sin digerir en 5 ml medio de digestión y se incuba durante otros 5-10 minutos a 37 ° C con agitación suave.
- Después de continuar la digestión de los fragmentos de tejido restantes, se tritura suavemente el tejido por 10-20 veces y añadir al tubo que contiene células cónicas a partir de la primera digerir a través de filtro de células. Enjuagar la célula-filtro con 5 ml de L-15 suplementado con 20 mM de BDM para permitir el paso de todas las células digeridas.
- Tubo cónico de centrifugado que contiene los cardiomiocitos en suspensión durante 5 min a 300 rpm (aprox. 50-100 xg). Eliminar el sobrenadante (que contiene en su mayoría fibroblastos y células endoteliales) y volver a suspender sedimento celular en 10 ml enchapado medio.
- Las células de la placa en placa de cultivo de 10 cm de células (Figura 2A) y se incuba durante 1HR -3 en cultivo celular incubadora. Esta etapa de pre-chapado elimina los fibroblastos y las células endoteliales (Figura 2B), que se adherirá a la placa de cultivo celular no recubierto (Figura 2C).
- Después de la incubación, se lavan los cardiomiocitos no adherentes a partir de 10 cm de plato de cultivo (volver a suspender las células pipeteando repetidamente el medio en placa sobre el plato), y las células se resuspendieron de transferencia a un tubo de centrífuga cónico Falcon estéril (15 ml o 50 ml).
Opcional: Repetir la etapa de pre-galjanoplastia para eliminar los fibroblastos adicionales de suspensión celular. Si se desea, las células de fibroblasto y endoteliales adherentes pueden ser cultivadas adicionalmente. - Contar las células (por ejemplo, utilizando hemocitómetro Neubauer, tripán exclusión de azul de tinción 21).
- Las células de la placa en colágeno recubierto placas de cultivo celular con una densidad de aproximadamente 1,5 x 10 5 células por cm 2 (Figura 2D; véanse también los comentarios en la Tabla 1 en el chapadoy de recubrimiento).
Coloque la vajilla en cultivo celular incubadora y dejar en reposo durante 12 a 18 horas para permitir la adherencia y la difusión de los cardiomiocitos.
Día 3 - Cultura de los cardiomiocitos neonatales
- Preparar un medio de mantenimiento y precalentamiento en 37 ° C baño de agua. Consulte la Tabla 1 para la adición de inhibidores de la proliferación o agentes cronotrópicos, o el procedimiento de transfección liposomal de cardiomiocitos de ratones neonatales.
- Un día después de la siembra, los cardiomiocitos deberían haber adherido a la placa de cultivo celular y de manera óptima comenzar espontáneamente a contraerse (Figura 2E, 2F; Suplementario película de S2; consulte la Tabla 2 para los problemas comunes durante el procedimiento de aislamiento / cultura). Reemplace chapado medio con medio de mantenimiento, y la cultura de otros 1-5 días. Cambio de medio según sea necesario.
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Representative Results
El uso de este protocolo, se aislaron los corazones de 8 un día de edad ratones recién nacidos (Figuras 1A, 1B, Supplemental Película S1). Después de lavar y picar los corazones con las tijeras (figuras 1C-1F), fragmentos de tejido fueron predigerido en medio de aislamiento durante la noche a 4 ° C con agitación suave. Siguiendo predigestion (Figura 1G), transferimos los fragmentos de tejido en un medio de digestión recién hecho, y se incubaron los fragmentos de tejido durante 20 minutos a 37 ° C con agitación suave. La suspensión de células resultante (Figura 1H) se filtró a través de un filtro de células (Figura 1G). Después de la centrifugación, las células sedimentadas se resuspendieron en 8 ml de medio de baño y preplated en una placa de cultivo de 10 cm de células (Figura 2A), y se cultivaron durante 2 horas para permitir la unión de los fibroblastos cardíacos y las células endoteliales (Figuras 2B, 2C). Las células que no se adhieren rápidamente fueron resuspendido en el medio en placa. 10 l de la suspensión celular que contiene los cardiomiocitos se pipetteted en un tubo Eppendorf y se tiñeron con una solución de azul de tripano en una proporción de 1:1. Las células se contaron usando un contador de células automatizado, lo que resulta en aproximadamente 5,1 x 10 5 células vivas / ml enchapado medio. Después del recuento, las células se sembraron en cuatro de 30 mm de colágeno recubierto placas de cultivo celular (2 ml por placa), lo que resulta en aproximadamente 1 x 10 6 células sembradas por placa (1.4 x 10 5 células / cm 2; Figura 2D). 18 horas después de la siembra, los cardiomiocitos se fijaron a las placas de cultivo de células de colágeno recubierto (con aproximadamente el 70% de confluencia) y comenzaron a contraerse de forma espontánea (Figura 2E, Supplemental Película S2). Posteriormente, los cardiomiocitos se utilizaron ya sea para la transfección liposomal (véase la Tabla 1) o las células se transfirieron directamente de las planchas en el medio de mantenimiento (Figura 2F) y se cultivaron durante otros 3 días. Tras el cultivo, los cardiomiocitos se lavaron brevemente en 1x PBS, se fijaron durante 5 min en PFA al 4% / PBS y se procesaron para inmunofluorescencia tal como se describe en una de nuestras publicaciones recientes 22. Los resultados representativos que muestran cultivos de cardiomiocitos no transfectadas y transfectadas inmunológicamente teñidas se muestran en las Figuras 2G y 2H, respectivamente. Los cardiomiocitos neonatales cultivadas muestran la citoarquitectura de esperar, como es evidente a partir de la visualización de las miofibrillas (señal roja en la figura 2G) y las estructuras similares a discos intercalados (señal verde en la figura 2G). También son susceptibles de transfecciones transitorias, como se ve en la Figura 2H (señal verde es la proteína transfectada; contratinción señal roja de miofibrillas utilizando un anticuerpo actinina-alfa sarcomérica).
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Figura 1. Aislamiento de tejido cardiaco de ratones neonatales. A) El corazón se retira cuidadosamente del tórax utilizando pinzas curvas (véase también Suplementario película de S1). B) Corazones aislados de 8 neonatos se lavan en 1x PBS (sin Ca 2 +, Mg 2 +) suplementado con 20 mM BDM en hielo. C) Corazones se transfieren en una gota de medio de aislamiento. DE) Picado de corazones neonatales con unas tijeras curvas. F) Transferencia de tejido cardíaco picada con una pipeta previamente mojado. G) tejido cardíaco predigerido después de la incubación durante la noche a 4 ° C. H) cardiomiocitos en suspensión después de 20 minutos de la digestión y la trituración. Tejido cardíaco no digerida se acumula en la parte inferior del tubo. I) La suspensión de aislado Cardiomyocytes se filtra a través de un filtro de células.
Figura 2. Cultura de los cardiomiocitos neonatales de ratón y las imágenes de inmunofluorescencia representativas. Una) Revestimiento de células aisladas en el principio de la pre-chapado paso. B) los fibroblastos cardíacos y las células endoteliales comienzan a adherirse a la placa de cultivo celular no recubierto después de 1-3 horas de la cultura durante el pre-plating paso. C) Después de la resuspensión de los cardiomiocitos no adherentes, que quedan fibroblastos cardíacos y células endoteliales pueden ser cultivadas adicionalmente, si se desea. D) Revestimiento de aislados y purificados cardiomiocitos neonatales de ratón en colágeno recubierto platos de cultivo celular . E) Después de 18 horas en la cultura, los cardiomiocitos se adhieren a la d recubiertoparroquias, y óptimamente iniciar las contracciones espontáneas (ver también la película Suplementario S2). F) Sustitución del medio en placa con medio de mantenimiento elimina las células muertas de la cultura. A)-F) Barra de escala 0,2 mm. G) imagen inmunofluorescencia Representante de los cardiomiocitos de ratones neonatales, teñidas con anticuerpos contra myomesin (hibridoma Estudios del Desarrollo del Banco, Iowa, MMAC myomesin B4, en rojo) y la beta-catenina (Sigma, Cat.-No .: C2206, en verde). Barra de escala 10 micras. H) Imagen inmunofluorescencia Representante de los cardiomiocitos de ratones neonatales transfectadas con la proteína expresada GFP-etiquetados en verde (GFP fragmento-titina-N2B), y alfa-actinina (Sigma, Cat.-No.A-7811) en rojo . Barra de escala 20 micras. Un método para la transfección y la tinción inmunológica utilizado en 2G) y 2H) se puede encontrar en la Tabla 1, y se resume en una de nuestras publicaciones recientes 22.
Película S1 Suplementario. Película S2 Suplementario. Haga clic aquí para ver la película suplementario . Tabla 1. Optimización de las condiciones de recubrimiento y de la cultura, la transfección liposomal. Tabla 2. Solución de problemas. Hay muchos factores que pueden afectar el éxito en el aislamiento y cultivo de células primariass. Por favor, consulte los manuales como "Culture of Animal Cells", por Ian Freshney 21, como introducciones generales en las técnicas básicas de cultivo celular. Las posibles causas de los problemas en el aislamiento y cultivo de procedur cardiomocytes neonatales de ratón que nos encontramos más a menudo se enumeran en esta tabla. Pre-chapado Pre-plating de las células después del aislamiento elimina en gran medida los fibroblastos cardíacos y células endoteliales de toda la mezcla de células. Una sola etapa de pre-plating elimina aproximadamente el 50-80% de los no cardiomiocitos de la población celular. No se recomienda la repetición de pre-chapado más de dos veces, así como de los tiempos pre-chapado de más de 3 horas, debido a la pérdida adicional de los miocitos cardíacos. La sustitución de pre-chapado con-gradiente de Percoll 23,24 puede mejorar la pureza de la población celular de cardiomiocitos. Sustrato de recubrimiento y cultivo celular Revestimiento de platos de cultivo celular con exde la matriz extracelular (ECM) componentes como colágeno, fibronectina, laminina, mezclas de ECM complejos (es decir, matrigel 25,26) o sustratos artificiales (es decir, polímero de silicona 27, de organosilano 28) influye positivamente en la adherencia de los cardiomiocitos, la viabilidad celular y la propagación de células durante la fase inicial de chapado y para el período de cultivo subsiguiente. En particular, la cultura de los cardiomiocitos en sustratos de vidrio requiere que el recubrimiento de la superficie con los componentes de ECM para lograr la adhesión adecuada de los cardiomiocitos.
Hemos probado recubrimiento de cultivo de células tratadas sustratos de plástico y de vidrio con una variedad de componentes de ECM, incluyendo la solución 0,1% de colágeno (Sigma C-8919), tipo 3 mg / ml de colágeno 1 solución (avanzada Biomatrix, PureCol), solución de gelatina al 1% ( Sigma G9391; disuelto en H2O, esterilizado en autoclave), soluciones de laminina (Sigma L4544), o mezclas de ECM complejos derivados de los corazones de cerdos 29 o fibroblastos cardiacos 30. Cultu Celularre platos se incubaron con las soluciones ECM de un mínimo de 1 hora a toda la noche en la incubadora de cultivo de células, y después de la eliminación de la ECM se seca en la campana de flujo laminar de cultivo celular. Soluciones ECM se pueden reutilizar muchas veces (10-20 veces) si la esterilidad y la integridad de proteínas de ECM durante el almacenamiento prolongado se mantiene (por ejemplo, almacenamiento a 4 º C o congelado). Precaución, debido a la naturaleza ácida de algunos de los tampones utilizados para disolver las proteínas ECM, de lavado de placas de cultivo con 1x PBS después del revestimiento puede ser necesario antes de chapado de las células. Plating técnica y densidad Dependiendo de los ensayos posteriores, las concentraciones de células óptimas para chapado deberían resultar en monocapas en cardiomiocitos cerca de la confluencia. Plating de los cardiomiocitos en altas concentraciones resultan en cardiomiocitos agregados de varias capas y bajo la homogeneidad, mientras que las concentraciones bajas reduce la viabilidad y resultados celular en cardiomiocitos individuales, aislados y fuera de contac-célula especializadats (estructuras en forma de discos intercalados). Al pipetear células para el recubrimiento tenga en cuenta que los cardiomiocitos son bastante grandes y pesadas, y tienden a concentrarse en la parte inferior del tubo Falcon. La resuspensión de las células en entre los pasos de recubrimiento garantiza una distribución uniforme de las células a través de sus platos. Cuando las células se mueven plating platos en la forma de una figura de "8" para evitar la concentración de las células con el centro del plato. La confluencia óptima de cardiomiocitos neonatales designado para la transfección liposomal debe ser alrededor de 70 a 80% el día después de la siembra. Suero El uso de cultivo celular a prueba fetal (o al recién nacido) de suero bovino y suero de caballo en el medio en placa es necesaria para la viabilidad celular y la adhesión de los cardiomiocitos durante la etapa de recubrimiento. La calidad del suero utilizado puede ser uno de los pasos críticos durante el procedimiento de chapado / cultura. La suplementación del medio de mantenimiento con bajas cantidades de suero es opcional, sin embargo, puede en gran medida Improhe duración del tiempo de cultivo.
Precaución: la adición de suero puede alterar significativamente las vías de señalización bioquímicos en cultivos de cardiomiocitos y puede ser juzgada con respecto a los parámetros experimentales, hipótesis y la posterior interpretación de los resultados. Cultivos sin suero de los cardiomiocitos se han descrito 10,31, y pueden prevenir el sesgo de los resultados debido a factores de crecimiento desconocidos presentes en el suero. Inhibidores de la proliferación Cardiomiocitos diferenciados terminalmente no suelen someterse a la división celular. Sin embargo, la adición de inhibidores de la proliferación, tales como AraC 10 M (Citosina-BD-arabino-furanósido hidrocloruro, Sigma C6645) para el medio de mantenimiento se recomienda el prevenir la proliferación de fibroblastos cardíaco y células endoteliales. Incluso con la adición de pasos de pre-chapado para reducir la población de fibroblastos cardíacos y las células endoteliales, los fibroblastos restantes se someterán a Proli celularesferation y cambiar significativamente la población celular cultivada con el tiempo.
Precaución: en función de los factores genéticos y el punto de tiempo de aislamiento, los cardiomiocitos embrionarios y neonatales ratón aún pueden tener potencial proliferación 23,32,33. Uso de AraC debe ser juzgado en función de los parámetros experimentales, hipótesis y la interpretación de los resultados. La adición de agentes cronotrópicos La suplementación del medio de mantenimiento con agentes 34, como la fenilefrina (0,1 mM, preferentemente de cardiomiocitos de rata neonatal; Sigma P6126), o isoproterenol (1 M, preferentemente de cardiomiocitos de ratones neonatales; Sigma I6501) aumenta en gran medida sarcomerogénesis, difusión de los cardiomiocitos en el placa, así como golpes espontánea de las células. Sin embargo, la adición de estos agentes debe sopesarse con respecto a los parámetros deseados del ensayo (por ejemplo, adición puede sesgar el comportamiento contráctil y parámetros bioquímicos). Transfección Liposomal transfección de ADN / ARN en cardiomiocitos neonatales de ratón depende en gran medida del punto de tiempo de la transfección, reactivo de transfección, la densidad de cultivo, la concentración de ADN / ARN y construcción de ADN utilizado. Hemos probado una variedad de reactivos de transfección liposomales y encontramos ESCORT III (Sigma) y lipofectamina 2000 (Invitrogen) aplicable. Transfectar células 24 horas después de la siembra mediante la sustitución de las planchas del medio 2 horas antes de la transfección con antibióticos medio libre de mantenimiento. Para la transfección de cardiomiocitos neonatales cultivados en 30 mm platos, mezcle 1-2 g de ADN con 200 l de DMEM en un tubo eppendorf estéril y añadir 4 l de Escort III a la mezcla de ADN diluido. Mezclar suavemente e incubar durante un mínimo de 5 minutos en la campana estéril para permitir la formación de complejos de ADN / liposoma. Vuelva a colocar el medio de mantenimiento antibióticos libres con medio de mantenimiento 800 antibióticos libres l frescos y agregue la mezcla de ADN / liposomas a las células. Se incuban las células en Cu celularincubadora lture y reemplazar con medio de mantenimiento estándar fresco después de 24 hr. Un resultado representativo de los cardiomiocitos de ratones neonatales transfectadas con éxito se muestra en la Figura 2H. La transfección usando precipitación con calcio del ADN también es posible. La transfección de los cardiomiocitos de ratones neonatales es más difícil en comparación con los cardiomiocitos de rata neonatal, con eficiencias de transfección típicos que van desde un 1-20%. Se requieren vectores virales para lograr eficiencias más altas 35-37 (por ejemplo: adenovirus, virus adeno-asociado, lentivirus). La electroporación de cardiomiocitos neonatales está en nuestras manos no aptas para la entrega de ADN / ARN, sin embargo, según varios informes de éxito usando la electroporación de los cardiomiocitos embrionarios y neonatales 38,39. En un reciente artículo 38, Djurovic et al. Resumir varios métodos de transfección, las tasas de éxito, así como sus ventajas y desventajas. Congelación pases / Storabia El pase de los cardiomiocitos no se recomienda 1. La congelación de los cardiomiocitos neonatales aislados para el almacenamiento prolongado es extremadamente difícil y no es recomendable debido a la baja eficiencia y bajas tasas de recuperación. Varias compañías ofrecen soporte congelación especializado para las culturas humanas en cardiomiocitos primarios (por ejemplo celprogen, cat. No. M36044-15FM) que también pueden ser adecuados para la criopreservación de los cardiomiocitos de ratones neonatales, sin embargo puede ser necesario optimizar las condiciones. El pases con éxito y la crioconservación de los miocitos auriculares se ha descrito en un modelo de ratón transgénico 32. No hay células viables o adherentes 1 días después de la siembra - Reducir la concentración de enzima y / o el tiempo de digestión
- Cambio de mezcla de enzimas
- Chasuero ESN para chapado medio
- Medio y / o el tipo de placas de cultivo celular de cambio ECM / recubrimiento
- Añadir mM BDM 20 a los medios de aislamiento / digestión
- Comprobar la contaminación de las células Rendimiento celular Baja - Aumentar el tiempo de digestión y / o concentración de la enzima
- Tiempo de aumento de centrifugación / velocidad durante el procedimiento de aislamiento
- Período de aumento de la trituración Confluencia de las células en cultivo es demasiado baja / alta; desigual chapado - Contar las células durante el proceso de aislamiento y ajustar el número de células / placa durante chapado
- Ajustar la concentración de recubrimiento
- Resuspender cuidadosamente sedimento celular después de la centrifugación de las placas, y por pipeteo repetido (día 2 el paso 13), asegúrese de que no hay teléfonos grumos visibles siguen siendo No hay células latiendo - Añadir agentes cronotrópicos al medio de mantenimiento (por ejemplo: la fenilefrina, isoproterenol)
- Sustituir medio
- Check para alto número de fibroblastos cardiacos / células endoteliales Alto número de fibroblastos - Add paso preplating adicional durante el procedimiento de aislamiento
- Añadir inhibidor de la proliferación de medio de mantenimiento (Tabla 1) Muchas células muertas - Sustituir el medio de cultivo celular
- Reducir la concentración de enzima y / o el tiempo de digestión durante el procedimiento de aislamiento
- Celular cheque cultura incubadora (CO 2, temperatura, humedad)
- Comprobar la contaminación Contaminación - Cumplir con las condiciones de trabajo de cultivo celular estéril 21
- Sustituir medio, utilice la nueva solución de penicilina / estreptomicina
- Superficie esterilizar ratones recién nacidos con una solución de etanol al 75%
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Discussion
El uso de modelos animales para estudiar las enfermedades cardíacas se ha convertido en estándar en la investigación cardiovascular. Más cerca de la caracterización bioquímica de estos modelos (es decir, el estudio de respuestas directas de las células cardíacas a los estímulos bioquímicos o biomecánicos) típicamente requiere el aislamiento de los tejidos del corazón o los cardiomiocitos. Los estudios que investigan las respuestas fisiológicas del corazón ex vivo (por ejemplo, a la acetilcolina 40, o en los escenarios de la isquemia-reperfusión 41) generalmente utilizan corazones enteros Langendorff perfundidos 42,43, mientras que cultivos de explantes 44,45 de fragmentos de tejido cardíaco permitan el desarrollo de las investigaciones de los cardiomiocitos en un entorno de tejido tridimensional. Sin embargo, el cultivo de tejidos de explantes puede obstaculizar la difusión de nutrientes, generando potencialmente un clúster necrótica en el núcleo del tejido. Por otra parte, los cardiomiocitos son inmóviles dentro del tejido, por lo tanto, la migración de células de explantes es sólo ELOBSErved para los no cardiomiocitos, como fibroblastos o supuestas células progenitoras cardiacas 44. Investigando el comportamiento del desarrollo, de la célula biológica, bioquímica y biofísica de los cardiomiocitos requeridos por lo tanto, el establecimiento de aislamiento y procedimientos de cultivo. Los protocolos iniciales para el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos mamíferos utilizan ratas neonatales 1,2. Sin embargo, el aumento del ratón como sistema modelo para estudios genéticos (es decir, genéticamente modificado knock-in o knock-out ratones) hizo necesaria la adaptación de la aislamiento establecidos y metodologías de cultivo. Desafortunadamente, el aislamiento de los cardiomiocitos neonatales de ratón es particularmente difícil en comparación con la de los cardiomiocitos de rata neonatal utilizados más tradicionalmente. El protocolo presentado describe un método fiable y robusto optimizado para el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos neonatales de ratón. Se describen los pasos necesarios para la extracción inicial del tejido, para la disociación de unnd purificación de los cardiomiocitos de los fibroblastos cardíacos y células endoteliales, y para las condiciones de recubrimiento y la cultura. Mientras que el protocolo ofrece un enfoque básico para el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos neonatales de ratón en condiciones estándar, que puede ser fácilmente adaptado para el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos de rata neonatal, así como para los tipos específicos de ensayo posteriores: por ejemplo, cultivo de las células aisladas en las membranas flexibles (por ejemplo Bioflex placas de cultivo) para investigar las propiedades biomecánicas, cultura en platos de fondo de cristal (MatTek) para imágenes de células vivas, o de la cultura de los cardiomiocitos en xCELLigence cardio e-placas (Acea, Roche, Ref. N º: 06417051001) para estudiar los efectos de los fármacos sobre las funciones contráctiles. Además, ofrecemos opciones para la optimización del aislamiento y procedimiento de cultivo y se discuten las fuentes de posibles problemas y sus soluciones. Por lo tanto, este protocolo debe ayudar a los investigadores que examinan una puesta al día, altamente reproducible ymétodo económico para la preparación de cultivos de cardiomiocitos neonatales de ratón.
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Disclosures
Ninguno.
Acknowledgments
Estamos muy agradecidos con el profesor emérito Jean-Claude Perriard y Evelyn Perriard (Instituto Federal de Tecnología de Suiza, Suiza) para la introducción en las técnicas de aislamiento de rata neonatal y cardiomiocitos de ratón. Nos gustaría dar las gracias al profesor Ju Chen y el Prof. Sylvia Evans (UCSD, EE.UU.) por su apoyo. El trabajo en el laboratorio de EE fue financiado por un MRC Carrera Establishment Grant. SL es apoyado por una vía K99/R00 otorgar independencia de la NIH / NHLBI (HL107744). TMM fue apoyado por una beca postdoctoral de la American Heart Association (11POST7310066).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8 | Sigma | B-0753 | prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47. |
| Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | can be substituted with collagenase type II from Worthington |
| Collagenase type II3 | Worthington | CLS-2 | substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche |
| 1x trypsin solution (0.25%) with EDTA | cellgro | 25-053-CI | |
| 1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS | cellgro | 30-002-Cl | |
| 1x PBS (without Ca2+, Mg2+) | e,g, cellgro | 21-040-CV | |
| HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4 | cellgro | 21-022-CV | |
| DMEM high glucose | cellgro | 10-013-CV | |
| M-199 | cellgro | 10-060-CV | |
| fetal bovine serum | cellgro | 35-011-CV | cell-culture grade |
| horse serum | cellgro | 35-030-CV | cell-culture grade |
| Leibovitz L-155 | cellgro | 10-045-CV | |
| AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride) | Sigma | C-6645 | proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C |
| phenylephrine | Sigma | P-6126 | chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
| isoproterenol hydrochloride | Sigma | I-6501 | chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
| 0.1% collagen solution | Sigma | C-8919 | extracellular matrix for coating |
| 3 mg/ml collagen type 1 solution | Advanced BioMatrix | 5005-B | alternative to Sigma collagen solution |
| cell strainer | Fisherbrand | 22363548 | appropriate filter size:40 μm-100 μm |
| syringe filter 0.2 μm | Fisherbrand | 09-719C | for sterile filtration of digestion medium |
| straight scissors | Fine Sciences Tools | 91460-11 | |
| curved scissors | Fine Science Tools | 91461-11 | |
| Dumont No. 7 forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| perforated spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | optional, for transfer of heart tissue |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | live cell staining |
| Neubauer hemocytometer | Prosource Scientific | 3500 | alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems |
| 50 ml Falcon tubes | Fisherbrand | 14-432-23 | |
| 15 ml Falcon tubes | Fisherbrand | 05-527-90 | |
| 20 ml syringe | BD Medical | 14-820-19 | |
| 10 ml serological pipette | Falcon | 357551 | |
| 30 mm cell culture dish | Nunc | 153066 | for standard culture of cardiomyocytes |
| 30 mm cell culture dish, glass bottom | MatTek | P35G-0-10-C | for live cell imaging with inverted microscope |
| 10 cm cell culture dish | Nunc | 172958 | for preplating |
| Escort III | Sigma | L3037 | for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000 |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies, Invitrogen | 52887 | substitute for Escort III |
Buffers and media:
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References
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