Summary
Cultures de cardiomyocytes de souris primaires sont un des outils les pivots de l'enquête de l'organisation et de la fonction myofibrillaire. Le protocole suivant décrit l'isolement et la culture des cardiomyocytes primaires de coeurs de souris néonatales. Les cultures de cardiomyocytes résultants peuvent être ensuite utilisés pour une variété de tests biomécaniques, biochimiques et cellulaires biologiques.
Abstract
Cardiomyocytes néonataux en culture ont longtemps été utilisés pour étudier myofibrillogenesis et fonctions myofibrillaires. Cardiomyocytes cultivés permettent d'enquête facile et la manipulation des voies biochimiques, et leur effet sur les propriétés biomécaniques de battre cardiomyocytes spontanément.
Le protocole 2 jours suivant décrit l'isolement et la culture de cardiomyocytes de souris néonatales. Nous montrons comment disséquer facilement cœur de nouveau-nés, dissocier le tissu cardiaque et d'enrichir les cardiomyocytes de la cellule-population cardiaque. Nous discutons de l'utilisation de différents mélanges d'enzymes pour dissociation des cellules, et leurs effets sur les cellules-viabilité. Les cardiomyocytes isolés peuvent ensuite être utilisés pour une variété d'analyses morphologiques, biochimiques, électrophysiologiques de cellules biologiques ou biomécanique. Nous avons optimisé le protocole pour la robustesse et la reproductibilité, en utilisant des solutions seulement disponibles dans le commerce et l'enzyme mélanges que show peu de variabilité de lot à lot. Nous abordons également les problèmes courants liés à l'isolement et la culture des cardiomyocytes, et offrons une variété d'options pour l'optimisation des conditions d'isolement et de culture.
Introduction
Les premiers rapports de la dissociation de succès et de la culture de cellules cardiaques de rongeurs remonte au 1960 1,2. Même alors, Harary et Farley ont remarqué que des cardiomyocytes cultivés "peuvent fournir un système unique pour l'étude des exigences de la contractilité périodique [, et peuvent] fournir un moyen de déterminer la contribution des différentes voies métaboliques pour la [battre] processus». Bien Harary et Farley cardiomyocytes isolés et cultivés de jeunes rats, et le protocole original a été adapté et modifié par de nombreux scientifiques au cours des années, l'isolement et la culture procédure générale n'a pas beaucoup changé. Cependant, l'amélioration des enzymes, des solutions standardisées 3 4,5, et l'addition de la chaîne et un inhibiteur réversible de la myosine ATPase BDM à protéger les cellules au cours de la procédure d'isolement 6-9 a considérablement amélioré le rendement de cellules et la viabilité.
Adulte vs cardiomyo néonatalecytes
Cardiomyocytes isolés et cultivés à partir de souris ou de rats nouveau-nés ont plusieurs avantages par rapport à des cultures de cardiomyocytes adultes. Tout d'abord, la procédure d'isolement de rat ou de souris néonatales coeurs est plus facile et moins coûteux, par rapport à l'isolement des cardiomyocytes à partir de souris ou de rat adulte 10. Cardiomyocytes néonataux sont beaucoup moins sensibles à la réintroduction dans un milieu contenant du calcium après dissociation, augmentant considérablement cellule rendement. Un autre grand avantage est que les cardiomyocytes de souris néonatales subissent une dédifférenciation plus rapide - cycle de redifférenciation qui se traduit généralement par battant spontanément cellules 20 heures après l'étalement, tout en cardiomyocytes adultes ont généralement besoin de stimulation pour induire la contraction. Cardiomyocytes néonataux sont également plus facilement transfectable avec des méthodes de transfection liposomale, alors que les cardiomyocytes adultes exigent des vecteurs viraux pour la livraison réussie de l'ADN transgénique. Contrairement aux cardiomyocytes néonatauxs, la culture de cardiomyocytes de rongeurs adultes de 11 à 13 permet à des investigations de la dégradation myofibrillaire et rétablissement éventuel de l'appareil contractile. Ces changements morphologiques caractéristiques de cardiomyocytes adultes se produisent sur des périodes de 1-2 semaines. La dédifférenciation - cycle de re-différenciation s'accompagne de réexpression du programme de gène foetal, mimant ainsi les changements pathologiques observées dans les cardiomyopathies humaines 14. Un autre avantage de cardiomyocytes de rats adultes de plus la culture de cardiomyocytes néonataux est la capacité de la culture de ces cellules pendant de longues périodes de temps.
Rat vs cardiomyocytes de souris
L'isolement et la culture des cardiomyocytes néonataux de rat a quelques avantages par rapport à celle des cardiomyocytes néonataux de souris, y compris des rendements plus élevés de cellules viables et une augmentation des taux de transfection. Cependant, la large utilisation de modèles de souris génétiquement modifiées pour les maladies cardiaques (par exemple </ Em> la lim de protéines musculaires souris knock-out comme modèle pour la cardiomyopathie dilatée 15) a conduit à l'adaptation de la procédure d'isolement pour les cardiomyocytes dérivés de souris néonatales. Bien que les protocoles utilisés pour isoler des cardiomyocytes de rat et de souris néonatales sont presque identiques, plus il faut prendre soin dans le choix d'un mélange d'enzyme approprié pour celui-ci. En effet, les cardiomyocytes de souris néonatales sont généralement plus sensibles à une digestion excessive, résultant dans une cellule-rendement et la viabilité réduite. En outre, la densité de placage doit être ajusté, cardiomyocytes, car dérivées de souris néonatale sont un peu plus petite par rapport à des cellules dérivées de coeurs de rats nouveau-nés.
Avec beaucoup d'utilisations pour l'enquête de paramètres morphologiques, électrophysiologiques, biochimiques, cellulaires biologiques et biomécaniques ainsi que pour le processus de myofibrillogenesis, cardiomyocytes néonataux de culture sont devenus l'un des systèmes les plus polyvalents pour l'étude deles fonctions des cellules cardiaques in vitro. Toutefois, la première étape d'un essai réussi dépend d'une méthodologie simple et fiable pour isoler les cardiomyocytes de souris néonatales. Notre protocole tire sa méthodologie de nombreuses sources et a été optimisée pour la reproductibilité et la robustesse. Nous discutons des facteurs qui influent sur cardiomyocytes rendement et la viabilité, et offrons une variété d'options pour l'optimisation des conditions d'isolement et de culture.
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Protocol
La procédure qui suit décrit un protocole de 16,17 à deux jours pour l'isolement et la culture des cardiomyocytes de souris néonatales. Toutes les solutions sont stériles ou stérilisées par filtration. Tous les outils sont stérilisés par stérilisation de surface avec 75% d'éthanol. À l'exception de l'extraction initiale du tissu, toutes les étapes sont réalisées dans une cellule à flux laminaire culture hotte stérile. Ce protocole est destiné à l'isolation des coeurs de souris néonatales une à deux litière (s) - environ 5-14 chiots, mais peut être adapté pour les grandes tailles de litière et rat cardiomyocytes néonataux. l'utilisation des médias de l'échelle / enzyme, le cas échéant.
Pour les travaux de rongeurs nouveau-nés, reportez-vous à vos directives et les règles de l'université locale énoncées par les programmes de protection des animaux législatif et / ou, et adhérer à votre protocole animale institutionnel approuvé. Toutes les méthodes décrites dans le présent protocole ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle UC San Diego (IACUC), et adhérer à federal et règlements étatiques.
Jour 1.
Une. Isolation du tissu cardiaque de souris néonatale
- Préparer 50 ml de 1 x PBS (sans Ca 2 +, Mg 2 +) supplémenté avec 20 mM BDM 6-8, et à disperser en deux plats bactériennes stériles placés sur de la glace.
- Préparer 10 ml de milieu d'isolement dans 50 ml de tubes de Falcon conique stérile. Gardez toutes les solutions sur la glace. Stériliser ciseaux (une courbe; une droite), et des pinces (courbes, Dumont n ° 7).
- Souris nouveau-nées âgées de 1-3 jours sont rincées rapidement dans une solution d'éthanol à 75% pour la stérilisation de la surface. Les chiots sont décapités à l'aide de ciseaux stériles (de droite), et le coffre est ouvert le long du sternum pour permettre l'accès à la cavité de la poitrine et le cœur (figure 1A, film supplémentaire S1).
Commentaire technique: souris néonatales de plus de 3 jours peut être utilisé, mais le résultat en moins de cellules viables 2. - Les coeurs sont extraites dele corps avec des ciseaux courbes et transféré immédiatement dans la capsule bactérienne contenant 1 x PBS (sans Ca 2 +, Mg 2 +) avec 20 mM BDM, sur de la glace. Toutes les étapes suivantes sont effectuées sous la hotte de culture cellulaire stérile.
- Retirer le tissu pulmonaire, les grands navires (et oreillettes, si vous le souhaitez). Coeurs lavage dans la solution PBS 1x (sans Ca 2 +, Mg 2 +) mM BDM 20 (sur la glace) pour enlever le sang. Transfert lavé cœur du premier plat dans le second plat bactérienne contient 1x PBS (sans Ca 2 +, Mg 2 +) mM BDM 20 (sur la glace) en utilisant une pince ou une cuillère perforée (figure 1B).
- Transfert nettoyé / lavé coeurs dans une goutte de milieu d'isolement (environ 250 pi; figure 1C) dans un troisième plat bactérienne (sur la glace) et utiliser les ciseaux courbes pour hacher coeurs en petits morceaux (environ 0,5-1 mm 3, ou plus petites; Figure 1D, 1E).
- Transfert coeurs hachées dans une coniquetube contenant 10 ml de milieu d'isolement (sur de la glace), et incuber sous agitation douce à 4 ° C pendant une nuit.
Jour 2.
2. Tissue digestion enzymatique et placage de cellules
- Peser 15 mg de mélange collagénase / dispase (Roche), et dissoudre le mélange d'enzymes dans 10 ml L15-5 milieu supplémenté avec 20 mM BDM (milieu de digestion). Filtre stérile du milieu de digestion dans la hotte de culture cellulaire dans un nouveau 50 ml tube Falcon stérile.
- Préparer 30 ml de milieu L-15 supplémenté avec 20 mM BDM, et moyen de placage.
- Manteau de plaques de culture cellulaire avec une solution de collagène (Sigma C-8919) pour un minimum de 1 heure. Retirer la solution de collagène (peut être réutilisé) et revêtues de collagène plats de culture cellulaire sec en écoulement laminaire stérile hotte de culture cellulaire.
- Retirer le tube conique contenant le cœur prédigéré de 4 ° C. fragments de tissus doivent être regroupées (figure 1G). Laissez les fragments de tissus coulentle fond du tube et retirer le surnageant (assurez-vous de ne pas perdre des fragments de tissus;. normalement, environ 1 ml de milieu d'isolement peuvent rester dans le tube). Ajouter 5 ml de milieu de digestion et de 5 ml de L-15 supplémenté avec 20 mM BDM de fragments de tissus et de suspension à l'aide de composés oxygénés de l'oxygène ou de l'air pendant 1 min.
- Transférer le tube conique scellée contenant les fragments de tissus cardiaques dans du milieu de digestion à 37 ° C bain d'eau pendant environ 2 min pour ajuster la température de la solution de digestion.
- Incuber des fragments de tissus cardiaques à 37 ° C avec agitation douce pendant 20-30 min (par exemple agitateur à 37 ° C, mis à pas plus de 60rpm). temps de digestion peuvent dépendre fortement de mélange d'enzymes et le numéro de lot. Attention: les périodes d'incubation plus longues ou des concentrations d'enzymes plus élevées peuvent réduire la viabilité cellulaire.
Commentaire technique: Nous recommandons l'utilisation d'un mélange de collagénase / dispase de Roche (Cat.No.: 10269638001) qui a très peu de variabilité de lot à lot. L'enzyme classique pour l'isolement des cardiomyocytes de souris est la trypsine et / ou de la collagénase de type II 3,16-20 disponible auprès de Worthington (Cat n ° CLS-2). Cependant, les performances de la collagénase II pourra différer sensiblement de lot à lot. Worthington permet généralement à l'essai de plusieurs lots collagénase d'optimiser les temps de digestion enzymatique et l'utilisation. Sinon, Worthington vend un kit d'isolement des cardiomyocytes avec un mélange d'enzymes pré-testé inclus qui peuvent être adaptés pour l'isolement des cardiomyocytes de souris 17 (Cat n °: NCIS).
- Placez cellule-filtre stérile (40-100 um de maille de nylon) en frais stériles de 50 ml tube conique faucon. Tamis cellulaire pré-humide avec 5 ml de L-15 complété par mM BDM 20. Fragments de tissus délicatement triturer l'aide d'un pré-mouillé 10 ml de culture cellulaire pipette pour environ 10-20 fois. Les fragments de tissus devraient principalement disperser au cours de cette étape, la libération des cellules en suspension (figure 1H).
- Laissez fragments de tissus plus grands sédiments et surnageant de transfert contenant des cellules en suspension dans le tube conique frais à travers la cellule-filtre (figure 1I).
- Re-suspendre les fragments de tissus digérés dans 5 ml de milieu de digestion et incuber pendant 5-10 min de plus un à 37 ° C avec agitation douce.
- Après digestion continue de fragments de tissus restants, triturer doucement tissu pour 10-20 fois et ajouter aux cellules du tube contenant coniques de la première digérer par tamis cellulaire. Rincer la cellule-filtre avec 5 ml de L-15 supplémenté avec 20 mM BDM pour permettre le passage de toutes les cellules digérées.
- Tube conique centrifugée contenant les cardiomyocytes en suspension pendant 5 min à 300 rpm (env. 50-100 xg). Eliminer le surnageant (contenant principalement des fibroblastes et des cellules endotheliales) et remettre en suspension culot cellulaire dans 10 ml de milieu de placage.
- Cellules de la plaque dans 10 cm boîte de culture cellulaire (figure 2A) et incuber pendant 1-3 Heures en cellule incubateur de culture. Cette étape de pré-placage supprime les fibroblastes et les cellules endotheliales (Figure 2B), qui adhère à la boîte de culture cellulaire non revêtu (Figure 2C).
- Après incubation, laver les cardiomyocytes non adhérentes à partir de 10 plat cm de culture (cellules remettre en suspension en pipetant à plusieurs reprises le milieu de plaquage sur le plat), et les cellules remises en suspension de transfert à un tube Falcon de centrifugation conique stérile (15 ml ou 50 ml).
Facultatif: Répétez l'étape de pré-dépôt de supprimer les fibroblastes supplémentaires de suspension cellulaire. Si on le souhaite, les cellules endothéliales et de fibroblastes adhérentes peuvent être ensuite mis en culture. - Compter les cellules (par exemple en utilisant Neubauer hématimètre, exclusion du bleu Trypan coloration 21).
- cellules dans revêtues de collagène des boîtes de culture cellulaire avec une densité d'environ 1,5 x 10 5 cellules par cm 2 (figure 2D plaque; voir également les commentaires au tableau 1 de placageet revêtement).
Placez les plats dans la cellule incubateur de culture et laisser reposer pendant 12-18 heures pour permettre l'adhésion et la diffusion des cardiomyocytes.
Jour 3 - Culture des cardiomyocytes néonataux
- Préparer un milieu d'entretien et préchauffer à 37 ° C bain d'eau. Reportez-vous au tableau 1 pour l'addition d'inhibiteurs de prolifération ou agents chronotropes, ou la procédure pour la transfection liposomale de cardiomyocytes de souris néonatales.
- Un jour après l'étalement, cardiomyocytes auraient adhéré à la boîte de culture cellulaire et de façon optimale commencer spontanément à se contracter (figure 2E, 2F; supplémentaire Film S2; reportez-vous au tableau 2 pour des problèmes communs au cours de la procédure d'isolement / culture). Remplacer milieu d'étalement avec le milieu de la maintenance et de la culture pour d'autres 1-5 jours. Changer le milieu comme nécessaire.
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Representative Results
En utilisant ce protocole, nous avons isolé les cœurs de 8 âge d'un jour souriceaux nouveau-nés (figures 1A, 1B, film supplémentaire S1). Après lavage et hacher les coeurs avec des ciseaux (figures 1C-1F), des fragments de tissus ont été prédigérés en milieu d'isolement pendant une nuit à 4 ° C sous agitation douce. À la suite de prédigestion (Figure 1G), on a transféré les fragments de tissus fraîchement préparé en milieu de digestion, et on incube les fragments de tissus pendant 20 minutes à 37 ° C avec agitation douce. La suspension cellulaire résultante (Figure 1H) a été filtré à travers un tamis cellulaire (figure 1G). Après la centrifugation, le culot cellulaire a été remis en suspension dans 8 ml de placage moyen et preplated dans une boîte de culture de 10 cm de cellules (figure 2A), et mises en culture pendant 2 heures pour permettre la fixation des fibroblastes cardiaques et les cellules endothéliales (figures 2B, 2C). Les cellules qui ne se fixent rapidement étaient reen suspension dans le milieu de plaquage. 10 ul de la suspension cellulaire contenant des cardiomyocytes a été pipetteted dans un tube Eppendorf et on les colore avec une solution de bleu trypan dans un rapport de 1:1. Les cellules ont été comptées en utilisant un compteur de cellules automatisé, ce qui entraîne environ 5,1 x 10 5 cellules vivantes / ml en milieu de placage. Après comptage, les cellules ont été étalées dans quatre revêtues de collagène des boîtes de culture cellulaire de 30 mm (2 ml par boîte), résultant en environ 1 x 10 6 cellules étalées par boite (1,4 x 10 5 cellules / cm 2, la figure 2D). 18 heures après l'étalement, les cardiomyocytes ont été fixés aux revêtues de collagène des boîtes de culture cellulaire (à environ 70% de confluence) et ont commencé à se contracter spontanément (Figure 2E, Supplemental Film S2). Par la suite, les cardiomyocytes ont été soit utilisés pour la transfection liposomale (voir le tableau 1) ou les cellules ont été transférées directement du placage dans le milieu d'entretien (Figure 2F) et cultivées pendant encore 3 jours. Après la culture, les cardiomyocytes ont été brièvement lavées en PBS 1x, fixe pendant 5 min dans 4% PFA / PBS et traitées pour immunofluorescence comme décrit dans l'une de nos publications récentes 22. Les résultats représentatifs décrivant des cultures de cardiomyocytes non transfectées et transfectées colorées immunologiquement sont présentés sur les figures 2G et 2H, respectivement. Les cardiomyocytes néonataux en culture présentent l'cytoarchitecture prévu, comme il ressort de la visualisation des myofibrilles (le signal rouge sur la figure 2G) et les structures en forme de disques intercalaires (signal vert sur la figure 2G). Ils sont aussi prêtent à des transfections transitoires, comme on le voit sur la figure 2H (signal vert est la protéine transfectée; signal de contre-coloration rouge de myofibrilles en utilisant un anticorps de l'alpha-actinine sarcomère).
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Figure 1. Isolement du tissu cardiaque de souris nouveau-nées. A) Le cœur est soigneusement retirée du thorax en utilisant une pince incurvés (voir également complémentaires de film S1). B) de coeurs isolés à partir de 8 nouveau-nés sont lavés dans du PBS 1x (sans Ca 2 +, Mg 2 +) complété par mM BDM 20 sur la glace. C) coeurs sont transférés dans une goutte de milieu d'isolement. DE) Mincing des cœurs néonatals l'aide de ciseaux courbes. F) de transfert de tissu cardiaque hachée à l'aide d'une pipette pré-mouillé. G) du tissu cardiaque après prédigéré incubation pendant une nuit à 4 ° C. H) cardiomyocytes en suspension après 20 min de digestion et la trituration. Tissu cardiaque non digéré s'accumule au fond du tube. I) La suspension de isolé cardiomyocytes est filtré à travers un tamis cellulaire.
Figure 2. Culture de cardiomyocytes de souris néonatales et des images d'immunofluorescence représentatives. A) Plaquage de cellules isolées au début de la pré-placage étape. B) les fibroblastes cardiaques et les cellules endothéliales commencent à adhérer à la boîte de culture cellulaire non revêtu après 1-3 h de la culture au cours de la pré-placage C étape.) Après remise en suspension de cardiomyocytes non-adhérentes, qui restent les fibroblastes cardiaques et les cellules endotheliales peuvent être ensuite mis en culture, si on le souhaite. D) Revêtement de cardiomyocytes de souris néonatales isolées et purifiées à revêtues de collagène plats de culture cellulaire . E) Après 18 heures de culture, les cardiomyocytes adhèrent à la d enduitparoisses, et commencer de façon optimale contractions spontanées (voir également Movie supplémentaire S2). F) Remplacement de la moyenne de placage avec le milieu de l'entretien élimine les cellules mortes de la culture. A)-F) Scalebar 0,2 mm. G) image immunofluorescence représentant de cardiomyocytes de souris néonatales, colorées avec des anticorps contre myomesin (développement des études Hybridoma Banque, Iowa, mmac myomesin B4, en rouge) et la bêta-caténine (Sigma, Cat. No .: C2206, en vert). Scalebar 10 um. H) image immunofluorescence représentant de cardiomyocytes de souris néonatales transfectées avec la protéine exprimée de la GFP-étiquetée en vert (fragment GFP-titine-N2B), et l'alpha-actinine (Sigma, Cat.-No.A-7811) en rouge . SCALEBAR 20 um. Procédé pour la transfection et la coloration immunologique utilisé dans 2G) et 2H) peut être trouvé dans le tableau 1, et est résumé dans l'un de nos publications récentes 22.
Film supplémentaire S1. Film supplémentaire S2. Cliquez ici pour voir le film supplémentaire . Tableau 1. Optimisation de placage et de conditions de culture, transfection liposomale. Tableau 2. Dépannage. Plusieurs facteurs peuvent affecter l'isolement succès et la culture de cellules primairess. S'il vous plaît consulter les manuels tels que «Culture de cellules animales" par Ian Freshney 21, comme introduction générale sur les techniques de base de culture de cellules. Les causes possibles de problèmes dans l'isolement et la culture procedur de cardiomocytes de souris néonatales que nous avons rencontrés sont le plus souvent répertoriés dans ce tableau. Pré-placage Pré-plaquage de cellules après isolement élimine grandement les fibroblastes et les cellules endothéliales cardiaques à partir du mélange de cellules entières. Une étape de pré-placage unique élimine environ 50-80% des non-cardiomyocytes de la cellule-population. Répétition de pré-placage plus de deux fois, ainsi que de l'époque pré-placage de plus de 3 heures n'est pas recommandé, en raison de la perte supplémentaire de myocytes cardiaques. Substitution de pré-placage avec gradient de Percoll-23,24 peut améliorer la pureté de la population de cellules cardiomyocytes. Substrat de revêtement et de la culture cellulaire Revêtement de plats de culture cellulaire avec son exla matrice extracellulaire (ECM) des composants tels que le collagène, la fibronectine, la laminine, des mélanges d'ECM complexes (c.-à-matrigel 25,26) ou des substrats artificiels (par exemple un polymère de silicone 27, organosilane 28) influence positivement cardiomyocyte adhérence, la viabilité cellulaire et de la cellule d'étalement au cours de l'étape de plaquage initial et pour la durée de la culture subséquente. En particulier la culture des cardiomyocytes sur des substrats de verre nécessite le revêtement de la surface avec des composants de l'ECM pour obtenir une bonne adhérence de cardiomyocytes.
Nous avons testé revêtement de culture de cellules traitées plastique et en verre substrats avec une variété de composants de l'ECM, y compris une solution à 0,1% de collagène (Sigma C-8919), de type 1 de solution (Advanced Biomatrix, de PureCol) 3 mg / ml de collagène, une solution de gélatine à 1% ( Sigma G9391, dissous dans H 2 O, à l'autoclave), des solutions de laminine (Sigma L4544), ou des mélanges d'ECM complexes dérivés de coeurs de porcs 29 ou 30 fibroblastes cardiaques. Cellule culture boîtes ont été incubées avec les solutions de l'ECM pour un minimum de 1 heure à toute la nuit dans l'incubateur de culture cellulaire, et après élimination de la MEC séchée sous hotte à flux laminaire de culture cellulaire. solutions d'ECM peuvent être réutilisées de nombreuses fois (10 à 20 fois) si la stérilité et l'intégrité de la protéine d'ECM pendant un stockage prolongé est maintenu (par exemple, stockage à 4 ° C ou congelé). Attention, en raison de la nature acide de certains des tampons utilisés pour dissoudre les protéines de la MEC, le lavage des boîtes de culture avec PBS 1x après le revêtement peut être nécessaire avant le placage des cellules. Placage technique et la densité Selon des analyses ultérieures, les concentrations cellulaires optimales pour le placage devraient se traduire par des monocouches confluentes près de cardiomyocytes. Plaquage de cardiomyocytes à des concentrations élevées résultent en des agrégats de cardiomyocytes multicouches et de faible homogénéité, alors que des concentrations faibles réduisent la viabilité des cellules et les résultats individuels, dans les cardiomyocytes isolés dépourvu de contac spécialisé cellule-cellulets (structures en forme de disque intercalées). Lors du pipetage des cellules pour le placage garder à l'esprit que les cardiomyocytes sont plutôt grands et lourds, et ont tendance à se concentrer sur le fond du tube de faucon. Remise en suspension des cellules entre les deux étapes de placage assure une répartition homogène de cellules tout au long de vos plats. Lorsque les cellules se déplacent placage plats en forme de "8" pour éviter la concentration des cellules vers le centre du plat. La confluence optimale des cardiomyocytes néonataux désigné pour transfection liposomale devrait être autour de 70-80% le jour après l'étalement. Sérum L'utilisation de la culture cellulaire testé foetal (ou nouveau-né) de sérum de veau et du sérum de cheval dans le milieu de revêtement est nécessaire pour la viabilité cellulaire et l'adhésion des cardiomyocytes pendant l'étape de placage. La qualité de la sérum utilisé peut être l'une des étapes critiques au cours de la procédure de placage / de culture. Supplémentation du milieu de l'entretien avec de faibles quantités de sérum est facultatif, mais peut grandement Improve durée du temps de culture.
Attention: l'addition de sérum peut modifier de manière significative les voies de signalisation biochimiques dans des cardiomyocytes cultivés et peut être jugé par rapport aux paramètres expérimentaux, hypothèse et l'interprétation ultérieure des résultats. Cultures sans sérum de cardiomyocytes ont été décrits 10,31, et peuvent empêcher de biaiser les résultats en raison de facteurs de croissance inconnus présents dans le sérum. Les inhibiteurs de prolifération Cardiomyocytes différenciées en phase terminale ne subissent généralement pas de division cellulaire. Cependant, l'addition d'inhibiteurs de la prolifération, tels que 10 uM de l'AraC (cytosine-BD-arabino-furanoside chlorhydrate; Sigma C6645) pour le milieu d'entretien est fortement recommandé d'empêcher la prolifération de fibroblastes et de cellules endothéliales cardiaques. Même avec l'addition d'étapes de pré-placage pour réduire la population de fibroblastes cardiaques et les cellules endothéliales, les fibroblastes restants seront soumis à des cellules proliferation et changer de façon significative la cellule-population cultivée au fil du temps.
Attention: en fonction de facteurs génétiques et l'isolement point dans le temps, les cardiomyocytes embryonnaires et néonatale souris peuvent encore avoir la prolifération 23,32,33 potentiel. L'utilisation de AraC doit être jugé en fonction de paramètres expérimentaux, hypothèse et l'interprétation des résultats. L'addition d'agents chronotropes La supplémentation du milieu d'entretien avec des agents 34 tels que la phenylephrine (0,1 mM, de préférence pour des cardiomyocytes de rats nouveau-nés; Sigma P6126), ou l'isoprotérénol (1 uM, de manière préférentielle pour les cardiomyocytes de souris néonatales; Sigma I6501) augmente considérablement sarcomerogenesis, étalement de cardiomyocytes à l' plaque ainsi que les coups spontanée des cellules. Cependant, l'ajout de ces agents doit être évalué par rapport aux paramètres de dosage souhaités (par exemple addition peut fausser le comportement contractile et paramètres biochimiques). Transfection Liposomale transfection d'ADN / ARN en cardiomyocytes de souris néonatales est fortement dépendante de la transfection point dans le temps, un réactif de transfection, la densité de la culture, la concentration d'ADN / ARN et une construction d'ADN utilisée. On a testé une variété de réactifs de transfection de liposomes et on a trouvé ESCORT III (Sigma) et de la lipofectamine 2000 (Invitrogen) applicable. Transfecter des cellules 24 h après l'étalement en remplaçant le placage milieu 2 heures avant la transfection avec du milieu de maintenance libre des antibiotiques. Pour la transfection des cardiomyocytes néonataux en culture dans 30 des plats de mm, mélanger 1-2 pg d'ADN avec 200 ul de DMEM dans un tube Eppendorf stérile et ajouter 4 ul de Escort III au mélange d'ADN diluée. Mélanger doucement et incuber pendant au moins 5 minutes dans la hotte stérile pour permettre à l'ADN / liposome formation du complexe. Remplacez le support de maintenance libres antibiotiques-milieu d'entretien de 800 antibiotiques libres ul frais et ajouter le mélange ADN / liposome pour les cellules. Incuber les cellules dans des cellules culture incubateur et le remplacer par un milieu d'entretien norme frais après 24 h. Un résultat représentatif de cardiomyocytes néonataux de souris transfectées avec succès est représenté sur la figure 2H. La transfection en utilisant une précipitation de calcium de l'ADN est également possible. La transfection de cardiomyocytes de souris néonatales est plus difficile par rapport à cardiomyocytes de rats nouveau-nés, avec des efficacités de transfection typiques allant de 1-20%. Les vecteurs viraux sont nécessaires pour atteindre des rendements plus élevés de 35 à 37 (par exemple: un adenovirus, un virus adéno-associé, lentivirus). Électroporation des cardiomyocytes néonataux est dans nos mains impropres à la livraison de l'ADN / ARN, mais plusieurs rapports montrent le succès en utilisant l'électroporation des cardiomyocytes embryonnaires et néonatale 38,39. Dans un récent article 38, Djurovic et al. Résumer plusieurs méthodes de transfection, les taux de réussite ainsi que leurs avantages et leurs inconvénients. Le repiquage de congélation / Storage Le repiquage des cardiomyocytes n'est pas recommandée 1. Gel des cardiomyocytes néonataux isolés pour un stockage prolongé est extrêmement difficile et pas recommandable en raison de la faible efficacité et faible taux de recouvrement. Plusieurs compagnies offrent milieu de congélation spécialisé pour les cultures humaines cardiomyocytes primaires (par exemple celprogen, chat. Pas. M36044-15FM) qui peuvent également être adapté pour la cryoconservation des cardiomyocytes de souris néonatales, mais les conditions peuvent avoir besoin d'être optimisé. Le succès des passages et la cryoconservation des cardiomyocytes auriculaires ont été décrites dans un modèle de souris transgénique 32. Pas de cellules viables ou adhérentes un jour après l'étalement - Réduire la concentration de l'enzyme et / ou le temps de digestion
- Mélange d'enzymes de modification
- Chasérum nge pour placage moyen
- À moyen et / ou le type de boîtes de culture cellulaire changement ECM / revêtement
- Ajouter mM BDM 20 à l'isolement médias / digestion
- Vérifier la contamination de cellules Rendement cellulaire bas - Augmenter le temps de la digestion et / ou de la concentration d'enzyme
- Augmentation du temps de centrifugation / vitesse durant la procédure d'isolement
- Majoration de la période de trituration Confluence des cellules en culture est trop faible / élevé; plaquage irrégulier - Compter les cellules au cours de la procédure d'isolement et d'ajuster le nombre de cellules / boîte pendant le placage
- Ajuster la concentration plaquage
- Remettre en suspension soigneusement culot cellulaire après centrifugation et avant l'ensemencement par pipetage répété (jour 2 de l'étape 13), assurez-vous qu'aucun cellulaires touffes visibles demeurent Pas de cellules battant - Ajouter des agents chronotropes de milieu d'entretien (par exemple: la phényléphrine, isoprotérénol)
- Remplacer à moyen
- Check pour nombre de fibroblastes cardiaques / cellules endothéliales Grand nombre de fibroblastes - Ajouter l'étape de prédépôt supplémentaire pendant la procédure d'isolement
- Ajouter un inhibiteur de la prolifération de milieu d'entretien (tableau 1) Beaucoup de cellules mortes - Remplacer le milieu de culture cellulaire
- Réduire la concentration de l'enzyme et / ou le temps de digestion au cours de la procédure d'isolement
- Chèque culture cellulaire incubateur (CO 2, température, humidité)
- Vérifier la contamination Contamination - Adhérer à la culture cellulaire stérile conditions de travail 21
- Remplacer milieu, utiliser la nouvelle solution de pénicilline / streptomycine
- Surface stériliser souriceaux nouveau-nés avec une solution d'éthanol à 75%
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Discussion
L'utilisation de modèles animaux pour étudier les maladies cardiaques est devenu un standard dans la recherche cardiovasculaire. La caractérisation biochimique rapprocher de ces modèles (c.-à étudier les réponses directes des cellules cardiaques à des stimuli biochimiques ou biomécaniques) nécessite généralement l'isolement des tissus cardiaques ou cardiomyocytes. Les études portant sur les réactions physiologiques du cœur ex vivo (par exemple à l'acétylcholine 40, ou dans les scénarios d'ischémie-reperfusion 41) utilisent généralement entiers cœur de Langendorff perfusé 42,43, tandis que les cultures d'explants de 44,45 fragments de tissus cardiaques permettre des enquêtes de cardiomyocytes dans un environnement de tissu en trois dimensions. Toutefois, la mise en culture d'explants de tissus peut gêner la diffusion de nutriments, ce qui peut générer une grappe dans le coeur nécrotique du tissu. En outre, les cardiomyocytes sont immobiles dans le tissu, donc la migration des cellules sur des explants n'est observed pour les non-cardiomyocytes, comme les fibroblastes ou les cellules progénitrices cardiaques putatifs 44. Enquêter sur le comportement de développement, cellules biologiques, biochimiques et biophysiques des cardiomyocytes requis donc la mise en place de l'isolement et des procédures de culture. Les premiers protocoles pour l'isolement et la culture des cardiomyocytes de mammifères utilisent des rats nouveau-nés 1,2. Toutefois, la hausse de la souris en tant que système modèle pour les études génétiques (c. génétiquement modifié knock-in ou knock-out souris) a nécessité l'adaptation de l'isolement créé et méthodologies en culture. Malheureusement, l'isolement des cardiomyocytes de souris néonatales est particulièrement difficile par rapport à celle des cardiomyocytes de rats nouveau-nés plus traditionnellement utilisés. Le protocole présenté décrit un procédé fiable et robuste optimisé pour l'isolement et la culture des cardiomyocytes de souris néonatales. Nous décrivons les mesures nécessaires pour l'extraction initiale du tissu, de la dissociation d'unnd purification de cardiomyocytes à partir de fibroblastes cardiaques et les cellules endothéliales, et pour les conditions de placage et de la culture. Alors que le protocole offre une approche de base pour l'isolement et la culture des cardiomyocytes de souris néonatales dans des conditions standard, il peut être facilement adapté pour l'isolement et la culture des cardiomyocytes de rats nouveau-nés, ainsi que pour des types particuliers d'analyse ultérieures: par exemple, la culture des cellules isolées sur les membranes flexibles (par exemple Bioflex plaques de culture) pour enquêter sur les propriétés biomécaniques, la culture dans les plats à fond de verre (MatTek) pour l'imagerie des cellules vivantes, ou de la culture des cardiomyocytes dans xCELLigence cardio e-plaques (Acea, Roche, Cat.-No.: 06417051001) d'étudier les effets des médicaments sur les fonctions contractiles. En outre, nous offrons des options pour l'optimisation de l'isolement et de la procédure de la culture et de discuter des sources de problèmes possibles et leurs solutions. Par conséquent, ce protocole devrait aider les chercheurs l'examen d'une mise à jour, hautement reproductible etméthode abordable pour la préparation des cultures de cardiomyocytes de souris néonatales.
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Disclosures
Aucun.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants envers le professeur émérite Jean-Claude Perriard et Evelyn Perriard (Institut fédéral suisse de technologie, Suisse) pour l'introduction dans les techniques d'isolation pour rat nouveau-né et les cardiomyocytes de souris. Nous tenons à remercier le professeur Chen Ju et le professeur Sylvia Evans (UCSD, USA) pour leur soutien. Le travail dans le laboratoire de l'EE a été financé par une subvention d'établissement de la MRC de carrière. SL est soutenu par une voie K99/R00 à l'octroi de l'indépendance du NIH / NHLBI (HL107744). TMM a été soutenue par une bourse de recherche postdoctorale de l'American Heart Association (11POST7310066).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8 | Sigma | B-0753 | prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47. |
| Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | can be substituted with collagenase type II from Worthington |
| Collagenase type II3 | Worthington | CLS-2 | substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche |
| 1x trypsin solution (0.25%) with EDTA | cellgro | 25-053-CI | |
| 1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS | cellgro | 30-002-Cl | |
| 1x PBS (without Ca2+, Mg2+) | e,g, cellgro | 21-040-CV | |
| HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4 | cellgro | 21-022-CV | |
| DMEM high glucose | cellgro | 10-013-CV | |
| M-199 | cellgro | 10-060-CV | |
| fetal bovine serum | cellgro | 35-011-CV | cell-culture grade |
| horse serum | cellgro | 35-030-CV | cell-culture grade |
| Leibovitz L-155 | cellgro | 10-045-CV | |
| AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride) | Sigma | C-6645 | proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C |
| phenylephrine | Sigma | P-6126 | chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
| isoproterenol hydrochloride | Sigma | I-6501 | chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
| 0.1% collagen solution | Sigma | C-8919 | extracellular matrix for coating |
| 3 mg/ml collagen type 1 solution | Advanced BioMatrix | 5005-B | alternative to Sigma collagen solution |
| cell strainer | Fisherbrand | 22363548 | appropriate filter size:40 μm-100 μm |
| syringe filter 0.2 μm | Fisherbrand | 09-719C | for sterile filtration of digestion medium |
| straight scissors | Fine Sciences Tools | 91460-11 | |
| curved scissors | Fine Science Tools | 91461-11 | |
| Dumont No. 7 forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| perforated spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | optional, for transfer of heart tissue |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | live cell staining |
| Neubauer hemocytometer | Prosource Scientific | 3500 | alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems |
| 50 ml Falcon tubes | Fisherbrand | 14-432-23 | |
| 15 ml Falcon tubes | Fisherbrand | 05-527-90 | |
| 20 ml syringe | BD Medical | 14-820-19 | |
| 10 ml serological pipette | Falcon | 357551 | |
| 30 mm cell culture dish | Nunc | 153066 | for standard culture of cardiomyocytes |
| 30 mm cell culture dish, glass bottom | MatTek | P35G-0-10-C | for live cell imaging with inverted microscope |
| 10 cm cell culture dish | Nunc | 172958 | for preplating |
| Escort III | Sigma | L3037 | for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000 |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies, Invitrogen | 52887 | substitute for Escort III |
Buffers and media:
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References
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