Summary
Primære mus cardiomyocyte kulturer er et af de centrale redskaber til undersøgelse af myofibrillar organisation og funktion. Følgende protokol beskriver isolering og dyrkning af primære cardiomyocytter fra neonatale mus hjerter. De resulterende cardiomyocyte kulturer kan efterfølgende anvendes til en række af biomekaniske, biokemiske og cellebaserede biologiske assays.
Abstract
Dyrkede neonatale cardiomyocytter har længe været anvendt til at undersøge myofibrillogenesis og myofibrillære funktioner. Dyrkede cardiomyocytes giver mulighed for nem undersøgelse og manipulation af biokemiske veje, og deres virkning på de biomekaniske egenskaber spontant slå cardiomyocytter.
Den følgende 2-dages protokol beskriver isolering og dyrkning af neonatale mus cardiomyocytes. Vi viser, hvordan du nemt dissekere hjerter fra nyfødte, adskille hjertevæv og berige kardiomyocytter fra hjertets celle-populationen. Vi diskuterer brugen af forskellige enzym blandinger for celle-dissociation, og deres virkninger på celle-levedygtighed. De isolerede cardiomyocytter efterfølgende kan anvendes til en række morfologiske, elektrofysiologiske, biokemiske celle-biologiske eller biomekaniske analyser. Vi optimeret protokollen for robusthed og reproducerbarhed ved kun kommercielt tilgængelige løsninger, og enzym blander at show lille lot-til-lot variation. Vi henvender os også fælles problemer forbundet med isolering og dyrkning af cardiomyocytes, og tilbyder en bred vifte af muligheder for optimering af isolerings-og dyrkningsbetingelser.
Introduction
De tidligste rapporter for en vellykket dissociation og kultur af gnaver hjerteceller daterer sig tilbage til 1960'erne 1,2. Selv da Harary og Farley bemærket, at dyrkede cardiomyocytter "kan give et unikt system for undersøgelse af kravene i den periodiske kontraktilitet [og kan] give et middel til at bestemme bidrag af forskellige metaboliske veje for den [bankende] proces". Selvom Harary og Farley isolerede og dyrkede cardiomyocytter fra unge rotter, og den oprindelige protokol er blevet tilpasset og modificeret af mange videnskabsfolk i årenes løb, har den generelle isolation og dyrkning procedure ikke meget forandret. Imidlertid har bedre enzymer 3, standardiserede opløsninger 4,5 og tilsætning af reversible kanal og myosin ATPase-inhibitor BDM at beskytte celler under isolationsproceduren 6-9 væsentligt forbedret celle-udbytte og levedygtighed.
Voksen vs neonatal cardiomyocytes
Kardiomyocytter isolerede og dyrkede fra neonatale mus eller rotter har flere fordele i forhold kulturer af voksne cardiomyocytes. Fremmest proceduren for neonatale mus eller rotte hjerter isolation er lettere og billigere, når der sammenlignes med isolering af cardiomyocytter fra voksne mus eller rotte 10. Neonatal cardiomyocytes er langt mindre følsomme over for genindførsel i en calcium-holdigt medium efter dissociation, hvilket øger celle-udbytte. En anden stor fordel er, at neonatale mus cardiomyocytes undergår en hurtigere dedifferentiation - redifferentiation cyklus, der typisk resulterer i spontant at slå celler 20 timer efter plating, mens voksne cardiomyocytes kræver typisk pacing at fremkalde kontraktion. Neonatal cardiomyocytes er også lettere transficerbare med liposomal transfektionsfremgangsmåder, mens voksne cardiomyocytes kræver virale vektorer for en vellykket levering af transgene DNA. I modsætning til neonatal cardiomyocytes, kultur af voksne gnavere cardiomyocytes 11-13 giver mulighed for undersøgelser af myofibrillar nedbrydning og eventuel genetablering af kontraktile apparat. Disse karakteristiske morfologiske ændringer i voksne cardiomyocytes ske over perioder på 1-2 uger. Den dedifferentiation - redifferentiation cyklus er ledsaget af reexpression af fostrets gen-programmet, og dermed efterligne patologiske forandringer observerede i de humane kardiomyopati 14. En anden fordel af voksne rotte cardiomyocytter over kultur neonatale cardiomyocytter er evnen til kulturen disse celler i lange perioder.
Rotte vs mus cardiomyocytes
Isolationen og kultur af rotte neonatal cardiomyocytter har nogle fordele i forhold der af mus neonatale cardiomyocytter, herunder højere udbytter af levedygtige celler og øget transfektionsfremgangsmåder satser. Men den brede anvendelse af genetisk modificerede musemodeller for hjerte-sygdomme (f.eks </ Em> musklen lim protein knockout mus som model for dilaterede kardiomyopati 15) har ført til tilpasning af isolation procedure for cardiomyocytes stammer fra neonatale mus. Selvom de protokoller, der anvendes til at isolere neonatale rotter og mus cardiomyocytes er næsten identiske, skal større omhu i udvælgelsen af et passende enzym mix for sidstnævnte. Faktisk neonatale mus cardiomyocytter er generelt mere modtagelige for overspaltning, hvilket resulterer i en reduceret celle-udbytte og levedygtighed. Desuden bør udpladningsdensitet justeres, fordi cardiomyocytter afledt fra neonatale mus er noget mindre i forhold til celler, der stammer fra neonatale rottehjerter.
Med mange anvendelsesmuligheder for undersøgelse af morfologiske, elektrofysiologiske, biokemiske, celle-biologiske og biomekaniske parametre samt for processen med myofibrillogenesis har dyrkede neonatale cardiomyocytter blevet en af de mest alsidige systemer til undersøgelse afhjerte cellefunktioner in vitro. Det første skridt til en vellykket analyse afhænger imidlertid af en nem og pålidelig metode til at isolere neonatale mus cardiomyocytes. Vores protokol trækker sin metode fra mange kilder og er optimeret til reproducerbarhed og robusthed. Vi diskuterer faktorer, der påvirker cardiomyocyte-udbytte og levedygtighed, og giver en bred vifte af muligheder for optimering af isolerings-og dyrkningsbetingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende procedure beskriver en to-dages protokol 16,17 til isolering og dyrkning af neonatale mus cardiomyocytes. Alle opløsninger er sterile eller sterilt filtreret. Alle værktøjer er steriliseret ved overfladen sterilisering med 75% ethanol. Bortset fra den oprindelige væv ekstraktion, er alle trin udføres i en steril laminar strømning cellekultur hætte. Denne protokol er beregnet til isolering af neonatale mus hjerter 1-2 kuld (r) - ca 5-14 unger, men kan tilpasses til større kuldstørrelser og rotte neonatal cardiomyocytter. Scale media / enzym-forbrug er relevant.
Ved arbejde med neonatale gnavere, henvises til din lokale retningslinjer universitet og regler, der er fastsat af lovgiver, og / eller animalsk pleje programmer, og holde sig til din institutionelt godkendt dyr protokol. Alle metoder, der er beskrevet i denne protokol er blevet godkendt af UC San Diego Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC), og holde sig til fedeRAL og statslige regler.
Dag 1.
1.. Isolering af hjertevæv fra neonatale mus
- Forbered 50 ml 1x PBS (uden Ca2 +, Mg2 +) suppleret med 20 mM BDM 6-8, og spredes i to sterile bakterielle skåle placeret på is.
- Forbered 10 ml isolation medium i 50 ml steril konisk Falcon rør. Hold alle løsninger på is. Sterilisere saks (en buet, en straight), og pincet (buede, Dumont No.7).
- 1-3 dage gamle neonatale mus skylles hurtigt i 75% ethanol opløsning overfladesterilisation. Hvalpe halshugges med sterile sakse (lige), og brystet er åbnet langs brystbenet at give adgang til brysthulen og hjertet (figur 1A, Supplemental Movie S1).
Teknisk bemærkning: neonatale mus ældre end 3 dage, kan anvendes, men resultere i færre levedygtige celler 2. - Hjerter er udvundetkroppen med krum saks og overføres straks i det bakterielle skål indeholdende 1x PBS (uden Ca2 +, Mg2 +) med 20 mM BDM på is. Alle følgende trin udføres i sterile celle-kultur hætte.
- Fjern lungevæv, større fartøjer (og atrier, hvis det ønskes). Vask hjerter i 1x PBS-opløsning (uden Ca2 +, Mg2 +) med 20 mM BDM (på is) til at fjerne blod. Overførsel vaskede hjerter fra første skål i den anden bakteriel skål indeholdende 1x PBS (uden Ca2 +, Mg2 +) med 20 mM BDM (på is) ved hjælp af en pincet eller en hulske (figur 1B).
- Overførsel rengøres / vaskes hjerter ind i en dråbe isolation medium (ca. 250 ul, figur 1C) i et tredje bakteriel parabol (på is) og brug de buede saks til hakkekød hjerter i små stykker (ca. 0,5-1 mm 3 eller mindre; Figur 1D, 1E).
- Overfør hakket hjerter ind i en koniskrør indeholdende 10 ml af isolation medium (på is), og inkuberes med forsigtig omrøring ved 4 ° C natten over.
Dag 2.
2. Enzymatisk vævsfordøjelse og Belægning Celler
- I 15 mg collagenase / dispase blanding (Roche) afvejes og opløses enzymet mix i 10 ml L15-medium 5 suppleret med 20 mM BDM (fordøjelse medium). Sterilfilter fordøjelsen medium i cellekultur hætte i en ny steril 50 ml Falcon-rør.
- Forbered 30 ml L-15 medium suppleret med 20 mM BDM, og udpladningsmedium.
- Coat celle-dyrkningsplader med collagen-opløsning (Sigma C-8919) i mindst 1 time. Fjern kollagen løsning (kan genbruges) og tørre collagen coated celle-kultur retter i sterilt laminar flow-celle-kultur hætte.
- Fjern den koniske rør indeholdende predigested hjerter fra 4 ° C. Vævsfragmenter bør samles (Figur 1G). Lad vævsfragmenter synke tilbunden af røret og fjern supernatanten (sørg for ikke at miste nogen vævsfragmenter. normalt, kan ca 1 ml af isolation medium forblive i røret). Der tilsættes 5 ml fordøjelse medium og 5 ml L-15 suppleret med 20 mM BDM til væv fragmenter og oxygenat suspension ved hjælp af ilt eller luft i 1 min.
- Overfør den forseglede koniske rør indeholdende hjertevævet fragmenter i fordøjelsen medium til 37 ° C vandbad i omkring 2 min for at justere temperaturen af fordøjelsen løsning.
- Inkuber hjerte vævsfragmenter ved 37 ° C med forsigtig omrøring i 20-30 minutter (f.eks rysteapparat ved 37 ° C, indstilles til højst 60rpm). Fordøjelsesperiode kan i høj grad afhænge af enzym-blandingen og lotnummer Forsigtig:. Længere inkubationsperioder eller højere koncentrationer enzym kan reducere cellernes levedygtighed.
Teknisk bemærkning: Vi anbefaler brugen af en collagenase / dispase blanding fra Roche (kat.nr.: 102.69638001), der har meget lidt masse-til-lot variation. Den klassiske enzym til isolering af muse cardiomyocytter er trypsin og / eller kollagenase type II 3,16-20 tilgængelig fra Worthington (kat. nr. CLS-2). Udførelsen af kollagenase II, kan imidlertid afvige væsentligt fra parti til parti. Worthington typisk giver mulighed for afprøvning af flere collagenase masser at optimere fordøjelsesperiode og enzym brug. Alternativt Worthington sælger en cardiomyocyte isolation kit med en pre-testet enzym blanding omfattede, der kan tilpasses til isolering af muse cardiomyocytes 17 (Cat nummer: NCIS).
- Placer steril celle-si (40-100 um nylon mesh) i friske sterile 50 ml koniske Falcon-rør. Pre-våd cellefilter med 5 ml L-15 suppleret med 20 mM BDM. Forsigtigt tritureres vævsfragmenter ved hjælp af en forud-befugtet 10 ml cellekultur pipette til omkring 10-20 gange. De vævsfragmenter bør meste dispergere i dette trin, frigive cellerne i suspension (fig. 1 H).
- Lad større vævsfragmenter sediment og overførsel supernatant, der indeholder suspenderede celler i frisk konisk rør gennem celle-si (Figur 1I).
- Resuspendere ufordøjede vævsfragmenter i 5 ml fordøjelse medium og inkuberes i yderligere 5-10 minutter ved 37 ° C med forsigtig omrøring.
- Efter fortsatte nedbrydning af de resterende væv fragmenter, forsigtigt udriv væv til 10-20 gange og tilføje til koniske rør indeholdende celler fra første fordøje gennem celle si. Skyl celle-si med 5 ml L-15 suppleret med 20 mM BDM at tillade passage af alle fordøjet celler.
- Centrifugat koniske rør indeholdende suspenderede cardiomyocytter i 5 minutter ved 300 rpm (ca. 50-100 xg). Fjern supernatanten (indeholdende meste fibroblaster og endotelceller), og re-suspendere cellepelleten i 10 ml udpladningsmedium.
- Plate celler i 10 cm celledyrkningsskål (figur 2A), og inkuberes i 1-3 Hr i cellekultur inkubator. Denne præ-plating trin fjerner fibroblaster og endotelceller (Figur 2B), der vil klæbe til den ubelagte cellekultur skål (figur 2C).
- Efter inkubering vaskes non-adhærente cardiomyocytter fra 10 cm dyrkningsskål (resuspendere celler ved gentagen pipettering klædningen medium over skål), og overfør resuspenderede celler til et sterilt konisk Falcon-centrifugerør (15 ml eller 50 ml).
Valgfrit: Gentag pre-plating skridt til at fjerne yderligere fibroblaster fra celle-suspension. Hvis det ønskes, kan de vedhængende fibroblast og endotelceller være yderligere dyrket. - Tæl celler (fx ved at bruge Neubauer hæmocytometer, trypanblåteksklusion farvning 21).
- Plate celler i collagen belagt celledyrkningsskåle med en massefylde på cirka 1,5 x 10 5 celler pr cm 2 (figur 2D, se kommentarer også i tabel 1 på yderklædningenog coating).
Placer retter i cellekultur inkubator og lade uforstyrret i 12-18 timer for at tillade vedhæftning og spredning af cardiomyocytes.
Dag 3 - Kultur i neonatale cardiomyocytter
- Forbered vedligeholdelsesmedium og forvarm i 37 ° C vandbad. Se Tabel 1 for tilsætning af proliferationsinhibitorer eller kronotropiske agenter, eller proceduren for liposomal transfektion af neonatale mus cardiomyocytes.
- En dag efter udpladning burde cardiomyocytes have levet op til den celledyrkningsskål og optimalt begynder spontant at kontrakten (Figur 2E, 2F, Supplemental Movie S2, se tabel 2 for almindelige problemer under proceduren isolation / kultur). Erstat udpladningsmedium med vedligeholdelse medium og kultur for yderligere 1-5 dage. Skift medium som nødvendigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af denne protokol, vi isolerede hjerter fra 8 én dag gammel neonatale mus (figur 1A, 1B, Supplemental Movie S1). Efter vask og hakning hjerter med en saks (figur 1C-1F) blev vævsfragmenter præfordøjet isoleret medium natten over ved 4 ° C med forsigtig omrøring. Efter predigestion (figur 1G), vi overført væv fragmenter i frisklavet fordøjelse medium og inkuberede vævsfragmenter i 20 minutter ved 37 ° C med forsigtig omrøring. Den resulterende cellesuspension (figur 1H) blev filtreret gennem et cellefilter (fig. 1G). Efter centrifugering blev de pelleterede celler resuspenderet i 8 ml udpladningsmedium og preplated i en 10 cm celledyrkningsskål (figur 2A) og dyrket i 2 timer for at tillade fastgørelse af hjerte-fibroblaster og endotelceller (2B, 2C). Celler, der ikke hurtigt vedhæfte var resuspenderes i udpladningsmedium. 10 pi af cellesuspensionen indeholdende cardiomyocytter blev pipetteted i et eppendorfrør og farvet med en trypanblåt-opløsning i forholdet 1:1. Celler blev talt under anvendelse af en automatiseret celletæller, hvilket resulterer i ca 5,1 x 10 5 levende celler / ml udpladningsmedium. Efter optælling blev celler udpladet i fire 30 mm collagen-coatede celledyrkningsskåle (2 ml per skål), hvilket resulterer i ca 1 x 10 6 udpladede celler pr skål (1.4 x 10 5 celler / cm 2, figur 2D). 18 timer efter galvanisering blev cardiomyocytes knyttet til collagen coatede cellekultur retter (med cirka 70% konfluens) og begyndte at trække sig spontant (figur 2E, Supplemental Movie S2). Efterfølgende blev cardiomyocytter anvendes enten til liposomal transfektion (se tabel 1), eller cellerne blev overført direkte fra klædningen i vedligeholdelsesmedium (figur 2F) og dyrket i yderligere 3 dage. Efter dyrkning blev cardiomyocytter kortvarigt vasket i 1x PBS, fikseret i 5 min i 4% PFA / PBS og behandles til immunfluorescens som beskrevet i en af vores seneste publikationer 22. Repræsentative resultater skildrer immunologisk farvede transficerede og transficerede cardiomyocyte kulturer er vist i figur 2G og 2H, hhv. De dyrkede neonatale cardiomyocytter vise den forventede cytoarchitecture, som fremgår af visualisering af myofibriller (rødt signal i figur 2G), og de interkalerede skivelignende strukturer (green signal i figur 2G). De er også modtagelige for forbigående transfektioner, som det ses i figur 2H (grønt signal er det transficerede protein; rødt signal kontrastfarvning af myofibriller ved hjælp af en alfa-sarcomerisk actinin antistof).
"Fo: src =" / files/ftp_upload/50154/50154fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50154/50154fig1.jpg "/>
Figur 1.. Isolering af hjertevæv fra neonatale mus. A) Hjertet fjernes omhyggeligt fra brystkasse ved hjælp af buede pincet (se også Supplemental Movie S1). B) Hjerter isoleret fra 8 nyfødte vaskes i 1x PBS (uden Ca 2 +, Mg 2 +) suppleret med 20 mM BDM på is. C) Hjerter overføres til en dråbe isolation medium. DE) Mincing af neonatale hjerter ved hjælp af krum saks. F) overførsel af hakket hjertevæv ved hjælp af en pre-fugtet pipette. G) predigested hjertevæv efter natten over inkubering ved 4 ° C. H) cardiomyocytter i suspension efter 20 min af fordøjelse og triturering. Ufordøjet hjertevæv akkumuleres i bunden af røret. I) suspension af isolerede cardiomyocytes filtreres gennem et cellefilter.
Figur 2.. Kultur i neonatale mus cardiomyocytes og repræsentative immunofluorescens billeder. A) Plating af isolerede celler i starten af pre-plating trin. B) Hjerte fibroblaster og endotelceller begynder at holde sig til den ikke-coatede celledyrkningsskål efter 1-3 hr kultur under præ-plating trin. C) Efter resuspension af ikke-klæbende cardiomyocytes kan resterende hjerte fibroblaster og endotelceller blive yderligere dyrkes, hvis det ønskes. D) Plating af isolerede og oprensede neonatale mus kardiomyocytter i collagen coated celle-kultur retter . e) Efter 18 timer i kultur, cardiomyocytes holde sig til coatede dishes, og optimalt starte spontane sammentrækninger (se også Supplemental Movie S2). F) Udskiftning af klædningen medium med vedligeholdelse medium fjerner døde celler fra kulturen. A)-F) Scalebar 0,2 mm. G) Repræsentant immunfluorescens billede af neonatale mus cardiomyocytes, farves med antistoffer mod myomesin (Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa, MMAC myomesin B4, i rød) og beta-catenin (Sigma, Kat.-No .: C2206, i grønt). Scalebar 10 um. H) Repræsentant immunfluorescens billede af transficerede neonatale mus kardiomyocytter med udtrykte GFP-mærkede protein i grøn (GFP-titin-N2B fragment), og alfa-actinin (Sigma, kat.-No.A-7811) i rødt . Scalebar 20 um. Fremgangsmåde til transfektion og immunologisk farvning anvendes i 2G) og 2H) kan findes i tabel 1 og er sammenfattet i en af vores seneste publikationer 22.
Supplerende Movie S1. Supplerende Movie S2. Klik her for at se supplerende film . Tabel 1.. Optimering af plating og dyrkningsbetingelser, liposomal transfektion. Tabel 2. Fejlfinding. Mange faktorer kan påvirke en vellykket isolering og dyrkning af primær cellesek. Kontakt venligst håndbøger som "af dyreceller" af Ian Freshney 21, som generelle introduktioner til grundlæggende cellekulturteknikker. Mulige årsager til problemer i isolation og kultur procedur af neonatale mus cardiomocytes, vi stødte oftest er opført i denne tabel. Pre-plating Pre-udpladning af celler efter isolation i høj grad fjerner hjerte fibroblaster og endotelceller fra helcelle-blanding. En enkelt præ-plating trin fjerner ca 50-80% af ikke-cardiomyocytter fra celle-populationen. Gentagelse af præ-plating mere end to gange, samt præ-plating gange længere end 3 timer kan ikke anbefales, på grund af yderligere tab af hjertemyocytter. Udskiftning af præ-plating med percoll gradient 23,24 kan forbedre renheden af cardiomyocyte cellepopulation. Coating og celledyrkningssubstrat Overfladebehandling af celle-kultur retter med extracellular matrix (ECM) komponenter som collagen, fibronektin, laminin, komplekse ECM blandinger (dvs. Matrigel 25,26) eller kunstige substrater (dvs. siliconepolymer 27 organosilan 28) positiv indflydelse cardiomyocyte tilslutning, levedygtighed og celle breder under den indledende plating trin og for den efterfølgende dyrkningsperioden. Især kultur cardiomyocytter på glassubstrater kræver belægning af overfladen med ECM komponenter for at opnå en ordentlig vedhæftning af cardiomyocytter.
Vi testede belægning af cellekultur behandlet plast og glas substrater med en bred vifte af ECM komponenter, herunder 0,1% collagen-opløsning (Sigma C-8919), 3 mg / ml kollagen type 1 opløsning (Advanced Biomatrix, PureCol), 1% gelatine-opløsning ( Sigma G9391; opløst i H2O, autoklaveret), laminin løsninger (Sigma L4544) eller komplekse ECM blandinger afledt fra svine-hjerter 29 eller hjerte-fibroblaster 30. Cell kulture retter blev inkuberet med ECM løsninger til et minimum på 1 time til natten over i cellekultur inkubator, og efter fjernelse af ECM tørret i laminar strømning cellekultur hætte. ECM opløsninger kan genbruges mange gange (10-20 gange), hvis sterilitet og ECM protein integritet under længere tids opbevaring bevares (fx opbevaring ved 4 ° C eller frosset). Forsigtighed på grund af den sure natur af nogle af de buffere, der anvendes til at opløse ECM-proteiner, vask af dyrkningsskåle med 1x PBS efter belægning kan være påkrævet før udpladning af cellerne. Udstrygningsmetode og tæthed Afhængigt af de efterfølgende analyser bør optimale cellekoncentrationer for plettering resultere i nær sammenflydende cardiomyocyte monolag. Belægning af kardiomyocytter ved høje koncentrationer resulterer i flerlags cardiomyocyte aggregater og lav homogenitet, mens lave koncentrationer reducerer levedygtighed og resultater celle i enkelte, isolerede cardiomyocytes blottet for specialiserede celle-celle contacts (intercalated disk-lignende strukturer). Når pipettering celler til plettering huske på, at cardiomyocytes er temmelig store og tunge, og har tendens til at koncentrere sig om bunden af falk røret. Opblanding af celler i mellem plating skridt sikrer en jævn fordeling af celler i hele dine retter. Når plating celler sig retter i form af et ottetal "8" for at undgå koncentration af celler til midten af skålen. Den optimale sammenflydning af neonatale cardiomyocytter udpeget til liposomal transfektion bør være omkring 70-80% dagen efter plating. Serum Brugen af cellekulturafprøvet føtal (eller nyfødte) er nødvendig for cellernes levedygtighed og overholdelse af kardiomyocytter under klædningen trin bovint serum og hesteserum i klædningen medium. Kvaliteten af den anvendte serum kan være en af de vigtige skridt under proceduren plating / kultur. Supplering af vedligeholdelsen medium med lave mængder af serum er valgfrit, kan dog i høj grad forbeve varighed af kultur tid.
Forsigtig: tilføjelse af serum kan i væsentlig grad ændre biokemiske signalveje i dyrkede cardiomyocytter og kan vurderes med hensyn til eksperimentelle parametre, hypotese og den efterfølgende fortolkning af resultaterne. Serumfrie kulturer af cardiomyocytter er blevet beskrevet 10,31, og kan forhindre skævhed resultater på grund af ukendte vækstfaktorer til stede i serum. Proliferationsinhibitorer Terminalt differentierede cardiomyocytter typisk ikke undergår celledeling. Men tilsætning af sprednings-inhibitorer, såsom 10 uM AraC (cytosin-BD-arabino-furanosid hydrochloride; Sigma C6645) er til opretholdelse medium anbefales for at forhindre spredning af hjerte fibroblast og endotelceller. Selv med tilføjelse af præ-plating skridt til at reducere bestanden af hjerte-fibroblaster og endotelceller vil de resterende fibroblaster gennemgå celle proliferation og væsentligt ændre dyrkede celle-populationen over tid.
Forsigtig: afhængig af genetiske faktorer og isolation tid-point, embryonale og neonatale mus cardiomyocytes kan stadig have spredning potentiel 23,32,33. Brug af AraC bør bedømmes afhængig af eksperimentelle parametre, hypotese og fortolkning af resultaterne. Tilsætning af kronotropiske midler Supplering af vedligeholdelsen medium med agenter 34, såsom phenylephrin (0,1 mM, fortrinsvis for neonatale rotte cardiomyocytes, Sigma P6126) eller isoproterenol (1 uM, fortrinsvis for neonatale mus cardiomyocytes, Sigma I6501) øger sarcomerogenesis, spredning af cardiomyocytes på plade samt spontane slag af celler. Imidlertid bør tilsætning af disse midler skal vejes med hensyn til ønskede assayparametre (f.eks derudover kan forvrænge kontraktile adfærd og biokemiske parametre). Transfektion Liposomal transfektion af DNA / RNA i neonatale mus cardiomyocytter er stærkt afhængig af transfektion tid-punkt, transfektionsreagens, kultur densitet, DNA / RNA-koncentrationen og anvendes DNA-konstruktion. Vi har testet en række liposomale transfektionsreagenser og fundet ESCORT III (Sigma) og lipofectamin 2000 (Invitrogen) anvendelse. Transficere celler 24 timer efter udpladning ved at erstatte udpladningsmedium 2 timer før transfektion med antibiotika frie vedligeholdelsesmedium. Til transfektion af neonatale cardiomyocytter dyrkes i 30 mm skåle, bland 1-2 ug DNA med 200 ul DMEM i et sterilt Eppendorf-rør, og der tilsættes 4 pi Escort III til den fortyndede DNA-blandingen. Bland forsigtigt og inkuberes i mindst 5 minutter i den sterile hætte til at tillade DNA / liposom-kompleks. Udskift antibiotika-fri vedligeholdelse medium med 800 ul frisk antibiotika-fri vedligeholdelse mellemstore og tilføje DNA / liposom blandingen til cellerne. Cellerne inkuberes i celle cuLTURE inkubator og erstatte med frisk standard vedligeholdelse medium efter 24 timer. Et repræsentativt resultat for en vellykket transficeret neonatale mus cardiomyocytter er vist i figur 2H. Transfektion ved hjælp af calcium udfældning af DNA er også muligt. Transfektion af neonatale mus cardiomyocytter er vanskeligere sammenlignet neonatal rotte cardiomyocytter med typiske transfektionseffektiviteter spænder fra 1 til 20%. Virale vektorer er nødvendige for at opnå højere effektivitet 35-37 (fx: adenovirus, adeno-associeret virus, lentivirus). Elektroporation af neonatale cardiomyocytter er i vores hænder, der er uegnede til levering af DNA / RNA, imidlertid adskillige rapporter viser succes ved hjælp af elektroporation af embryonale og neonatale cardiomyocytter 38,39. I en nylig artikel 38, Djurovic et al. Opsummere flere transfektionsfremgangsmåder, succesrater samt deres fordele og ulemper. Passaging Frysning / Storaseri Passage af kardiomyocytter anbefales ikke 1. Indefrysning af isolerede neonatale cardiomyocytter for længere tids opbevaring er yderst vanskeligt og ikke anbefalelsesværdig på grund af lav effektivitet og lave genanvendelsesprocenter. Flere selskaber tilbyder specialiseret frysning medium for menneskerettighederne cardiomyocyte primære kulturer (f.eks celprogen, kat. No. M36044-15FM), som også kan være egnet til nedfrysning af neonatale mus cardiomyocytes, kan dog skal optimeres forhold. Den vellykkede passage og kryopræservering af atrielle cardiomyocytter er blevet beskrevet i en transgen musemodel 32. Ingen levedygtige eller omliggende celler 1 dag efter galvanisering - Reducere enzym koncentration og / eller fordøjelse tid
- Ændre enzym blanding
- Change serum til udpladningsmedium
- Ændring ECM / belægning medium og / eller typen af celledyrkningsskåle
- Tilføj 20 mM BDM til isolation / fordøjelse medier
- Kontrollere, om forurening af celler Lav celleudbytte - At øge fordøjelse og / eller enzymkoncentration
- Stigningen centrifugering tid / hastighed under isolation procedure
- Øget trituration periode Sammenflydning af celler i kultur er for lav / høj, skæv plating - Tælle celler under isolation procedure og justere antallet af celler / skål under plating
- Justere plating koncentration
- Omhyggeligt resuspender cellepelleten efter centrifugering og før plating ved gentagen pipettering (dag 2 trin 13), så sørg for ingen synlige celle-klumper forbliver Ingen slå celler - Tilføj kronotropiske agenter til vedligeholdelse medium (f.eks phenylephrin, isoproterenol)
- Udskift medium
- Lmeck for højt antal af hjerte fibroblaster / endotelceller Højt antal af fibroblaster - Tilføj ekstra preplating trin under isolation procedure
- Tilføj spredning hæmmer til vedligeholdelse medium (tabel 1) Mange døde celler - Erstatte celledyrkningsmediet
- Reducere enzym koncentration og / eller fordøjelse tid under isolation procedure
- Kontrol cellekultur inkubator (CO 2, temperatur, fugtighed)
- Kontrollere for kontamination Forurening - Overholde arbejdsvilkår 21 sterile cellekultur
- Ny penicillin / streptomycin løsning erstatte medium, brug
- Overflade sterilisere neonatale mus med 75% ethanol opløsning
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Brugen af dyremodeller for at studere hjertesygdomme er blevet standard i kardiovaskulær forskning. Tættere biokemisk karakterisering af disse modeller (dvs. at studere direkte reaktioner hjerteceller til biokemiske eller biomekaniske stimuli) kræver typisk isolering af hjerte væv eller cardiomyocytes. Undersøgelser af fysiologiske reaktioner i hjertet ex vivo (f.eks acetylcholin 40 eller i iskæmireperfusion scenarier 41) generelt udnytte Langendorff-perfunderet hele hjerter 42,43, mens eksplantatkulturer 44,45 af hjertevæv fragmenter giver mulighed for undersøgelser af cardiomyocytes i et tredimensionalt væv miljø. Dog kan dyrkning eksplantation væv hindre diffusion af næringsstoffer, potentielt generere en nekrotisk klynge i kernen af vævet. Desuden cardiomyocytter er immobile i vævet, således migration af celler ud af eksplantater er kun observed for ikke-cardiomyocytter, såsom fibroblaster eller formodede cardiac progenitorceller 44. Undersøgelse af udviklingsmæssige, celle-biologiske, biokemiske og biofysiske adfærd cardiomyocytes krævede derfor etableringen af isolation og dyrkning procedurer. Tidlige protokoller til isolering og dyrkning af mammale cardiomyocytter udnytte neonatale rotter 1,2. Men fremkomsten af musen som en model for genetiske undersøgelser (dvs. genetisk modificerede knock-eller knock-out mus) nødvendiggjort en tilpasning af de etablerede isolation og dyrkning metoder. Desværre isolering af neonatale mus cardiomyocytter er særligt udfordrende sammenlignet med de mere traditionelt anvendte neonatale rotte cardiomyocytter. Den præsenterede protokol beskriver en pålidelig og robust fremgangsmåde optimeret til isolering og dyrkning af neonatale mus cardiomyocytter. Vi beskriver de nødvendige betingelser for indledende væv udvinding skridt for dissociation ennd rensning af kardiomyocytter fra hjerte-fibroblaster og endotelceller og til klædningen og dyrkningsbetingelser. Mens protokollen tilbyder en grundlæggende tilgang til isolering og dyrkning af neonatale mus kardiomyocytter i standardbetingelser, kan det let tilpasses til isolering og dyrkning af neonatale rotte cardiomyocytes, samt for bestemte efterfølgende assaytyper: fx kultur af de isolerede celler på fleksible membraner (f.eks Bioflex dyrkningsplader) for at undersøge biomekaniske egenskaber, kultur i glasbund retter (Mattek) for levende celler, eller dyrkning af kardiomyocytter i xCELLigence cardio e-plader (Acea, Roche, Cat.-No.: 06417051001) at studere effekten af lægemidler på kontraktile funktioner. Desuden tilbyder vi muligheder for optimering af kultur procedure isolering og og diskutere kilder for eventuelle problemer og deres løsninger. Derfor bør denne protokol hjælpe forskerne behandlingen af en up-to-date, meget reproducerbar ogoverkommelig metode til fremstilling af neonatale mus cardiomyocyte kulturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for Prof. emeritus Jean-Claude Perriard og Evelyn Perriard (Swiss Federal Institute of Technology, Schweiz) om indførelse i isolation teknikker til neonatal rotte og mus cardiomyocytes. Vi vil gerne takke professor Ju Chen og professor Sylvia Evans (UCSD, USA) for deres støtte. Arbejde i laboratoriet af EE blev finansieret af en MRC Career Establishment Grant. SL er understøttet af en K99/R00 vej at tildele uafhængighed fra NIH / NHLBI (HL107744). TMM blev understøttet af en postdoc-stipendium fra American Heart Association (11POST7310066).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8 | Sigma | B-0753 | prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47. |
| Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | can be substituted with collagenase type II from Worthington |
| Collagenase type II3 | Worthington | CLS-2 | substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche |
| 1x trypsin solution (0.25%) with EDTA | cellgro | 25-053-CI | |
| 1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS | cellgro | 30-002-Cl | |
| 1x PBS (without Ca2+, Mg2+) | e,g, cellgro | 21-040-CV | |
| HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4 | cellgro | 21-022-CV | |
| DMEM high glucose | cellgro | 10-013-CV | |
| M-199 | cellgro | 10-060-CV | |
| fetal bovine serum | cellgro | 35-011-CV | cell-culture grade |
| horse serum | cellgro | 35-030-CV | cell-culture grade |
| Leibovitz L-155 | cellgro | 10-045-CV | |
| AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride) | Sigma | C-6645 | proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C |
| phenylephrine | Sigma | P-6126 | chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
| isoproterenol hydrochloride | Sigma | I-6501 | chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
| 0.1% collagen solution | Sigma | C-8919 | extracellular matrix for coating |
| 3 mg/ml collagen type 1 solution | Advanced BioMatrix | 5005-B | alternative to Sigma collagen solution |
| cell strainer | Fisherbrand | 22363548 | appropriate filter size:40 μm-100 μm |
| syringe filter 0.2 μm | Fisherbrand | 09-719C | for sterile filtration of digestion medium |
| straight scissors | Fine Sciences Tools | 91460-11 | |
| curved scissors | Fine Science Tools | 91461-11 | |
| Dumont No. 7 forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| perforated spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | optional, for transfer of heart tissue |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | live cell staining |
| Neubauer hemocytometer | Prosource Scientific | 3500 | alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems |
| 50 ml Falcon tubes | Fisherbrand | 14-432-23 | |
| 15 ml Falcon tubes | Fisherbrand | 05-527-90 | |
| 20 ml syringe | BD Medical | 14-820-19 | |
| 10 ml serological pipette | Falcon | 357551 | |
| 30 mm cell culture dish | Nunc | 153066 | for standard culture of cardiomyocytes |
| 30 mm cell culture dish, glass bottom | MatTek | P35G-0-10-C | for live cell imaging with inverted microscope |
| 10 cm cell culture dish | Nunc | 172958 | for preplating |
| Escort III | Sigma | L3037 | for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000 |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies, Invitrogen | 52887 | substitute for Escort III |
Buffers and media:
|
|||
References
- Harary, I., Farley, B. In vitro studies of single isolated beating heart cells. Science. 131, 1674-1675 (1960).
- Harary, I., Farley, B. In vitro studies on single beating rat heart cells. I. Growth and organization. Exp. Cell Res. 29, 451-465 (1963).
- Worthington Biochemical Corp. Worthington Enzyme Manual. , Freehold. N.J. Available from: http://www.worthington-biochem.com/index/manual.html (2012).
- Hanks, J. H., Wallace, R. E. Relation of oxygen and temperature in the preservation of tissues by refrigeration. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 71, 196-200 (1949).
- Leibovitz, A. The Growth and Maintenance of Tissue-Cell Cultures in Free Gas Exchange with the Atmosphere. Am. J. Hyg. 78, 173-180 (1963).
- Mulieri, L. A., Hasenfuss, G., Ittleman, F., Blanchard, E. M., Alpert, N. R. Protection of human left ventricular myocardium from cutting injury with 2,3-butanedione monoxime. Circ. Res. 65, 1441-1449 (1989).
- Thum, T., Borlak, J. Butanedione monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures. Cardiovasc Toxicol. 1, 61-72 (2001).
- Verrecchia, F., Herve, J. C. Reversible blockade of gap junctional communication by 2,3-butanedione monoxime in rat cardiac myocytes. Am. J. Physiol. 272, 875-885 (1997).
- Allen, T. J., Chapman, R. A. The effect of a chemical phosphatase on single calcium channels and the inactivation of whole-cell calcium current from isolated guinea-pig ventricular myocytes. Pflugers Arch. 430, 68-80 (1995).
- Mitcheson, J. S., Hancox, J. C., Levi, A. J. Cultured adult cardiac myocytes: future applications, culture methods, morphological and electrophysiological properties. Cardiovasc. Res. 39, 280-300 (1998).
- Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 14, 397-412 (1982).
- Claycomb, W. C., Palazzo, M. C. Culture of the terminally differentiated adult cardiac muscle cell: a light and scanning electron microscope study. Dev. Biol. 80, 466-482 (1980).
- Eppenberger, M. E., et al. Immunocytochemical analysis of the regeneration of myofibrils in long-term cultures of adult cardiomyocytes of the rat. Dev. Biol. 130, 1-15 (1988).
- Eppenberger, H. M., Hertig, C., Eppenberger-Eberhardt, M. Adult rat cardiomyocytes in culture A model system to study the plasticity of the differentiated cardiac phenotype at the molecular and cellular levels. Trends Cardiovasc Med. 4, 187-193 (1994).
- Arber, S., et al. MLP-deficient mice exhibit a disruption of cardiac cytoarchitectural organization, dilated cardiomyopathy, and heart failure. Cell. 88, 393-403 (1997).
- Toraason, M., Luken, M. E., Breitenstein, M., Krueger, J. A., Biagini, R. E. Comparative toxicity of allylamine and acrolein in cultured myocytes and fibroblasts from neonatal rat heart. Toxicology. 56, 107-117 (1989).
- Worthington Biochemical Corp. Worthington Tissue Dissection Guide. , Freehold. N.J. Available from: http://www.worthington-biochem.com/tissuedissociation (2012).
- Bashor, M. M. Dispersion and disruption of tissues. Methods Enzymol. 58, 119-131 (1979).
- Speicher, D. W., McCarl, R. L. Pancreatic enzyme requirements for the dissociation of rat hearts for culture. In Vitro. 10, 30-41 (1974).
- Gross, W. O., Schopf-Ebner, E., Bucher, O. M. Technique for the preparation of homogeneous cultures of isolated heart muscle cells. Exp Cell Res. 53, 1-10 (1968).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells : a manual of basic technique and specialized applications. , 6th, Wiley-Blackwell. (2010).
- Lange, S., Perera, S., Teh, P., Chen, J. Obscurin and KCTD6 regulate cullin-dependent small ankyrin-1 (sAnk1.5) protein turnover. Mol Biol Cell. , (2012).
- Sen, A., Dunnmon, P., Henderson, S. A., Gerard, R. D., Chien, K. R. Terminally differentiated neonatal rat myocardial cells proliferate and maintain specific differentiated functions following expression of SV40 large T antigen. J. Biol. Chem. 263, 19132-19136 (1988).
- Evans, H. J., Goodwin, R. L. Western array analysis of cell cycle protein changes during the hyperplastic to hypertrophic transition in heart development. Mol. Cell Biochem. 303, 189-199 (2007).
- Bakunts, K., Gillum, N., Karabekian, Z., Sarvazyan, N. Formation of cardiac fibers in Matrigel matrix. Biotechniques. 44, 341-348 (2008).
- Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. FASEB J. 14, 669-679 (2000).
- Nawroth, J. C., et al. A tissue-engineered jellyfish with biomimetic propulsion. Nat. Biotechnol. 30, 792-797 (2012).
- Das, M., et al. Long-term culture of embryonic rat cardiomyocytes on an organosilane surface in a serum-free medium. Biomaterials. 25, 5643-5647 (2004).
- DeQuach, J. A., et al. Simple and high yielding method for preparing tissue specific extracellular matrix coatings for cell culture. PLoS One. 5, e13039 (2010).
- VanWinkle, W. B., Snuggs, M. B., Buja, L. M. Cardiogel: a biosynthetic extracellular matrix for cardiomyocyte culture. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 32, 478-485 (1996).
- Karliner, J. S., Simpson, P. C., Taylor, J. E., Honbo, N., Woloszyn, W. Adrenergic receptor characteristics of cardiac myocytes cultured in serum-free medium: comparison with serum-supplemented medium. Biochem Biophys Res Commun. 128, 376-382 (1985).
- Steinhelper, M. E., et al. Proliferation in vivo and in culture of differentiated adult atrial cardiomyocytes from transgenic mice. Am. J. Physiol. 259, H1826-H1834 (1990).
- Ahuja, P., Perriard, E., Perriard, J. C., Ehler, E. Sequential myofibrillar breakdown accompanies mitotic division of mammalian cardiomyocytes. J. Cell Sci. 117, 3295-3306 (2004).
- Iwaki, K., Sukhatme, V. P., Shubeita, H. E., Chien, K. R. Alpha- beta-adrenergic stimulation induces distinct patterns of immediate early gene expression in neonatal rat myocardial cells. fos/jun expression is associated with sarcomere assembly; Egr-1 induction is primarily an alpha 1-mediated response. J. Biol. Chem. 265, 13809-13817 (1990).
- Kirshenbaum, L. A., MacLellan, W. R., Mazur, W., French, B. A., Schneider, M. D. Highly efficient gene transfer into adult ventricular myocytes by recombinant adenovirus. J. Clin. Invest. 92, 381-387 (1993).
- Maeda, Y., et al. Adeno-associated virus-mediated transfer of endothelial nitric oxide synthase gene inhibits protein synthesis of rat ventricular cardiomyocytes. Cardiovasc Drugs Ther. 15, 19-24 (2001).
- Zhao, J., et al. Lentiviral vectors for delivery of genes into neonatal and adult ventricular cardiac myocytes in vitro and in vivo. Basic Res. Cardiol. 97, 348-358 (2002).
- Djurovic, S., Iversen, N., Jeansson, S., Hoover, F., Christensen, G. Comparison of nonviral transfection and adeno-associated viral transduction on cardiomyocytes. Mol. Biotechnol. 28, 21-32 (2004).
- van Bever, L., et al. Pore loop-mutated rat KIR6.1 and KIR6.2 suppress KATP current in rat cardiomyocytes. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 287, 850-859 (2004).
- Sakai, K., Akima, M., Tsuyama, K. Evaluation of the isolated perfused heart of mice, with special reference to vasoconstriction caused by intracoronary acetylcholine. J. Pharmacol Methods. 10, 263-270 (1983).
- Reichelt, M. E., Willems, L., Hack, B. A., Peart, J. N., Headrick, J. P. Cardiac and coronary function in the Langendorff-perfused mouse heart model. Exp Physiol. 94, 54-70 (2009).
- Tian, R. Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy. J. Vis. Exp. (42), e2069 (2010).
- Liao, R., Podesser, B. K., Lim, C. C. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303, H156-H167 (2012).
- Zakharova, L., Nural-Guvener, H., Gaballa, M. A. Cardiac explant-derived cells are regulated by Notch-modulated mesenchymal transition. PLoS One. 7, e37800 (2012).
- Rudy, D. E., Yatskievych, T. A., Antin, P. B., Gregorio, C. C. Assembly of thick, thin, and titin filaments in chick precardiac explants. Dev. Dyn. 221, 61-71 (2001).
- Thum, T., Borlak, J. Reprogramming of gene expression in cultured cardiomyocytes and in explanted hearts by the myosin ATPase inhibitor butanedione monoxime. Transplantation. 71, 543-552 (2001).
- Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 294, H1667-H1674 (2008).
