Summary
Primaire muis cardiomyocytkweken is een van de cruciale instrumenten voor het onderzoek myofibrillar inrichting en functie. Het volgende protocol beschrijft de isolatie en de cultuur van primaire cardiomyocyten van neonatale muis harten. De resulterende cardiomyocytkweken kunnen vervolgens worden gebruikt voor een verscheidenheid van biomechanische, biochemische en celbiologische assays.
Abstract
Gekweekte neonatale hartspiercellen al lang gebruikt om myofibrillogenesis en myofibrillar functies te bestuderen. Gekweekte hartspiercellen zorgen voor een gemakkelijke onderzoek en manipulatie van biochemische pathways, en hun effect op de biomechanische eigenschappen van spontaan slaan hartspiercellen.
De volgende 2-daagse protocol beschrijft de isolatie en de cultuur van neonatale muis hartspiercellen. We laten zien hoe je de harten gemakkelijk ontleden van pasgeborenen, distantiëren het hartweefsel en verrijken van hartspiercellen van de cardiale cel-populatie. We bespreken het gebruik van verschillende enzym mixen voor cel-dissociatie, en hun effecten op cel-levensvatbaarheid. De geïsoleerde cardiomyocyten kunnen vervolgens worden gebruikt voor een verscheidenheid van morfologische, elektrofysiologische, biochemische, celbiologische en biomechanische testen. We geoptimaliseerd het protocol voor robuustheid en reproduceerbaarheid, door het gebruik van enige commercieel beschikbare oplossingen en enzym mengt die show weinig veel-te-veel variatie. We richten ook vaak problemen met de het kweken van hartspiercellen en bieden een verscheidenheid aan mogelijkheden voor het optimaliseren van isolatie en kweekomstandigheden.
Introduction
De vroegste verslagen voor de succesvolle dissociatie en cultuur van knaagdieren hartcellen dateert uit de jaren 1960 1,2. Zelfs dan, Harary en Farley gemerkt dat gekweekte hartspiercellen "kan een uniek systeem voor de studie van de eisen van de periodieke contractiliteit bieden [en kan] een middel van het bepalen van de bijdrage van de verschillende metabole routes voor de [kloppende] proces". Hoewel Harary en Farley geïsoleerde en gekweekte hartspiercellen van jonge ratten, en het oorspronkelijke protocol is aangepast en gewijzigd door veel wetenschappers door de jaren heen, heeft de algemene isolatie en het kweken procedure niet sterk veranderd. Echter beter enzymen 3, standaardoplossingen 4,5, en de toevoeging van de omkeerbare kanaal en myosine ATPase inhibitor BDM cellen beschermen tijdens de isolatieprocedure 6-9 aanzienlijk verbeterde cel-opbrengst en levensvatbaarheid.
Volwassen vs neonatale cardiomyocyten
Hartspiercellen geïsoleerd en gekweekt uit pasgeboren muizen of ratten hebben een aantal voordelen ten opzichte van culturen van volwassen hartspiercellen. Plaats de isolatieprocedure voor neonatale muis of rat hearts is gemakkelijker en goedkoper in vergelijking met de isolatie van cardiomyocyten van volwassen muis of rat 10. Neonatale cardiomyocyten zijn veel minder gevoelig voor herintroductie in een calcium-bevattende medium na dissociatie, aanzienlijke verhoging van cel-opbrengst. Een ander groot voordeel is dat neonatale muis hartspiercellen ondergaan een snellere dedifferentiation - redifferentiatie cyclus die meestal resulteert in een spontaan verslaan cellen 20 uur na plating, terwijl volwassen hartspiercellen vergen doorgaans pacing om contractie te induceren. Neonatale cardiomyocyten zijn ook gemakkelijker transfecteerbare met liposomaal transfectiewerkwijzen, terwijl volwassen hartspiercellen vereisen virale vectoren voor succesvolle oplevering van transgeen DNA. In tegenstelling tot neonatale cardiomyocytens, de cultuur van volwassen knaagdieren hartspiercellen 11-13 zorgt voor onderzoeken van myofibrillair degradatie en uiteindelijk herstel van het contractiele apparaat. Deze karakteristieke morfologische veranderingen in volwassen hartspiercellen plaatsvinden over een periode van 1-2 weken. De dedifferentiatie - redifferentiatie gaat gepaard met reexpression van het foetale genprogramma, waardoor pathologische veranderingen waargenomen in menselijke cardiomyopathieën 14 nabootsen. Een ander voordeel van volwassen hartspiercellen ratten via kweek van neonatale cardiomyocyten is de mogelijkheid om kweek deze cellen voor langere tijd.
Rat vs muis hartspiercellen
De isolatie en de cultuur van de rat neonatale cardiomyocyten heeft een aantal voordelen ten opzichte van dat van de muis neonatale hartspiercellen, met inbegrip van hogere opbrengsten van levensvatbare cellen en verhoogde transfectie tarieven. De brede gebruik van genetisch gemodificeerde muismodellen voor hartaandoeningen (bijv. </ Em> de spier lim eiwit knockout muis als model voor uitgezette cardiomyopathie 15) heeft geleid tot de aanpassing van de isolatie procedure voor cardiomyocyten afgeleid van pasgeboren muizen. Hoewel de protocollen neonatale ratten en muizen cardiomyocyten isoleren bijna identiek moet zorgvuldiger worden genomen bij de keuze van een geschikt enzym mix voor de laatste. Inderdaad, neonatale muis hartspiercellen algemeen gevoeliger voor overdigestion, resulterend in een verminderde cel-opbrengst en levensvatbaarheid. Bovendien moet de beplating dichtheid aangepast, omdat cardiomyocyten afgeleid van neonatale muizen zijn iets kleiner dan cellen uit neonatale rat hearts.
Bij veel toepassingen voor het onderzoeken van morfologische, elektrofysiologische, biochemische, celbiologische en biomechanische parameters, alsmede voor het proces van myofibrillogenesis zijn gekweekte neonatale cardiomyocyten een van de meest veelzijdige systemen voor de studie van gewordencardiale celfuncties in vitro. De eerste stap naar een succesvolle test is echter afhankelijk van een gemakkelijke en betrouwbare methode voor neonatale muis hartspiercellen isoleren. Ons protocol haalt zijn methodologie uit vele bronnen en werd geoptimaliseerd voor reproduceerbaarheid en robuustheid. We bespreken factoren cardiomyocyt-opbrengst en levensvatbaarheid beïnvloeden, en bieden een verscheidenheid aan mogelijkheden voor het optimaliseren van isolatie en kweekomstandigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De volgende procedure beschrijft een tweedaags protocol 16,17 voor de isolatie en de cultuur van neonatale muis hartspiercellen. Alle oplossingen zijn steriel of steriel gefiltreerd. Alle instrumenten worden gesteriliseerd door oppervlakte sterilisatie met 75% ethanol. Behalve de eerste weefselextractie, worden alle stappen uitgevoerd in een steriele laminaire stroming celkweek kap. Dit protocol is bestemd voor het isoleren van neonatale muisharten 1-2 nest (s) - ongeveer 5-14 pups, maar kan worden aangepast voor grotere worpen en neonatale rat cardiomyocyten. Schaal media / enzym gebruik zo nodig.
Voor het werken met neonatale knaagdieren, raadpleegt u uw plaatselijke richtlijnen en regels universiteit uiteengezet door de wetgever en / of dierlijke zorgprogramma's, en voldoen aan uw institutioneel goedgekeurd dier protocol. Alle methoden beschreven in dit protocol zijn goedgekeurd door de UC San Diego Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC), en zich houden aan federal en nationale regelgeving.
Dag 1.
1. Isolatie van hartweefsel van pasgeboren muizen
- Bereid 50 ml 1x PBS (zonder Ca 2 +, Mg 2 +) aangevuld met 20 mM BDM 6-8 en verspreiden in twee steriele bacteriële gerechten op ijs geplaatst.
- Bereid 10 ml van isolatie medium in 50 ml steriele conische Falcon buis. Houd alle oplossingen op het ijs. Steriliseren schaar (een gebogen, een recht), en pincet (gebogen, Dumont No.7).
- 1-3 dagen oud pasgeboren muizen worden snel gespoeld in 75% ethanol-oplossing voor oppervlakte sterilisatie. Pups worden onthoofd met behulp van een steriele schaar (recht), en de borstkas wordt geopend langs het borstbeen om de toegang tot de borstholte en het hart (Figuur 1A, aanvullende Movie S1) mogelijk te maken.
Technische opmerking: Neonatale muizen ouder dan 3 dagen worden toegepast, maar resulteren in minder levensvatbare cellen 2. - Harten worden gewonnen uithet lichaam met gebogen schaar en onmiddellijk overgebracht naar de bacteriële schotel met 1x PBS (zonder Ca 2 +, Mg 2 +) met 20 mM BDM, op ijs. Alle volgende stappen worden uitgevoerd in de steriele celkweek kap.
- Verwijder longweefsel, grotere schepen (atria en, indien gewenst). Wassen harten in de 1x PBS-oplossing (zonder Ca 2 +, Mg 2 +) met 20 mM BDM (op ijs) om bloed te verwijderen. Transfer gewassen harten van eerste gerecht in de tweede bacteriële schotel met 1x PBS (zonder Ca 2 +, Mg 2 +) met 20 mM BDM (op ijs) met behulp van een tang of een geperforeerde lepel (Figuur 1B).
- Transfer schoongemaakt / gewassen harten tot een daling van isolatie medium (ongeveer 250 pl; figuur 1C) in een derde bacteriële schotel (op ijs) en gebruik de gebogen schaar om harten gehakt in kleine stukjes (ca. 0,5-1 mm 3, of kleiner; Figuur 1D, 1E).
- Transfer gehakt harten in een conischebuis met 10 ml isolatiemedium (op ijs) en incubeer onder zacht schudden bij 4 ° C overnacht.
Dag 2.
2. Enzymatische Tissue Spijsvertering en Plating van Cellen
- Weeg in 15 mg collagenase / dispase mengsel (Roche), en los het enzym mix in 10 ml L15-medium 5 aangevuld met 20 mM BDM (spijsvertering gemiddeld). Steriel filter de vertering medium in de celkweek kap in een nieuwe steriele 50 ml Falcon buis.
- Bereid 30 ml L-15 medium aangevuld met 20 mM BDM en plaatmedium.
- Coat celcultuur platen met collageen oplossing (Sigma C-8919) gedurende minimaal 1 uur. Verwijder collageen oplossing (kunnen worden hergebruikt) en droog collageen gecoate celcultuur gerechten in steriele laminaire stroming celcultuur motorkap.
- Verwijder de conische buis met de voorverteerd harten bij 4 ° C. Weefselfragmenten dienen te worden samengevoegd (figuur 1G). Laat de weefselfragmenten zinkende bodem van de buis en verwijder het supernatant (zorg ervoor dat elk weefsel fragmenten niet te verliezen;. normaal, kan ongeveer 1 ml van de isolatie medium in de buis blijven). Voeg 5 ml digestiemedium en 5 ml L-15 aangevuld met 20 mM BDM weefsel fragmenten en oxygenaat suspensie op met zuurstof of lucht gedurende 1 min.
- Breng de afgedichte conische buis met het hartweefsel fragmenten digestiemedium tot 37 ° C waterbad gedurende ongeveer 2 minuten om de temperatuur van de vertering bij te stellen.
- Incubeer hartweefsel fragmenten bij 37 ° C onder zacht schudden gedurende 20-30 min (bijv. schudinrichting bij 37 ° C, ingesteld op maximaal 60 rpm). Digestietijden sterk afhankelijk enzymmengsel en het lotnummer. Let op: langere incubatietijd of hoger enzymconcentraties kan levensvatbaarheid van de cellen te verminderen.
Technische opmerking: Wij raden het gebruik van een collagenase / dispase mengsel van Roche (Cat.Nr.: 102.69638001) dat zeer weinig hoop tot batch variabiliteit. De klassieke enzym voor de isolatie van muizen cardiomyocyten trypsine en / of collagenase type II 3,16-20 verkrijgbaar bij Worthington (Cat No CLS-2). Echter, kunnen de prestaties van collagenase II aanzienlijk verschillen van partij tot batch. Worthington zorgt meestal voor het testen van verschillende collagenase veel te digestietijden optimaliseren en enzym gebruik. Alternatief Worthington verkoopt een cardiomyocyt isolatie kit met een vooraf geteste enzym mengsel dat kan worden aangepast voor de isolatie van muizen cardiomyocyten 17 (Cat No: NCIS).
- Plaats steriele cel-zeef (40-100 micrometer nylon mesh) in verse steriele 50 ml conische Falcon buis. Pre-natte cel zeef met 5 ml L-15 aangevuld met 20 mM BDM. Zachtjes wrijf weefselfragmenten behulp van een vooraf bevochtigd 10 ml celcultuur pipet voor ongeveer 10-20 keer. De weefselfragmenten moet vooral dispergeren tijdens deze stap, loslaten van de cellen in suspension (Figuur 1H).
- Laat grotere weefselfragmenten sediment en overdracht supernatant dat gesuspendeerde cellen in vers conische buis via cel-zeef (Figuur 1I).
- Resuspendeer de onverteerd weefsel fragmenten in 5 ml digestiemedium Incubeer nog eens 5-10 minuten bij 37 ° C onder zacht schudden.
- Na aanhoudende vertering van restmateriaal fragmenten, zachtjes vermaal weefsel voor 10-20 keer en toe te voegen aan conische buis met cellen uit de eerste verteren door cel zeef. Spoel cel-zeef met 5 ml L-15 aangevuld met 20 mM BDM om doorgang van alle gedigereerd cellen mogelijk.
- Centrifugaat conische buis dat gesuspendeerde cardiomyocyten gedurende 5 min bij 300 rpm (ongeveer 50-100 xg). Verwijder de bovenstaande vloeistof (die voornamelijk fibroblasten en endotheelcellen) en resuspendeer celpellet in 10 ml plaatmedium.
- Plaat cellen in 10 cm celkweekschaal (Figuur 2A) en incubeer gedurende 1-3 Uur in celkweek incubator. Deze pre-plating stap verwijdert fibroblasten en endotheelcellen (Figuur 2B), die zal zich houden aan de ongecoate cel-cultuur schotel (figuur 2C).
- Na incubatie was niet hechtende cardiomyocyten van 10 cm kweekschaal (resuspendeer cellen door herhaaldelijk pipetteren de beplating medium via schotel), en overdracht geresuspendeerde cellen naar een steriele conische Falcon centrifugebuis (15 ml of 50 ml).
Optioneel: Herhaal de pre-plating stap om extra fibroblasten van cel-suspensie te verwijderen. Desgewenst kan de hechtende fibroblast en endotheliale cellen verder gekweekt. - Tellen cellen (bijv. door Neubauer hemocytometer, trypanblauwexclusie kleuring 21).
- Plaat cellen in collageen gecoate celkweekschalen met een dichtheid van ongeveer 1,5 x 10 5 cellen per cm 2 (figuur 2D, zie ook de opmerkingen in Tabel 1 op platingen coating).
Plaats het bestek in celkweek incubator en laat men het gedurende 12-18 uur te zorgen voor hechting en spreiding van hartspiercellen.
Dag 3 - Cultuur van neonatale cardiomyocyten
- Bereid onderhoud middelgrote en voorverwarmen op 37 ° C waterbad. Zie Tabel 1 voor de toevoeging van proliferatie remmers of chronotroop agenten, of de procedure voor de liposomale transfectie van neonatale muis hartspiercellen.
- Een dag na plating moet hartspiercellen hebben gehandeld op grond van de celkweek schotel en optimaal beginnen spontaan samentrekken (figuur 2E, 2F; Aanvullende Movie S2; zie Tabel 2 voor veel voorkomende problemen tijdens de isolatie / cultuur procedure). Vervang plating medium met onderhoud medium, en cultuur voor een extra 1-5 dagen. Opnieuw medium nodig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van dit protocol, geïsoleerd we harten van 8 een dag oud pasgeboren muizen (figuren 1A, 1B, aanvullende Movie S1). Na wassen en fijnhakken de harten met een schaar (Figuren 1C-1F), werden weefselfragmenten voorverteerd in isolatiemedium een nacht bij 4 ° C onder zacht schudden. Na predigestion (figuur 1G), overgedragen we het weefsel fragmenten in vers digestiemedium en gedurende het weefsel fragmenten gedurende 20 minuten bij 37 ° C onder zacht schudden. De resulterende celsuspensie (Figuur 1H) werd gefiltreerd door een cel zeef (figuur 1G). Na centrifugatie werden de celpellets opnieuw gesuspendeerd in 8 ml plaatmedium en preplated in een 10 cm celkweekschaal (Figuur 2A), en gedurende 2 uur om voor de bevestiging van fibroblasten en endotheelcellen (Figuren 2B, 2C). Cellen die niet snel heeft toegekend waren regeschorst in de plating medium. 10 ul van de celsuspensie met cardiomyocyten werd pipetteted in een eppendorfbuisje en gekleurd met trypan blauwe oplossing in een 1:1 verhouding. Cellen werden geteld met behulp van een geautomatiseerde celgetalmeter waarvan er ongeveer 5,1 x 10 5 levende cellen / ml plaatmedium. Na telling, werden cellen uitgeplaat in vier 30 mm collageen beklede celcultuurschalen (2 ml per plaat), die in ongeveer 1 x 10 6 cellen uitgeplaat per schaal (1,4 x 10 5 cellen / cm 2, Figuur 2D). 18 uur na plating, werden cardiomyocyten verbonden aan het collageen gecoate celkweekschalen (met ongeveer 70% confluentie) en begon spontaan samentrekken (figuur 2E, aanvullende Movie S2). Vervolgens cardiomyocyten werden ofwel gebruikt voor liposomale transfectie (zie tabel 1) en de cellen werden direct overgebracht van de platen in het onderhoud medium (figuur 2F) en gedurende nog 3 dagen. Na kweken werden cardiomyocyten kort gewassen in 1x PBS, gedurende 5 min in 4% PFA / PBS gefixeerd en verwerkt voor immunofluorescentie zoals beschreven in een van onze recente publicaties 22. Representatieve resultaten afbeelden immunologisch gekleurd getransfecteerde en getransfecteerde cardiomyocyten culturen worden in Figuren 2G en 2H, respectievelijk. De gekweekte neonatale cardiomyocyten tonen de verwachte cytoarchitecture, zoals blijkt uit de weergave van de myofibrillen (rode signaal in figuur 2G) en de geïntercaleerde schijfvormige structuren (groene signaal in figuur 2G). Ze zijn ook ontvankelijk voor transiënte transfecties, zoals in figuur 2H (groen signaal getransfecteerde eiwit; rood signaal tegenkleuring van myofibrillen met een alfa-sarcomeer actinine antilichaam).
"Fo: src =" / files/ftp_upload/50154/50154fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50154/50154fig1.jpg "/>
Figuur 1. Isolatie van hartweefsel van pasgeboren muizen. A) Het hart wordt voorzichtig van de thorax met behulp van gebogen pincet (zie ook Aanvullende Movie S1). B) Harten geïsoleerd van 8 pasgeborenen worden in 1x PBS gewassen (zonder Ca 2 +, Mg 2 +) aangevuld met 20 mM BDM op ijs. C) Harten worden overgebracht in een daling van isolatie medium. DE) Mincing van neonatale harten met behulp van gebogen schaar. F) Overdracht van gehakt hartweefsel met behulp van een vooraf bevochtigd pipet. G) predigested hartweefsel na incubatie gedurende de nacht bij 4 ° C. H) cardiomyocyten als suspensie na 20 minuten van de spijsvertering en trituratie. Onverteerd hartweefsel ophoopt op de bodem van de buis. I) De suspensie van geïsoleerde cardiomyocytes wordt door een cel zeef.
Figuur 2. Cultuur van neonatale muis hartspiercellen en representatieve immunofluorescentie afbeeldingen. A) Plating geïsoleerde cellen bij het begin van de pre-plating stap. B) Cardiale fibroblasten en endotheelcellen beginnen te hechten aan het onbeklede celkweekschaal na 1-3 uur van cultuur tijdens de pre-plating stap. C) Na resuspensie van niet-hechtende cardiomyocyten, kan resterende cardiale fibroblasten en endotheliale cellen verder gekweekt, indien gewenst. D) Plating van geïsoleerde en gezuiverde neonatale muis cardiomyocyten als collageen beklede cel-kweekschalen . E) Na 18 uur in cultuur, hartspiercellen zich houden aan de gecoate dishes, en optimaal start spontane weeën (zie ook Aanvullende Movie S2). F) Het vervangen van de beplating medium met onderhoud medium verwijdert dode cellen uit de kweek. A)-F) Scalebar 0,2 mm. G) immunofluorescentie beeld van neonatale muis hartspiercellen, gekleurd met antilichamen tegen myomesin Vertegenwoordiger (Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa, MMAC myomesin B4, in het rood) en beta-catenine (Sigma, Cat.-No .: C2206, in het groen). Scalebar 10 micrometer. H) immunofluorescentie beeld van getransfecteerde neonatale muis hartspiercellen met de uitdrukking GFP-gelabelde eiwit in groen (GFP-titin-N2B fragment), en alfa-actinin (Sigma, Cat.-No.A-7811) in het rood Vertegenwoordiger . Scalebar 20 urn. Werkwijze voor transfectie en immunologische kleuring in 2G) en 2H) te vinden in tabel 1, en wordt samengevat in een van onze recente publicaties 22.
Aanvullende Movie S1. Aanvullende Movie S2. Klik hier om aanvullende film te bekijken . Tabel 1. Optimalisatie van beplating en kweekomstandigheden, liposomaal transfectie. Tabel 2. Het oplossen van problemen. Vele factoren kunnen invloed hebben op de succesvolle isolatie en kweek van primaire cels. Gelieve handboeken zoals "Cultuur van dierlijke cellen" raadplegen door Ian Freshney 21, als algemene inleidingen in basis celcultuur technieken. Mogelijke oorzaken voor de problemen in de isolatie en cultuur procedur van neonatale muis cardiomocytes dat we tegenkwamen het vaakst zijn opgenomen in deze tabel. Pre-plating Pre-plating cellen na isolatie sterk verwijdert cardiale fibroblasten en endotheelcellen van de gehele cel mengsel. Een pre-plating stap verwijdert ongeveer 50-80% van de niet-hartspiercellen uit de cel-populatie. Herhaling van pre-plating meer dan tweemaal, alsmede pre-plating keer langer dan 3 uur wordt niet aanbevolen vanwege bijkomend verlies van cardiale myocyten. Substitutie van pre-plating met Percoll-gradiënt 23,24 kan de zuiverheid van de cardiomyocyt celpopulatie verbeteren. Coating en celcultuur substraat Coating van celcultuur gerechten met exextracellulaire matrix (ECM) componenten zoals collageen, fibronectine, laminine, complexe ECM mengsels (dwz matrigel 25,26) of kunstmatige substraten (dwz siliconenpolymeer 27 organosilan 28) positief beïnvloedt cardiomyocyte aanhankelijkheid, levensvatbaarheid van de cellen en cellen verspreiden tijdens de eerste plating stap en voor de volgende kweekperiode. Vooral de cultuur van cardiomyocyten op glassubstraten vereist de bekleding van het oppervlak met ECM componenten om goede hechting van cardiomyocyten bereiken.
We testten bekleding van celkweek behandelde plastic en glazen substraten met verschillende ECM componenten, inclusief 0,1% collageen oplossing (Sigma C-8919), 3 mg / ml collageen type 1 oplossing (Advanced Biomatrix, PureCol), 1% gelatine-oplossing ( Sigma G9391; opgelost in H 2 O, geautoclaveerd), laminine oplossingen (Sigma L4544), of complexe ECM mengsels afgeleid van varkensharten 29 of cardiale fibroblasten 30. Cel culture schalen werden geïncubeerd met de ECM oplossingen minimaal 1 uur tot een nacht in de celkweek incubator en na verwijdering van ECM gedroogd in de laminaire stroming celcultuur kap. ECM oplossingen kunnen vaak (10-20 keer) worden hergebruikt indien steriliteit en ECM eiwitten integriteit tijdens langdurige opslag wordt gehandhaafd (bijvoorbeeld opslag bij 4 ° C of bevroren). Opgelet, vanwege het zure karakter van bepaalde buffers ECM eiwitten lossen, wassen van kweekplaten met 1x PBS na bekleding kan worden vóór plateren van de cellen nodig. Plating techniek en dichtheid Afhankelijk van de verdere analyses, moet optimale celconcentraties voor plating resulteren in de buurt van dichtgegroeide cardiomyocyte monolagen. Plating van hartspiercellen in hoge concentraties leiden tot meerlaagse cardiomyocyte aggregaten en lage homogeniteit, terwijl lage concentraties vermindert de levensvatbaarheid en de resultaten cel in enkele, geïsoleerde hartspiercellen verstoken van gespecialiseerde cel-cel contacts (ingelast disk-achtige structuren). Bij het pipetteren cellen voor plating bedenken dat hartspiercellen zijn vrij groot en zwaar, en hebben de neiging om zich te concentreren op de bodem van de falcon buis. Resuspensie van cellen in tussen plating stappen zorgt voor een gelijkmatige verdeling van de cellen in uw gerechten. Wanneer plating cellen bewegen schotels in de vorm van een cijfer "8" naar concentratie van de cellen aan het midden van de schaal te voorkomen. De optimale samenvloeiing van neonatale cardiomyocyten aangewezen voor liposomaal transfectie moeten circa 70-80% zijn de dag na plating. Serum Het gebruik van celkweek getest foetus (of pasgeboren) runder serum en paard serum in de beplating medium is noodzakelijk voor de levensvatbaarheid van de cellen en de hechting van hartspiercellen tijdens de beplating stap. De kwaliteit van de gebruikte serum kan een van de kritische stappen tijdens de beplating / cultuur procedure. Suppletie van het onderhoud medium met lage hoeveelheden serum is optioneel, maar kan sterk verbeve duur van cultuur tijd.
Waarschuwing: de toevoeging van serum aanzienlijk veranderen biochemische signaalwegen in gekweekte cardiomyocyten en kunnen worden beoordeeld met betrekking tot experimentele parameters hypothese en daaropvolgende interpretatie van de resultaten. Serumvrije kweken van hartspiercellen beschreven 10,31 en kan vertekening van de resultaten te voorkomen door onbekende groeifactoren aanwezig in het serum. Proliferatie-remmers Terminaal gedifferentieerde hartspiercellen meestal niet ondergaan celdeling. De toevoeging van proliferatie inhibitoren, zoals 10 uM AraC (cytosine-BD-arabino-furanoside hydrochloride; Sigma C6645) op het onderhoudsmedium sterk aanbevolen om proliferatie van cardiale fibroblasten en endotheelcellen voorkomen. Zelfs met de toevoeging van pre-plating stappen om de populatie van fibroblasten en endotheelcellen beperken, zullen de resterende fibroblasten cel Proli ondergaanferation en aanzienlijk veranderen de gekweekte cel-populatie in de tijd.
Let op: afhankelijk van genetische factoren en de isolatie tijd-point, embryonale en neonatale muis hartspiercellen kunnen nog proliferatie potentieel 23,32,33. Het gebruik van AraC moet worden beoordeeld, afhankelijk van experimentele parameters, hypothese en interpretatie van de resultaten. Toevoeging van chronotroop agenten Suppletie van het onderhoud medium met agenten 34, zoals fenylefrine (0,1 mM, bij voorkeur voor neonatale rat cardiomyocyten; Sigma P6126), of isoproterenol (1 uM, bij voorkeur voor neonatale muis hartspiercellen; Sigma I6501) verhoogt sarcomerogenesis, het verspreiden van hartspiercellen op de plaat evenals spontane slaan van cellen. Echter, de toevoeging van deze middelen worden afgewogen ten opzichte van de gewenste test parameters (zoals kan bovendien contractiele gedrag en biochemische parameters scheef). Transfectie Liposomale transfectie van DNA / RNA in neonatale muis hartspiercellen is sterk afhankelijk van de transfectie tijdpunt, transfectie reagens, kweekdichtheid, DNA / RNA concentratie en gebruikte DNA-construct. We testten verschillende liposomale transfectie reagentia en vonden ESCORT III (Sigma) en Lipofectamine 2000 (Invitrogen) van toepassing. Transfecteren cellen 24 uur na uitplaten door vervanging van de beplating medium 2 uur voor transfectie met antibiotica vrij onderhoudsmedium. Voor transfectie van neonatale hartspiercellen gekweekt in 30 mm gerechten, meng 1-2 pg DNA met 200 ul DMEM in een steriele eppendorfbuisje en voeg 4 pi Escort III om de verdunde DNA-mengsel. Meng voorzichtig en incubeer gedurende minimaal 5 min in steriele kap DNA / liposoom complexvorming mogelijk. Vervang de antibiotica-gratis onderhoud medium met 800 ul vers antibiotica-gratis onderhoud medium en voeg DNA / liposoom aan de cellen. Incubeer cellen in cel culture incubator en te vervangen door verse standaard onderhoud medium na 24 uur. Een representatief resultaat succesvol getransfecteerde cardiomyocyten neonatale muis wordt getoond in figuur 2H. Transfectie met calcium precipitatie van DNA mogelijk. Transfectie van neonatale muis hartspiercellen is moeilijker in vergelijking met neonatale cardiomyocyten rat, met typische transfectie efficiëntie variërend 1-20%. Virale vectoren moeten hogere rendementen 35-37 bereiken (bijv. adenovirus, adeno-geassocieerd virus, lentivirus). Elektroporatie van neonatale cardiomyocyten in onze handen ongeschikt voor de afgifte van DNA / RNA echter verscheidene rapporten succes middels elektroporatie van de embryonale en neonatale cardiomyocyten 38,39. In een recent artikel 38, Djurovic et al.. Samenvatten verschillende transfectiewerkwijzen, slagingspercentages en hun voor-en nadelen. Passage Invriezen / Stowoede Passage van cardiomyocyten wordt afgeraden 1. Bevriezing van geïsoleerde neonatale cardiomyocyten voor langdurige opslag is uiterst moeilijk en niet aan te raden vanwege de lage efficiëntie en lage herstel tarieven. Verschillende bedrijven bieden gespecialiseerde bevriezing medium voor humane cardiomyocyten primaire kweken (bijv. Celprogen, cat.. M36044-15FM) die ook geschikt zijn voor de cryopreservatie van neonatale muis hartspiercellen kan echter omstandigheden moet worden geoptimaliseerd. De succesvolle passage en cryopreservatie van atriale hartspiercellen is beschreven in een transgeen muismodel 32. Geen haalbaar of aanhangende cellen 1 dag na plating - Verminderen enzym concentratie en / of spijsvertering tijd
- Verandering enzymmengsel
- ChaNSE serum voor plaatmedium
- Verandering ECM / coating middellange en / of type celkweekschalen
- Voeg 20 mM BDM isolatie / spijsvertering media
- Controleren op besmetting van cellen Lage celopbrengst - Verhoging van de spijsvertering tijd en / of enzym concentratie
- Toename centrifugeren tijd / snelheid tijdens isolatieprocedure
- Verhoging aanwrijving periode Confluentie van cellen in cultuur is te laag / hoog; oneffen plating - Cellen tellen tijdens isolatie procedure en pas aantal cellen / schaal tijdens plating
- Stel plating concentratie
- Zorgvuldig resuspendeer celpellet na centrifugeren en vóór plating door herhaaldelijk pipetteren (dag 2 stap 13), zorg ervoor dat geen zichtbare cel-klonten blijven Geen kloppend cellen - Voeg chronotroop agenten om onderhoud medium (bv.: fenylefrine, isoproterenol)
- Vervang medium
- Check voor hoge aantal cardiale fibroblasten / endotheelcellen Hoog aantal fibroblasten - Voeg extra preplating stap tijdens isolatieprocedure
- Voeg proliferatie remmer onderhoud medium (tabel 1) Veel dode cellen - Vervang de celcultuurmedium
- Enzymconcentratie en / of vertering te verminderen tijdens isolatieprocedure
- Check celkweek incubator (CO 2, temperatuur, vochtigheid)
- Controleren op vervuiling Besmetting - Zich te houden aan steriele celkweek arbeidsomstandigheden 21
- Vervang medium, gebruik nieuwe penicilline / streptomycine oplossing
- Oppervlak steriliseren neonatale muizen met 75% ethanol-oplossing
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het gebruik van diermodellen om hartziekten te bestuderen is standaard geworden in het cardiovasculair onderzoek. Dichter biochemische karakterisering van deze modellen (dwz het bestuderen van directe reacties van hartcellen aan biochemische of biomechanische stimuli) vereist meestal de isolatie van hart weefsels of hartspiercellen. Onderzoeken naar fysiologische reacties van het hart ex vivo (bv. om acetylcholine 40, of in ischemie-reperfusie scenario 41) over het algemeen gebruik-Langendorff perfusie hele hart 42,43, terwijl explantkweken 44,45 van hartweefsel fragmenten zorgen voor onderzoeken van hartspiercellen in een driedimensionale weefselmilieu. Echter, het kweken explantaat weefsels diffusie van voedingsstoffen belemmeren mogelijk genereren van een necrotische cluster in de kern van het weefsel. Bovendien hartspiercellen immobiel in het weefsel, dus migratie van cellen uit explants is slechts obseGraco behoudt voor niet-hartspiercellen, zoals fibroblasten of vermeende cardiale voorlopercellen 44. Onderzoek naar de ontwikkelings-, cel-biologische, biochemische en biofysische gedrag van hartspiercellen derhalve vereist de oprichting van isolatie en het kweken procedures. Vroeg protocollen voor het kweken van zoogdiercellen cardiomyocyten gebruiken neonatale ratten 1,2. Echter, de opkomst van de muis als een modelsysteem voor genetisch onderzoek (dwz genetisch gemodificeerde knock-in of knock-out muizen) noodzakelijk de aanpassing van de bestaande isolatie en het kweken van methodieken. Helaas, de isolatie van neonatale muis hartspiercellen bijzonder uitdagend vergeleken met die van de meer traditioneel gebruikte neonatale cardiomyocyten van de rat. Het gepresenteerde protocol beschrijft een betrouwbare en robuuste werkwijze geoptimaliseerd voor het kweken van neonatale muis hartspiercellen. We beschrijven de stappen die nodig zijn voor de eerste weefsel extractie, voor de dissociatie eennd zuivering van cardiomyocyten van fibroblasten en endotheelcellen, en de platen en kweekomstandigheden. Terwijl het protocol biedt een fundamentele benadering van de het kweken van neonatale muis hartspiercellen onder standaard omstandigheden, kan het gemakkelijk worden aangepast voor het kweken van neonatale cardiomyocyten van de rat, en voor bepaalde typen volgende test: bijvoorbeeld kweek van de geïsoleerde cellen op flexibele membranen (bijv. Bioflex cultuur platen) aan biomechanische eigenschappen te onderzoeken, cultuur in glazen bodem gerechten (MatTek) voor live cell imaging, of de cultuur van hartspiercellen in xCELLigence cardio e-platen (Acea, Roche, Cat.-No.: 06417051001) de effecten van geneesmiddelen op de contractiele functie te bestuderen. Daarnaast bieden wij mogelijkheden voor het optimaliseren van de isolatie en kweek procedure en bespreken bronnen voor mogelijke problemen en hun oplossingen. Daarom moet dit protocol helpen onderzoekers de behandeling van een up-to-date, zeer reproduceerbaar enbetaalbare methode voor het bereiden van neonatale muis cardiomyocytkweken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen.
Acknowledgments
Wij zijn dankbaar aan Prof emeritus Jean-Claude Perriard en Evelyn Perriard (Zwitserse Federale Instituut voor Technologie, Zwitserland) voor de introductie in isolatietechnieken voor neonatale rat en muis hartspiercellen. We willen graag Prof Ju Chen en prof. Sylvia Evans (UCSD, USA) bedanken voor hun steun. Werk in het laboratorium van EE werd gefinancierd door een MRC Career Establishment Grant. SL wordt ondersteund door een K99/R00 pad naar onafhankelijkheid onderscheiding van de NIH / NHLBI (HL107744). TMM werd ondersteund door een postdoctoraal fellowship van de American Heart Association (11POST7310066).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8 | Sigma | B-0753 | prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47. |
| Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | can be substituted with collagenase type II from Worthington |
| Collagenase type II3 | Worthington | CLS-2 | substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche |
| 1x trypsin solution (0.25%) with EDTA | cellgro | 25-053-CI | |
| 1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS | cellgro | 30-002-Cl | |
| 1x PBS (without Ca2+, Mg2+) | e,g, cellgro | 21-040-CV | |
| HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4 | cellgro | 21-022-CV | |
| DMEM high glucose | cellgro | 10-013-CV | |
| M-199 | cellgro | 10-060-CV | |
| fetal bovine serum | cellgro | 35-011-CV | cell-culture grade |
| horse serum | cellgro | 35-030-CV | cell-culture grade |
| Leibovitz L-155 | cellgro | 10-045-CV | |
| AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride) | Sigma | C-6645 | proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C |
| phenylephrine | Sigma | P-6126 | chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
| isoproterenol hydrochloride | Sigma | I-6501 | chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
| 0.1% collagen solution | Sigma | C-8919 | extracellular matrix for coating |
| 3 mg/ml collagen type 1 solution | Advanced BioMatrix | 5005-B | alternative to Sigma collagen solution |
| cell strainer | Fisherbrand | 22363548 | appropriate filter size:40 μm-100 μm |
| syringe filter 0.2 μm | Fisherbrand | 09-719C | for sterile filtration of digestion medium |
| straight scissors | Fine Sciences Tools | 91460-11 | |
| curved scissors | Fine Science Tools | 91461-11 | |
| Dumont No. 7 forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| perforated spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | optional, for transfer of heart tissue |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | live cell staining |
| Neubauer hemocytometer | Prosource Scientific | 3500 | alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems |
| 50 ml Falcon tubes | Fisherbrand | 14-432-23 | |
| 15 ml Falcon tubes | Fisherbrand | 05-527-90 | |
| 20 ml syringe | BD Medical | 14-820-19 | |
| 10 ml serological pipette | Falcon | 357551 | |
| 30 mm cell culture dish | Nunc | 153066 | for standard culture of cardiomyocytes |
| 30 mm cell culture dish, glass bottom | MatTek | P35G-0-10-C | for live cell imaging with inverted microscope |
| 10 cm cell culture dish | Nunc | 172958 | for preplating |
| Escort III | Sigma | L3037 | for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000 |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies, Invitrogen | 52887 | substitute for Escort III |
Buffers and media:
|
|||
References
- Harary, I., Farley, B. In vitro studies of single isolated beating heart cells. Science. 131, 1674-1675 (1960).
- Harary, I., Farley, B. In vitro studies on single beating rat heart cells. I. Growth and organization. Exp. Cell Res. 29, 451-465 (1963).
- Worthington Biochemical Corp. Worthington Enzyme Manual. , Freehold. N.J. Available from: http://www.worthington-biochem.com/index/manual.html (2012).
- Hanks, J. H., Wallace, R. E. Relation of oxygen and temperature in the preservation of tissues by refrigeration. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 71, 196-200 (1949).
- Leibovitz, A. The Growth and Maintenance of Tissue-Cell Cultures in Free Gas Exchange with the Atmosphere. Am. J. Hyg. 78, 173-180 (1963).
- Mulieri, L. A., Hasenfuss, G., Ittleman, F., Blanchard, E. M., Alpert, N. R. Protection of human left ventricular myocardium from cutting injury with 2,3-butanedione monoxime. Circ. Res. 65, 1441-1449 (1989).
- Thum, T., Borlak, J. Butanedione monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures. Cardiovasc Toxicol. 1, 61-72 (2001).
- Verrecchia, F., Herve, J. C. Reversible blockade of gap junctional communication by 2,3-butanedione monoxime in rat cardiac myocytes. Am. J. Physiol. 272, 875-885 (1997).
- Allen, T. J., Chapman, R. A. The effect of a chemical phosphatase on single calcium channels and the inactivation of whole-cell calcium current from isolated guinea-pig ventricular myocytes. Pflugers Arch. 430, 68-80 (1995).
- Mitcheson, J. S., Hancox, J. C., Levi, A. J. Cultured adult cardiac myocytes: future applications, culture methods, morphological and electrophysiological properties. Cardiovasc. Res. 39, 280-300 (1998).
- Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 14, 397-412 (1982).
- Claycomb, W. C., Palazzo, M. C. Culture of the terminally differentiated adult cardiac muscle cell: a light and scanning electron microscope study. Dev. Biol. 80, 466-482 (1980).
- Eppenberger, M. E., et al. Immunocytochemical analysis of the regeneration of myofibrils in long-term cultures of adult cardiomyocytes of the rat. Dev. Biol. 130, 1-15 (1988).
- Eppenberger, H. M., Hertig, C., Eppenberger-Eberhardt, M. Adult rat cardiomyocytes in culture A model system to study the plasticity of the differentiated cardiac phenotype at the molecular and cellular levels. Trends Cardiovasc Med. 4, 187-193 (1994).
- Arber, S., et al. MLP-deficient mice exhibit a disruption of cardiac cytoarchitectural organization, dilated cardiomyopathy, and heart failure. Cell. 88, 393-403 (1997).
- Toraason, M., Luken, M. E., Breitenstein, M., Krueger, J. A., Biagini, R. E. Comparative toxicity of allylamine and acrolein in cultured myocytes and fibroblasts from neonatal rat heart. Toxicology. 56, 107-117 (1989).
- Worthington Biochemical Corp. Worthington Tissue Dissection Guide. , Freehold. N.J. Available from: http://www.worthington-biochem.com/tissuedissociation (2012).
- Bashor, M. M. Dispersion and disruption of tissues. Methods Enzymol. 58, 119-131 (1979).
- Speicher, D. W., McCarl, R. L. Pancreatic enzyme requirements for the dissociation of rat hearts for culture. In Vitro. 10, 30-41 (1974).
- Gross, W. O., Schopf-Ebner, E., Bucher, O. M. Technique for the preparation of homogeneous cultures of isolated heart muscle cells. Exp Cell Res. 53, 1-10 (1968).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells : a manual of basic technique and specialized applications. , 6th, Wiley-Blackwell. (2010).
- Lange, S., Perera, S., Teh, P., Chen, J. Obscurin and KCTD6 regulate cullin-dependent small ankyrin-1 (sAnk1.5) protein turnover. Mol Biol Cell. , (2012).
- Sen, A., Dunnmon, P., Henderson, S. A., Gerard, R. D., Chien, K. R. Terminally differentiated neonatal rat myocardial cells proliferate and maintain specific differentiated functions following expression of SV40 large T antigen. J. Biol. Chem. 263, 19132-19136 (1988).
- Evans, H. J., Goodwin, R. L. Western array analysis of cell cycle protein changes during the hyperplastic to hypertrophic transition in heart development. Mol. Cell Biochem. 303, 189-199 (2007).
- Bakunts, K., Gillum, N., Karabekian, Z., Sarvazyan, N. Formation of cardiac fibers in Matrigel matrix. Biotechniques. 44, 341-348 (2008).
- Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. FASEB J. 14, 669-679 (2000).
- Nawroth, J. C., et al. A tissue-engineered jellyfish with biomimetic propulsion. Nat. Biotechnol. 30, 792-797 (2012).
- Das, M., et al. Long-term culture of embryonic rat cardiomyocytes on an organosilane surface in a serum-free medium. Biomaterials. 25, 5643-5647 (2004).
- DeQuach, J. A., et al. Simple and high yielding method for preparing tissue specific extracellular matrix coatings for cell culture. PLoS One. 5, e13039 (2010).
- VanWinkle, W. B., Snuggs, M. B., Buja, L. M. Cardiogel: a biosynthetic extracellular matrix for cardiomyocyte culture. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 32, 478-485 (1996).
- Karliner, J. S., Simpson, P. C., Taylor, J. E., Honbo, N., Woloszyn, W. Adrenergic receptor characteristics of cardiac myocytes cultured in serum-free medium: comparison with serum-supplemented medium. Biochem Biophys Res Commun. 128, 376-382 (1985).
- Steinhelper, M. E., et al. Proliferation in vivo and in culture of differentiated adult atrial cardiomyocytes from transgenic mice. Am. J. Physiol. 259, H1826-H1834 (1990).
- Ahuja, P., Perriard, E., Perriard, J. C., Ehler, E. Sequential myofibrillar breakdown accompanies mitotic division of mammalian cardiomyocytes. J. Cell Sci. 117, 3295-3306 (2004).
- Iwaki, K., Sukhatme, V. P., Shubeita, H. E., Chien, K. R. Alpha- beta-adrenergic stimulation induces distinct patterns of immediate early gene expression in neonatal rat myocardial cells. fos/jun expression is associated with sarcomere assembly; Egr-1 induction is primarily an alpha 1-mediated response. J. Biol. Chem. 265, 13809-13817 (1990).
- Kirshenbaum, L. A., MacLellan, W. R., Mazur, W., French, B. A., Schneider, M. D. Highly efficient gene transfer into adult ventricular myocytes by recombinant adenovirus. J. Clin. Invest. 92, 381-387 (1993).
- Maeda, Y., et al. Adeno-associated virus-mediated transfer of endothelial nitric oxide synthase gene inhibits protein synthesis of rat ventricular cardiomyocytes. Cardiovasc Drugs Ther. 15, 19-24 (2001).
- Zhao, J., et al. Lentiviral vectors for delivery of genes into neonatal and adult ventricular cardiac myocytes in vitro and in vivo. Basic Res. Cardiol. 97, 348-358 (2002).
- Djurovic, S., Iversen, N., Jeansson, S., Hoover, F., Christensen, G. Comparison of nonviral transfection and adeno-associated viral transduction on cardiomyocytes. Mol. Biotechnol. 28, 21-32 (2004).
- van Bever, L., et al. Pore loop-mutated rat KIR6.1 and KIR6.2 suppress KATP current in rat cardiomyocytes. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 287, 850-859 (2004).
- Sakai, K., Akima, M., Tsuyama, K. Evaluation of the isolated perfused heart of mice, with special reference to vasoconstriction caused by intracoronary acetylcholine. J. Pharmacol Methods. 10, 263-270 (1983).
- Reichelt, M. E., Willems, L., Hack, B. A., Peart, J. N., Headrick, J. P. Cardiac and coronary function in the Langendorff-perfused mouse heart model. Exp Physiol. 94, 54-70 (2009).
- Tian, R. Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy. J. Vis. Exp. (42), e2069 (2010).
- Liao, R., Podesser, B. K., Lim, C. C. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303, H156-H167 (2012).
- Zakharova, L., Nural-Guvener, H., Gaballa, M. A. Cardiac explant-derived cells are regulated by Notch-modulated mesenchymal transition. PLoS One. 7, e37800 (2012).
- Rudy, D. E., Yatskievych, T. A., Antin, P. B., Gregorio, C. C. Assembly of thick, thin, and titin filaments in chick precardiac explants. Dev. Dyn. 221, 61-71 (2001).
- Thum, T., Borlak, J. Reprogramming of gene expression in cultured cardiomyocytes and in explanted hearts by the myosin ATPase inhibitor butanedione monoxime. Transplantation. 71, 543-552 (2001).
- Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 294, H1667-H1674 (2008).
