Summary
Birincil fare kardiyomyosit kültürleri miyofibriler organizasyon ve fonksiyon soruşturma için önemli araçlardan biridir. Aşağıdaki protokol neonatal fare kalpleri birincil kardiyomiyositlerde izolasyonunu ve kültür açıklar. Elde edilen kültürler, daha sonra kardiyomiyosit biyomekanik, biyokimyasal ve hücre-biyolojik tahlillerin çeşitli için kullanılabilmektedir.
Abstract
Kültürlü neonatal kardiyomiyositler uzun myofibrillogenesis ve miyofibriler fonksiyonlarını incelemek için kullanılır olmuştur. Kültürlü kardiyomiyositler kolay soruşturma ve manipülasyon biyokimyasal yolların ve kendiliğinden kardiyomiyositlerin dayak biyomekanik özellikleri üzerine etkileri için izin verir.
Aşağıdaki 2 günlük protokol neonatal fare kardiyomiyositlerin izolasyonunu ve kültür açıklar. Biz kolayca yenidoğanlardan kalpleri incelemek kardiyak doku ayırmak ve kardiyak hücre-nüfustan kardiyomiyositlerin zenginleştirmek için nasıl göstereceğim. Bu hücre ayrışması için farklı bir enzim karışımlarının kullanımı, ve hücre canlılığı üzerindeki etkilerini tartışır. İzole edilmiş kardiyomiyositlerde sonra morfolojik elektrofizyolojik, biyokimyasal, hücre-biyolojik ya da biyo-mekanik bir çok analizde kullanılabilir. Biz sadece piyasada mevcut çözümlerini kullanarak, sağlamlık ve tekrarlanabilirlik için protokol optimize edilmiş ve enzim karışır show az lot partiye değişkenlik. Biz de kardiyomiyositlerin izolasyonu ve kültürü ile ilgili ortak sorunları çözmek ve izolasyon ve kültür koşullarının optimizasyonu için çeşitli seçenekler sunuyoruz.
Introduction
Kemirgen kalp hücrelerinin başarılı ayrışma ve kültürü için erken raporlarının 1960 1,2 dayanıyor. O zaman bile, Harary ve Farley kültürlü kardiyomiyositler "periyodik kontraktilitenin gereksinimleri çalışma için benzersiz bir sistem sağlayabilir [ve olabilir] [dayak] işlemi için çeşitli metabolik yolların katkısını belirlemek için bir araç sağlamak" olduğunu fark ettim. Genç farelerde ve özgün protokolden Harary ve Farley izole ve kültürlü kardiyomiyositler yılda uyarlanmış ve birçok bilim adamı tarafından değiştirilmiş olmasına rağmen, genel izolasyon ve kültür prosedür büyük ölçüde değişmedi. Ancak, daha iyi enzimler 3, standart çözeltiler 4,5, ve izolasyon prosedürü sırasında 6-9 hücreleri korumak için, tersinir kanal ve myosin ATPase inhibitörü BDM ilavesinin anlamlı hücre verimi ve canlılığı geliştirdi.
Yenidoğan cardiomyo vs Adultcytes
Neonatal fare veya sıçan izole edilmiş ve kültürlenmiş Kardiyomiyositler yetişkin kardiyomiyositlerde kültürler üzerinde çeşitli avantajları vardır. Yetişkin fare veya sıçanın 10 kardiyomiyositlerin izolasyonu kıyasla önemlisi, yenidoğan fare veya sıçan kalpleri için izolasyon prosedürü, daha kolay ve daha az maliyetlidir. Neonatal kardiyomiyositlerde büyük hücre verimini artırmak, ayrışma sonra bir kalsiyum-içeren bir ortam içine tekrar başlatmak için çok daha az duyarlıdır. Yetişkin kardiyomiyositler genellikle kasılmasını uyardığı volta ihtiyaç duyarken, genellikle kendiliğinden kaplamadan sonra hücreler 20 saat yenerek sonuçları Rediferansiasyon döngüsü - Başka bir büyük avantajı yenidoğan fare kardiyomiyositler daha hızlı farksızlaşma tabi olmasıdır. Yetişkin kardiyomiyositlerde transgenik DNA'nın başarılı gönderim viral vektörler gerektirir ise Neonatal kardiyomiyositlerde, hali hazırda daha da lipozomal transfeksiyon yöntemleri ile transfekte bulunmaktadır. Neonatal kardiyomiyosit aksines, yetişkin kemirgen kardiyomiyositlerinin 11-13 kültür miyofibriler bozulması ve kontraktil aparat nihai yeniden kurulması soruşturma için izin verir. Yetişkin kardiomyositlerindeki Bu karakteristik morfolojik değişiklikler, 1-2 haftalık dönemlerde ortaya çıkar. Farksızlaşma - Rediferansiasyon döngüsü böylece insan kardiyomiyopati 14 gözlenen patolojik değişikliklerin taklit eden, fetal gen program reexpression eşlik eder. Neonatal kardiyomiyositlerin kültürüne de yetişkin fare kardiyomiyositlerin diğer bir avantajı, uzun bir süre boyunca kültüre yeteneği, bu hücredir.
Fare kardiyomiyositler vs sıçan
Sıçan yenidoğan kardiyomiyositlerin izolasyonu ve kültürü canlı hücrelerin daha yüksek verim ve artan transfeksiyon oranları dahil olmak üzere mouse yenidoğan kardiyomiyositlerinin, o üzerinde bazı faydaları vardır. Ancak, kardiyak hastalıklar için genetiği değiştirilmiş fare modellerinin geniş kullanım (örn. </ Em> dilate kardiyomiyopati 15 için bir model olarak kas lim protein knockout fare) neonatal farelerden türetilen kardiyomiyositlerin için izolasyon prosedürü uyarlanmasına yol açmıştır. Neonatal sıçan ve fare kardiyomiyositlerde izole edilmesi için kullanılan protokoller hemen hemen aynı olmasına rağmen, daha büyük bir bakım ikincisi için uygun bir enzim karışımı seçiminde dikkate alınmalıdır. Gerçekten de, neonatal fare kardiyomiyositlerde azaltılmış verim ve hücre canlılığı ile sonuçlanan genel olarak Overdigestion karşı daha hassastır. Neonatal farelerden türetilen kardiyomiyositlerde yenidoğan sıçan kalplerinde türetilmiş hücreler ile karşılaştırıldığında biraz daha küçük olduğu için Ayrıca, kaplama yoğunluğu, ayarlanmalıdır.
Morfolojik elektrofizyolojik, biyokimyasal, hücre-biyolojik ve biyomekanik parametreleri hem de myofibrillogenesis süreci için araştırılması için bir çok kullanıma sahip, kültürlü neonatal kardiyomiyositlerde çalışma için çok yönlü sistemlerinden biri haline gelmiştirin vitro kardiyak hücre fonksiyonları. Başarılı bir tahlil için ilk adım, ancak, neonatal fare kardiyomiyositlerde izole etmek için kolay ve güvenilir bir yöntem bağlıdır. Bizim protokol birçok kaynaktan metodolojisini çizer ve tekrarlanabilirlik ve sağlamlık için optimize edilmiştir. Biz kardiyomyosit-verim ve canlılığını etkileyen faktörleri tartışmak ve izolasyon ve kültür koşullarının optimizasyonu için çeşitli seçenekler sunar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıdaki prosedür, neonatal fare kardiyomiyositlerde izolasyonu ve kültürü için iki günlük bir protokol 16,17 açıklanmaktadır. Bütün çözeltiler, steril veya steril filtre edilmiş bulunmaktadır. Bütün araçlar% 75 etanol ile yüzey sterilizasyonu ile sterilize edilir. Ilk doku çıkarma hariç olmak üzere, tüm adımları steril bir laminer akış başlığı içinde bir hücre kültürü yapılmaktadır. Bu protokol, bir-iki çöp (ler) den neonatal fare kalpleri izolasyonu için tasarlanmıştır - yaklaşık 5-14 yavrular, ancak daha büyük çöp boyut ve sıçan neonatal kardiyomiyositlerde için adapte edilebilir. Uygun ölçekli medya / enzim kullanımı.
Neonatal kemirgenler ile çalışmak için, yasama ve / veya hayvan bakım programları tarafından belirlenen yerel üniversite kurallar ve kurallar bakın ve kurumsal olarak onaylanmış hayvan protokole uymak. Bu protokol açıklanan tüm yöntemler UC San Diego Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış, ve fede bağlı olmuşturral ve eyalet düzenlemeleri.
Gün 1.
1.. Yenidoğan fareler ile Kardiyak Doku İzolasyonu
- 20 mM BDM 6-8 ile desteklenmiş (Ca2 +, Mg2 + olmadan) PBS 1x 50 ml hazırlayın, ve buz üzerine yerleştirilmiş, iki steril bakteriyel tabaklar içine dağıtılır.
- 50 ml steril Falcon konik tüp içinde yalıtım maddesi 10 ml hazırlayın. Buz üzerinde tüm çözümleri tutun. Ve forseps (kavisli, Dumont No.7) makas (bir düz kavisli bir) sterilize.
- 1-3 günlük yenidoğan farenin yüzey sterilizasyonu için% 75 etanol çözeltisi içinde hızlı bir şekilde çalkalanır. Yavrular steril makas (düz) kullanılarak öldürülmüş, ve göğüs göğüs boşluğuna erişim ve kalp (Şekil 1A, Ek Film S1) izin sternum boyunca açılır.
Teknik Yorum: 3 günden daha eski Yenidoğan fareler kullanılır, ama daha az canlı hücrelerin 2 neden olabilir. - Kalpler ayıklanırkavisli makasla gövde ve 20 mM BDM ile (Ca2 +, Mg2 + olmaksızın), 1x PBS içeren bakteriyel çanak içine hemen transfer buz üzerinde. Aşağıdaki bütün işlemler steril hücre kültürü kaputu gerçekleştirilir.
- (Arzu edildiği takdirde, ve kulakçıklar) Akciğer dokusu, daha büyük bir gemi çıkarın. 1x PBS çözeltisi içinde yıkama kalpler (Ca olmadan 2 +, Mg2 +), 20 mM BDM (buz üzerinde) ile kan kaldırın. Aktarım 20 mM (buz üzerinde), BDM forseps kullanılarak ya da perfore kaşık (Şekil 1 B) ile (Ca2 +, Mg2 + olmaksızın), 1x PBS içeren ikinci bakteri çanak içine birinci çanak kalpleri yıkanmıştır.
- Aktarım temizlenmiş / izolasyon ortamının bir damla (yaklaşık 250 ul; Şekil 1C) içine kalpleri yıkanmış, kurutulmuş (buz üzerinde) üçüncü bir bakteri tabağına ve küçük parçalara (yaklaşık 0.5-1 mm 3 ya da daha küçük içine kalpleri kıymaya kavisli makas kullanımı; Şekil 1D, 1E).
- Bir konik içine kıyılmış kalpleri aktarıntüp (buz üzerinde), izolasyon ortamında 10 ml içeren, ve gece boyunca 4 ° C'de, hafifçe çalkalanarak inkübe edin.
Gün 2.
2. Hücreler doku enzimatik sindirim ve Kaplama
- Kolajenaz / dispaz karışımı (Roche) 15 mg tartılır ve 20 mM BDM (sindirim ortamı) ile takviye edilmiş 10 ml L15 orta 5 enzim karışımı çözülür. Steril filtresi yeni bir steril bir 50 ml Falcon tüpü içine, hücre kültürü kaputu sindirim ortam.
- 30 ml L-15, 20 mM BDM ile takviye edilmiş bir ortam, ve kaplama orta hazırlayın.
- 1 saat arasında, en az kolajen çözeltisi (Sigma C-8919) ile kaplayın, hücre-kültür plakaları. Steril bir laminer akış hücre kültürü kaputu kollajen çözüm (yeniden kullanılabilir) ve kuru kollajen kaplı hücre kültür kaplarına çıkarın.
- 4 ° C ila predigested kalpleri içeren konik tüp kaldırmak Doku parçaları (Şekil 1G) birleştirilmelidir. Doku parçaları batar izintüpün alt ve (herhangi bir doku parçaları gevşek değil emin olun., normalde, izolasyon ortamının yaklaşık 1 ml tüp içinde kalabilir) süpernatant kaldırmak. Sindirim sıvısının 5 ml ve 1 dakika boyunca oksijen ya da hava ile doku parçaları ve oksijenat süspansiyona, 20 mM BDM ile desteklenmiş L-15 5 ml.
- Sindirim çözeltinin sıcaklığını ayarlamak için yaklaşık 2 dakika için 37 ° C su banyosuna sindirim ortam içinde kardiyak doku parçaları ihtiva eden kapalı konik tüp aktarın.
- 20-30 dakika süre ile hafif bir çalkalama (60rpm daha fazla ayarlanmış 37 ° C'de, örneğin karıştırıcı) ile 37 ° C 'de kardiyak doku parçaları inkübe edin. . Sindirim kez büyük enzim karışımı ve lot numarası Dikkat bağlı olabilir: daha uzun kuluçka dönemleri veya daha yüksek enzim konsantrasyonları hücre canlılığını azaltabilir.
Teknik Yorum: 102696: Biz (Kat.No. Roche Bir kollajenaz / dispase karışımının kullanımını tavsiye38001) çok az çok partiye değişkenlik sahiptir. Fare kardiyomiyositlerde izolasyonu için klasik enzim tripsin ve / veya Worthington (Cat No CLS-2) 'den temin kollajenaz tip II 3,16-20 olduğunu. Bununla birlikte, kolajenaz II performans çok partiye önemli ölçüde farklı olabilir. Worthington genellikle sindirim süresinin optimizasyonu ve kullanım enzim için çeşitli kolajenaz daha test edilmesi için izin verir. Seçenek olarak ise, Worthington, önceden test edilmiş enzim karışımı ile bir kardiyomiyosit izolasyon kiti sattığı fare kardiyomiyositlerde 17 (: NCIS Cat No) izolasyonu için uyarlanabilir dahildir.
- Taze steril 50 ml konik falcon tube steril hücre süzgeç (40-100 um naylon örgü) yerleştirin. 20 mM BDM ile desteklenmiş 5 ml L-15 ile Pre-ıslak hücre süzgeç. Yaklaşık 10-20 kat için önceden ıslatılmış 10 ml hücre kültürü pipet ile hafifçe çiğnemek doku fragmanları. Doku parçaları çoğunlukla suspensio içine hücreleri serbest, bu aşama sırasında dağılmalıdırn (şekil 1 H).
- Büyük doku parçaları çöktürmek edelim ve hücre süzgeç (Şekil 1i) yoluyla taze konik tüp içine askıya hücreleri içeren transferi yüzer.
- 5 ml ortam içinde sindirim sindirilmemiş doku parçaları yeniden askıya ve nazik çalkalama ile 37 ° C'de ilave bir 5-10 dakika boyunca inkübe edin.
- Kalan doku parçalarının devam sindirim sonra, yavaşça 10-20 kez doku çiğnemek ve ilk hücre süzgecinden sindirmek itibaren konik tüp içeren hücrelere ekleyin. Her sindirilmiş hücre geçişine imkan vermek için 20 mM BDM ile desteklenmiş 5 ml L-15 ile hücre süzgeç durulayın.
- Santrifugat konik bir tüp 300 rpm'de 5 dakika (yaklaşık 50-100 xg) askıya kardiyomiyositlerde ihtiva etmektedir. (Çoğunlukla fibroblastlar ve endotelial hücreleri içeren) süpernatantı ve ortam maddesi 10 ml yeniden askıya hücre topağı.
- 10 cm hücre kültür çanağı (Şekil 2A) içine ve 1 boyunca inkübe Plate hücrelerHücre kültürü inkübatöründe -3 hr. Bu ön kaplama aşaması, kaplanmamış hücre kültür çanağı (Şekil 2C) için uygun olacak olan, fibroblastlar ve endotel hücreleri (Şekil 2B) kaldırır.
- İnkübasyondan sonra, transfer yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler, steril bir Falcon konik bir santrifüj tüpüne (15 ml veya 50 ml) 'den (art arda yemeğin üzerinde kaplama orta pipetleme ile yeniden askıya hücre) 10 cm kültür çanak yapışmayan kardiyomiyositlerde yıkama ve.
İsteğe bağlı: hücre süspansiyonu ek fibroblastlar kaldırmak için ön kaplama adımı tekrarlayın. Eğer arzu edilirse, yapışkan fibroblast ve endotelial hücreler daha fazla kültürlendi olabilir. - (Neubauer hemositometresi kullanarak, örneğin 21 boyanarak mavi dışlama tripan) hücreleri saymak.
- Cm 2 (Şekil 2B için yaklaşık 1.5 x 10 5 hücre yoğunluğunda olan kollajen kaplı hücre kültürü çanaklarına Plate hücreleri aynı zamanda bakınız kaplama üzerine, Tablo 1 'de yorumlarve kaplama).
Hücre kültürü inkübatör içine yerleştirin yemekleri ve bağlılık ve kardiyomiyositlerdeki yayılmasını sağlamak için 12-18 saat boyunca rahatsız bırakın.
3. Gün - neonatal kardiyomiyositlerin Kültür
- 37 ° C su banyosunda bakım ortamı ve Prewarm hazırlayın. Neonatal fare kardiyomiyositlerin lipozomal transfeksiyon için çoğalma inhibitörleri veya kronotropik maddelerin eklenmesi veya prosedür için Tablo 1 'e bakın.
- Bir gün sonra kaplama kardiyomiyositler hücre kültürü kabına yapışan ve optimal sözleşme kendiliğinden başlamak olmalıdır (Şekil 2E, 2F; Ek Film S2, izolasyon / kültür işlemi sırasında ortak sorunlar için bkz Tablo 2). Ilave 1-5 gün boyunca bakım ortamına, ve kültür ile orta kaplama değiştirin. Gerektiğinde orta değiştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokolü kullanarak, 8 bir gün eski yenidoğan farelerin (Şekil 1A, 1B, Ek Film S1) kalplerini izole. Yıkama ve makas (Şekil 1 C-1F) ile kalpleri kıyma işleminden sonra doku fragmanları, yumuşak çalkalama ile 4 ° C'de gece boyunca izolasyon ortamı içinde önceden sindirilmiş edilmiştir. Predigestion (Şekil 1G) takiben, taze ortam içine sindirim doku parçaları transfer ve nazik çalkalama ile 37 ° C'de 20 dakika boyunca doku parçaları inkübe edildi. Elde edilen hücre süspansiyonu (Şekil 1 H), bir hücre süzgecinden (Şekil 1G) ile filtre edilmiştir. Santrifüj sonrasında, hücreler topak haline orta kaplama 8 ml yeniden süspansiyon haline getirilmiş ve bir 10 cm hücre kültür çanağı (Şekil 2A) içine preplated ve kardiyak fibroblastlar ve endotel hücreleri (Şekil 2B, 2C) bağlanması için izin vermek için 2 saat süre ile kültüre edildi. Hızla eklemek vermedi hücreleri yeniden edildikaplama ortamı içinde süspansiyon haline getirildi. Kardiyomiyositlerde içeren hücre süspansiyonu, 10 ul bir eppendorf tüpüne pipetteted ve bir 1:1 oranında bir trypan blue çözeltisi ile boyandı. Hücre / ml 'orta kaplama yaklaşık 5.1 x 10 5 hücre yaşam sonuçlanan bir otomatik hücre sayacı kullanılarak sayıldı. Sayma sonra, hücreler tabak (: Şekil 2B 1.4 x 10 5 hücre / cm2) başına yaklaşık 1 x 10 6 kaplama hücrelerinde ortaya çıkan dört 30 mm kollajen kaplı, hücre kültür kapları (tabak başına 2 mi) içine konuldu. 18 saat sonra kaplama, kardiyomiyositler (yaklaşık% 70 kaynaşması olan) kollajen kaplı hücre kültürü yemekleri bağlı ve kendiliğinden (Şekil 2E, Ek Film S2) sözleşme başlanmıştır. Daha sonra, kardiyomiyositlerde ya da (Tablo 1 e bakınız), lipozomal transfeksiyon için kullanılmıştır ya da hücreler, doğrudan bakım ortamına (Şekil 2F) içine kaplama aktarılmıştır ve bir 3 gün kültürlendi. Kültürün ardından, kısa bir süre kardiyomiyositlerde% 4 PFA / PBS içinde 5 dakika boyunca, sabit ve son yayınlardan 22 birinde tarif edildiği gibi bağışıklık işlemi için, 1 x PBS içinde yıkanmıştır. Immünolojik olarak lekeli transfekte ve transfekte olmuş kültürler kardiyomiyosit tasvir Örnek sonuçlar, sırasıyla, Şekiller 2G ve 2H gösterilmiştir. Kültürlenmiş neonatal kardiyomiyositlerde miyofibril görselleştirme belirgin olarak beklenen hücre mimarisini, (Şekil 2G kırmızı sinyal) ile birleştirilmiş bir disk-benzeri yapılar (Şekil 2G yeşil sinyali) görüntüler. Şekil 2H'de görüldüğü gibi bu, aynı zamanda, geçici nakiller için uygun olan (yeşil sinyal transfekte edilmiş protein, bir alfa-aktinin sarkomerik antikoru kullanılarak miyofibril kırmızı sinyal karşı boyama).
"Fo: src =" / files/ftp_upload/50154/50154fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50154/50154fig1.jpg "/>
8 yeni doğan izole neonatal farelerden alınan kalp dokusunun Şekil 1.. Izolasyonu. A) dikkatli bir şekilde, kalp, kıvrık forsepsler kullanılarak toraks kaldırılır () de Ek Film S1 bakınız. B) Kalpler (Ca2 + olmadan 1x PBS içinde yıkanır Mg2 +)) buzlu. C'de 20 mM BDM ile takviye edilmiş kalpler izolasyon ortamının bir damla içine transfer edilir. DE), önceden ıslatılmış bir pipet kullanarak kavisli makas kıyılmış kalp dokusunun. F) Transfer kullanılarak neonatal kalpler Kıyma. G) sindirim ve çözgen içinde ezerek karıştırma 20 dakika sonra süspansiyon içinde 4 ° C. 'H), kardiyomiyositler de gece boyunca inkübe edildikten sonra, sindirilmiş kalp dokusudur. Sindirilmemiş kardiyak doku) tüp. I altındaki izole c süspansiyon birikirardiomyocytes bir hücre süzgecinden süzülür.
Kalp fibroblastlar ve endotelial hücreler, 1-3 saat sonra, kaplanmamış hücre kültürü çanağı uymak için başlangıç ön kaplama aşaması. B) 'nin başlangıcında izole edilmiş hücreler neonatal fare kardiyomiyositlerde ve temsili immünofloresan görüntülerin Şekil 2.. Kültürü. A) Kaplama eğer istenirse yapışmayan kardiyomiyositlerin yeniden süspande edildikten sonra ön kaplama aşaması. ° C) sırasında kültür, kalan kalp fibroblastlar ve endotelial hücreler, bundan başka kültürlenebilir. kollajen kaplı hücre kültür tabaklarında izole edilmiş ve saflaştırılmış neonatal fare kardiyomiyositlerin D) Kaplama . E) kültür içinde, 18 saat sonra, kardiyomiyositlerde kaplanmış d uymakishes ve optimal (ayrıca Ek Film S2 bakınız). F) bakım ortamı ile kaplama orta değiştirilmesi kültürden ölü hücreleri temizler spontan kasılmalar başlar. Myomesin karşı antikor ile boyandı yenidoğan fare kardiyomiyositlerinin A)-F) ölçek çubuğu 0.2 mm. G) Temsilcisi immünofluoresans görüntü kırmızı (Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası, Iowa, MMAC myomesin B4) ve beta-katenin (Sigma, Kat.-yok .: C2206, yeşil). Kırmızı olarak ifade edilen GFP-etiketli yeşil protein (GFP-Titin-N2B fragmanı) ve alfa-aktinin (Sigma, Kat.-No.A-7811) ile transfekte neonatal fare kardiyomiyositlerin ölçek çubuğu 10 um. H) Örnek immünofloresan image . 20 mikron ölçek çubuğu. Transfeksiyon ve immünolojik 2G kullanılan boyama) ve 2H) için bir yöntem olup, Tablo 1 'de bulunabilir, ve son yayın 22 bir özetlenmiştir.
Ek Film S1. Ek Film S2. tamamlayıcı filmi görmek için buraya tıklayın . Kaplama ve kültür koşulları Tablo 1. Optimizasyonu, lipozomal transfeksiyon. Tablo 2. Sorun Giderme. Birçok faktör primer hücrenin başarılı izolasyonu ve kültürü etkileyebilirs. Temel hücre kültürü teknikleri içine genel tanıtımları gibi, Ian Freshney 21 böyle "Hayvan Hücre Kültürü" olarak kılavuzları danışın. Karşılaştığımız neonatal fare cardiomocytes en izolasyonu ve kültürü prosedüründe sorunları için olası nedenler genellikle bu tabloda listelenmiştir. Pre-kaplama Izolasyon sonra hücrelerin ön kaplama büyük ölçüde tüm hücre karışımından kalp fibroblastlar ve endotel hücreleri ortadan kaldırır. Tek bir ön kaplama işlemi sonunda hücre popülasyonundan olmayan kardiyomiyositlerin yaklaşık 50-80% kaldırır. Iki kat daha fazla ön kaplama, hem de 3 saat daha uzun bir ön kaplama olarak kez tekrarlanması, kardiyak miyositler ek kaybı, tavsiye edilmez. Ile ön kaplama ikamesi Percoll gradient 23,24-kardiyomiyosit hücre popülasyonunun saflığını iyileştirebilir. Kaplama ve hücre kültür substratı Eski ile hücre kültürü yemekleri KaplamaKolajen, fibronektin, laminin, kompleks ECM bunların karışımları (örneğin, Matrigel 25,26) ya da yapay alt-tabakalar (örneğin, silikon polimeri 27 organosilan 28) gibi ekstrasellüler matris (ECM) bileşenleri, pozitif başlangıç kaplama aşaması esnasında yayılan kardiyomiyosit yapışmasını, hücre canlılığı ve hücre etkilemektedir ve takip eden kültür dönemi için. Özellikle cam yüzeylerde kardiyomiyositlerin kültür kardiyomiyositlerin uygun yapışmasını sağlamak için ECM bileşenleri ile yüzeyin kaplama gerektirir.
Bu% 0.1 kolajen çözeltisi (Sigma C-8919), 3 mg / ml kolajen tip 1 çözeltisi (Advanced Biomatrix, PureCol),% 1 jelatin çözeltisi (ECM bileşenleri de dahil olmak üzere, çok çeşitli hücre kültürü ile muamele edilmiş, plastik ve cam alt tabakaların kaplaması test Sigma G9391, H2 O, otoklav içinde çözülmüş), laminin çözeltiler (Sigma L4544) ya da domuz kalbinden 29 veya kalp fibroblast 30 türetilen karmaşık ECM karışımlarıdır. Hücre cultuyemekler hücre kültürü inkübatöründe gece boyunca 1 saat arasında, en az ECM çözümleri ile inkübe edildi ve yeniden laminer akış hücresi kültür muhafaza içinde kurutulmuş ECM çıkarılmasından sonra. Uzun süreli depolama sırasında kısırlık ve ECM protein bütünlüğü (4 ° C ya da dondurulmuş örn. depolama) korunursa ECM çözeltiler birçok kez (10-20 kez) yeniden kullanılabilir. Dikkat nedeniyle ECM proteinleri çözmek için kullanılan tampon bazı asidik yapısı nedeniyle, kaplama sonrası 1x PBS ile kültür kaplarına yıkama hücrelerin kaplama önce gerekli olabilir. Teknik ve yoğunluğu kaplama Daha sonraki deneylerde bağlı olarak, kaplama için uygun hücre konsantrasyonu Yakın-konfluen mono tabakaları kardiyomiyosit sonuçlanmalıdır. Düşük konsantrasyonlar uzmanlaşmış hücre-hücre temas bilgilerini yoksun, tek, izole kardiomyositlerindeki hücre canlılığı ve sonuçlar azaltılır ise yüksek konsantrasyonlarda kardiyomiyositlerin kaplama, çok katmanlı kardiyomyosit agrega ve düşük homojenlik nedents (arakatkılanan disk benzeri yapılar). Kardiyomiyositler oldukça büyük ve ağır, ve şahin tüpün dibine konsantre eğiliminde olduğunu akılda ayı kaplama için hücreleri pipetlerken. Kaplama adımlar arasında hücrelerin resüspansiyon yemeklere boyunca hücrelerin dağılımını sağlar. Kaplama hücreler, bir şeklin şeklindeki yemekler taşıdığınızda "8" çanağın merkezine hücrelerin konsantrasyonu önlemek için. Lipozomal Transfeksiyonda belirlenen yenidoğan kardiyomiyositlerin optimum konfluensisinin kaplamadan sonra günde yaklaşık 70-80% olmalıdır. Serum Hücre kültürünün kullanımı fetal (ya da yeni doğmuş) kaplama ortam içinde sığır serum ve at serumu kaplama adımı sırasında, hücre canlılığı ve kardiyomiyositlerin yapışması için gerekli olan test edilmiştir. Kullanılan serum kalitesi kaplama / kültür prosedürü esnasında önemli adımlardan biri olabilir. Serum düşük miktarda bakım ortamı takviyesi isteğe bağlıdır, ancak büyük ölçüde impro olabilirKültür zaman süresi ettik.
Dikkat: serum eklenmesi önemli ölçüde kültürlü kardiomyositlerindeki biyokimyasal sinyalizasyon yolları değiştirebilir ve deneysel parametreleri, hipotez ve sonuçların sonraki yorumlanması ile ilgili olarak değerlendirilebilir. Kardiyomiyositlerin serum içermeyen kültür 10,31 tarif edilmiştir ve nedeniyle serumda mevcut bilinmeyen büyüme faktörlerine sonuç eğrilme engelleyebilir. Çoğalma inhibitörleri Terminal açıdan farklılaşmış kardiyomiyositlerde tipik hücre-bölünmesi uğramaz. Ancak, bu tür 10 uM AraC (Cytosine-BD-arabino-furanoside hidroklorür; Sigma C6645) gibi, çoğalma önleyiciler, ve buna ek olarak bakım ortamına son derece kalp fibroblast ve endotel hücrelerinin proliferasyonunu önlemek için önerilir. Hatta kalp fibroblastlar ve endotel hücrelerinin nüfusu azaltmak için, ön-kaplama adımlarının ilavesiyle, kalan fibroblast hücre proli uğrayacaktırferation ve önemli ölçüde zaman içinde kültürlenmiş hücre popülasyonu değiştirin.
Dikkat: Genetik faktörler ve izolasyon zaman noktasında, embriyonik ve yenidoğan fare kardiyomiyositler hala çoğalma potansiyeli 23,32,33 olabilir bağlı. AraC'nin kullanımı deneysel parametreleri, hipotez ve sonuçların yorumlanması bağlı olarak değerlendirilmelidir. Kronotropik ajanların eklenmesi (Tercihen neonatal fare kardiyomiyositlerde boyunca 1 uM; I6501 Sigma), ya da, izoproterenol, fenilefrin (Sigma P6126, tercihen 0,1 neonatal sıçan kardiyomiyositlerde için mM) gibi ajanlarla 34 ile muhafaza ortamı takviyesi önemli ölçüde üzerinde kardiyomiyositlerde yayılan sarcomerogenesis artar plaka yanı sıra hücrelerin spontan dayak. Ancak, bu ajanların ilave edilmesi arzu edilen deney parametreleri (örneğin, ekleme, kontraktil davranış ve biyokimyasal parametreler çarpık olabilir) ile ilgili olarak bir seçim yapılması gerekmektedir. Transfection Neonatal fare kardiyomiyositlerde DNA / RNA lipozomal transfeksiyon Transfeksiyon zaman noktası, transfeksiyon tepkin maddesi, kültür yoğunluğu, DNA / RNA konsantrasyonu ve ikinci DNA yapısı büyük ölçüde bağlıdır. Bu lipozomal transfeksiyon reaktifleri çeşitli test edilmiş ve eşlik III (Sigma) ve lipofektamin 2000 (Invitrogen) uygulanabilir bulundu. Antibiyotik serbest bakım ortamı ile transfeksiyondan önce kaplama ortamı 2 saat değiştirerek kaplama sonra hücreler 24 saat transfekte. Neonatal kardiyomiyositlerin transfeksiyon 30 mm tabaklarda kültürlenir için, steril bir Eppendorf tüpü içinde 200 ul DMEM ile 1-2 ug DNA karıştırın ve seyreltilmiş DNA karışımına Escort III 4 ul ekleyin. Yavaşça karıştırın ve DNA / lipozom kompleks oluşumu izin vermek için steril bir muhafaza içinde 5 dakika içinde en az inkübe edin. 800 ul taze antibiyotik içermeyen bakım ortamı ile antibiyotik içermeyen bakım ortamı yerine ve hücrelere DNA / lipozom karışımı ekleyin. Hücre cu hücreleri inkübe24 saat sonra taze standart bakım ortamı ile LTURE kuluçka ve değiştirin. Başarılı bir şekilde transfekte edilmiş fare neonatal kardiyomiyositlerde için temsili bir sonuç Şekil 2H'de gösterilmektedir. DNA kalsiyum çökeltmesi transfeksiyonu da mümkündür. Neonatal fare kardiyomiyositlerde transfeksiyonu% 1-20 arasında değişen tipik transfeksiyon verimliliği ile, neonatal Sıçan kardiyomiyositlerinde göre daha zordur. (: Adenovirüs, adeno-bağlantılı virüs, örneğin, lentivirüs) Viral vektörler, yüksek verim elde etmek için 35-37 gerekmektedir. Neonatal kardiyomiyositlerin elektroporasyon DNA / RNA teslimat için uygun olmayan, bizim ellerde, ancak çeşitli raporlar embriyonik ve yenidoğan kardiyomiyositlerin 38,39 elektroporasyon kullanılarak başarısını gösteriyor. Yeni bir makalede 38, Djurovic ve ark. Çeşitli nakil yöntemlerini, başarı oranlarının yanı sıra avantajları ve dezavantajları özetlemek. Pasajlanması Donma / Stoöfke Kardiyomiyositlerin Pasajlanması 1 tavsiye edilmez. Uzun süreli depolama için izole yenidoğan kardiyomiyositlerin Donma nedeniyle, düşük verimlilik ve düşük kurtarma oranları tavsiye derece zor değildir. Birçok şirket, ancak koşulları optimize edilmesi gerekebilir, neonatal fare kardiyomiyositlerin kriyokorunması için uygun insan kardiyomiyosit birincil kültürleri (örneğin celprogen, kat. No. M36044-15FM) için özel bir dondurma ortam sunar. Atriyal kardiyomiyositlerin başarılı pasajı ve dondurarak saklama bir transgenik fare modelinde 32 'de tarif edilmiştir. Hiç canlı ya da yapışkan hücreler, 1 gün sonra kaplama - Enzim konsantrasyonu ve / veya sindirim süresini azaltmak
- Değişiklik enzim karışımı
- Chaorta kaplama için hücumdan serum
- Değişiklik ECM / kaplama, orta ve / veya hücre kültürü yemekleri türü
- Izolasyon / sindirim medya 20 mM BDM eklemek
- Hücrelerin kirlenme kontrol Düşük hücre verim - Sindirim süresi ve / veya enzim konsantrasyonunu arttırmak
- Izolasyon prosedürü sırasında artması santrifüj süresi / hızı
- Artış trituration dönemi Düzensiz kaplama, kültür içindeki hücreler konfluansa / yüksek çok düşük - Izolasyon işlemi sırasında hücrelerin sayısı ve kaplama sırasında hücre / çanak sayısını ayarlamak
- Kaplama konsantrasyonunu ayarlamak
- Dikkatlice santrifüj sonra hücre pelet tekrar süspansiyon ve tekrarlanan pipetle (günde 2 adım 13) ile kaplama önce, emin olun hiçbir görünür hücre kümeleri kalır olun Hiç dayak hücreler (: Fenilefrin, isoproterenol örneğin) - bakım ortamına Kronotropik maddeler eklemek
- Orta yerine
- ChKalp fibroblast / endotel hücreleri içinde yüksek sayıda Eck Fibroblast yüksek sayısı - Izolasyon prosedürü sırasında ek preplating adım ekleyin
- Bakım ortamına çoğalma önleyici eklemek (Tablo 1) Birçok ölü hücreler - Hücre kültürü ortamı yerine
- Izolasyon prosedürü sırasında enzim konsantrasyonu ve / veya sindirim süresini azaltmak
- Çek hücre kültürü inkübatör (CO 2, sıcaklık, nem)
- Kirlenme kontrol Bulaşma - Steril hücre kültürü çalışma şartları 21 uymak
- Yeni penisilin / streptomisin solüsyonu kullanın, orta yerine
- Yüzey% 75 etanol çözeltisi ile yenidoğan farelerin sterilize
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kalp hastalıklarının çalışma hayvan modellerin kullanımı Kardiyovasküler araştırmalarda standart haline gelmiştir. Bu modellerin yakından biyokimyasal karakterizasyonu (örneğin, biyokimyasal ya da biyo-mekanik uyarıcılara kalp hücrelerinin doğrudan yanıtları eğitim), genellikle kalp dokularının veya kardiyomiyositlerin izole edilmesini gerektirmektedir. Kalbin fizyolojik tepkileri araştıran çalışmalar ex vivo (örneğin 40 asetilkolin, ya da iskemi reperfüzyon senaryolarda 41), genellikle kardiyak doku parçalarının 44,45 kardiyomi araştırmalar için izin eksplant kültürlerinde iken Langendorff perfüze bütün kalpleri 42,43, kullanmak üç boyutlu bir doku ortamı. Ancak eksplant kültür dokuları potansiyel doku çekirdek içinde bir nekrotik küme oluşturma, besin difüzyon engelleyebilir. Ayrıca, kardiyomiyositler doku içinde hareketsiz, bu nedenle eksplantlannın üzerinden hücrelerinin göçü sadece obse olduğunufibroblast veya varsayılan kalp progenitör hücrelerin 44 gibi non-kardiyomiyositlerinin için SVEd. Bu nedenle izolasyon ve kültür prosedürlerin kurulması gerekli kardiyomiyositlerin gelişimsel, hücre-biyolojik, biyokimyasal ve biyofiziksel davranış incelenmesi. Memeli kardiyomiyositlerin izolasyonu ve kültürü için erken protokoller neonatal sıçan 1,2 kullanmaktadır. Ancak genetik çalışmalar için bir model sistem olarak fare yükselişi (yani genetik olarak vurmak veya knock-out fareler modifiye) kurulmuş izolasyonu ve kültüre metodolojileri adaptasyonu gerektirmiştir. Ne yazık ki, yenidoğan fare kardiyomiyositlerin izolasyonu daha geleneksel olarak kullanılan yenidoğan sıçan kardiyomiyositlerin ile karşılaştırıldığında özellikle zordur. Sunulan protokol, neonatal fare kardiyomiyositlerde izolasyonu ve kültürü için optimize edilmiş bir güvenilir ve sağlam bir yöntemi tarif etmektedir. Bu ayrışma a için, ilk doku çıkarma için gerekli adımları tarifnd kalp fibroblastlar ve endotel hücrelerinden kardiyomiyositlerde saflaştırılması ve kaplama ve kültür koşulları için. Protokol standardı koşullarda neonatal fare kardiyomiyositlerde izolasyonu ve kültürü için temel bir yaklaşım sunarken, kolayca neonatal sıçan kardiyomiyositlerde izolasyonu ve kültürü için adapte edilmiş, hem de belirli bir sonraki deney türleri için olabilir: örneğin, izole edilmiş hücrelerin kültür XCELLigence kardiyo e-plakalarda kardiyomiyositlerin canlı hücre görüntüleme ya da kültür için esnek zarların biyomekanik özelliklerini araştırmak için (örn. Bioflex kültür plakaları), cam alt yemekler kültür (MatTek) üzerine (Acea, Roche, Cat.-No.: 06417051001) kasılma fonksiyonları üzerinde ilaçların etkilerini incelemek. Ayrıca, izolasyon ve kültür prosedürün optimizasyonu için seçenekler sunar ve olası sorunları ve bunların çözümleri için kaynaklarını tartışacağız. Dolayısıyla, bu protokol araştırmacılar bir up-to-date, yüksek tekrarlanabilir ve inceleyerek yardımcı olmalıdırFare neonatal kardiyomiyosit kültürlerinin hazırlanması için uygun bir yöntem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yoktur.
Acknowledgments
Biz Prof fahri Jean-Claude Perriard ve Evelyn Perriard yenidoğan sıçan ve fare kardiyomiyosetlere izolasyon teknikleri içine giriş için (Teknoloji, İsviçre İsviçre Federal Enstitüsü) müteşekkiriz. Biz onların destek için Prof Ju Chen ve Prof Sylvia Evans (UCSD, ABD) teşekkür etmek istiyorum. EE laboratuvar İş MRC Kariyer kurulması Grant tarafından finanse edildi. SL NIH / enstitünün (HL107744) dan bağımsızlık ödül için K99/R00 yolu tarafından desteklenmektedir. TMM Amerikan Kalp Derneği (11POST7310066) bir doktora sonrası burs tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8 | Sigma | B-0753 | prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47. |
| Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | can be substituted with collagenase type II from Worthington |
| Collagenase type II3 | Worthington | CLS-2 | substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche |
| 1x trypsin solution (0.25%) with EDTA | cellgro | 25-053-CI | |
| 1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS | cellgro | 30-002-Cl | |
| 1x PBS (without Ca2+, Mg2+) | e,g, cellgro | 21-040-CV | |
| HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4 | cellgro | 21-022-CV | |
| DMEM high glucose | cellgro | 10-013-CV | |
| M-199 | cellgro | 10-060-CV | |
| fetal bovine serum | cellgro | 35-011-CV | cell-culture grade |
| horse serum | cellgro | 35-030-CV | cell-culture grade |
| Leibovitz L-155 | cellgro | 10-045-CV | |
| AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride) | Sigma | C-6645 | proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C |
| phenylephrine | Sigma | P-6126 | chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
| isoproterenol hydrochloride | Sigma | I-6501 | chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
| 0.1% collagen solution | Sigma | C-8919 | extracellular matrix for coating |
| 3 mg/ml collagen type 1 solution | Advanced BioMatrix | 5005-B | alternative to Sigma collagen solution |
| cell strainer | Fisherbrand | 22363548 | appropriate filter size:40 μm-100 μm |
| syringe filter 0.2 μm | Fisherbrand | 09-719C | for sterile filtration of digestion medium |
| straight scissors | Fine Sciences Tools | 91460-11 | |
| curved scissors | Fine Science Tools | 91461-11 | |
| Dumont No. 7 forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| perforated spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | optional, for transfer of heart tissue |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | live cell staining |
| Neubauer hemocytometer | Prosource Scientific | 3500 | alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems |
| 50 ml Falcon tubes | Fisherbrand | 14-432-23 | |
| 15 ml Falcon tubes | Fisherbrand | 05-527-90 | |
| 20 ml syringe | BD Medical | 14-820-19 | |
| 10 ml serological pipette | Falcon | 357551 | |
| 30 mm cell culture dish | Nunc | 153066 | for standard culture of cardiomyocytes |
| 30 mm cell culture dish, glass bottom | MatTek | P35G-0-10-C | for live cell imaging with inverted microscope |
| 10 cm cell culture dish | Nunc | 172958 | for preplating |
| Escort III | Sigma | L3037 | for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000 |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies, Invitrogen | 52887 | substitute for Escort III |
Buffers and media:
|
|||
References
- Harary, I., Farley, B. In vitro studies of single isolated beating heart cells. Science. 131, 1674-1675 (1960).
- Harary, I., Farley, B. In vitro studies on single beating rat heart cells. I. Growth and organization. Exp. Cell Res. 29, 451-465 (1963).
- Worthington Biochemical Corp. Worthington Enzyme Manual. , Freehold. N.J. Available from: http://www.worthington-biochem.com/index/manual.html (2012).
- Hanks, J. H., Wallace, R. E. Relation of oxygen and temperature in the preservation of tissues by refrigeration. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 71, 196-200 (1949).
- Leibovitz, A. The Growth and Maintenance of Tissue-Cell Cultures in Free Gas Exchange with the Atmosphere. Am. J. Hyg. 78, 173-180 (1963).
- Mulieri, L. A., Hasenfuss, G., Ittleman, F., Blanchard, E. M., Alpert, N. R. Protection of human left ventricular myocardium from cutting injury with 2,3-butanedione monoxime. Circ. Res. 65, 1441-1449 (1989).
- Thum, T., Borlak, J. Butanedione monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures. Cardiovasc Toxicol. 1, 61-72 (2001).
- Verrecchia, F., Herve, J. C. Reversible blockade of gap junctional communication by 2,3-butanedione monoxime in rat cardiac myocytes. Am. J. Physiol. 272, 875-885 (1997).
- Allen, T. J., Chapman, R. A. The effect of a chemical phosphatase on single calcium channels and the inactivation of whole-cell calcium current from isolated guinea-pig ventricular myocytes. Pflugers Arch. 430, 68-80 (1995).
- Mitcheson, J. S., Hancox, J. C., Levi, A. J. Cultured adult cardiac myocytes: future applications, culture methods, morphological and electrophysiological properties. Cardiovasc. Res. 39, 280-300 (1998).
- Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 14, 397-412 (1982).
- Claycomb, W. C., Palazzo, M. C. Culture of the terminally differentiated adult cardiac muscle cell: a light and scanning electron microscope study. Dev. Biol. 80, 466-482 (1980).
- Eppenberger, M. E., et al. Immunocytochemical analysis of the regeneration of myofibrils in long-term cultures of adult cardiomyocytes of the rat. Dev. Biol. 130, 1-15 (1988).
- Eppenberger, H. M., Hertig, C., Eppenberger-Eberhardt, M. Adult rat cardiomyocytes in culture A model system to study the plasticity of the differentiated cardiac phenotype at the molecular and cellular levels. Trends Cardiovasc Med. 4, 187-193 (1994).
- Arber, S., et al. MLP-deficient mice exhibit a disruption of cardiac cytoarchitectural organization, dilated cardiomyopathy, and heart failure. Cell. 88, 393-403 (1997).
- Toraason, M., Luken, M. E., Breitenstein, M., Krueger, J. A., Biagini, R. E. Comparative toxicity of allylamine and acrolein in cultured myocytes and fibroblasts from neonatal rat heart. Toxicology. 56, 107-117 (1989).
- Worthington Biochemical Corp. Worthington Tissue Dissection Guide. , Freehold. N.J. Available from: http://www.worthington-biochem.com/tissuedissociation (2012).
- Bashor, M. M. Dispersion and disruption of tissues. Methods Enzymol. 58, 119-131 (1979).
- Speicher, D. W., McCarl, R. L. Pancreatic enzyme requirements for the dissociation of rat hearts for culture. In Vitro. 10, 30-41 (1974).
- Gross, W. O., Schopf-Ebner, E., Bucher, O. M. Technique for the preparation of homogeneous cultures of isolated heart muscle cells. Exp Cell Res. 53, 1-10 (1968).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells : a manual of basic technique and specialized applications. , 6th, Wiley-Blackwell. (2010).
- Lange, S., Perera, S., Teh, P., Chen, J. Obscurin and KCTD6 regulate cullin-dependent small ankyrin-1 (sAnk1.5) protein turnover. Mol Biol Cell. , (2012).
- Sen, A., Dunnmon, P., Henderson, S. A., Gerard, R. D., Chien, K. R. Terminally differentiated neonatal rat myocardial cells proliferate and maintain specific differentiated functions following expression of SV40 large T antigen. J. Biol. Chem. 263, 19132-19136 (1988).
- Evans, H. J., Goodwin, R. L. Western array analysis of cell cycle protein changes during the hyperplastic to hypertrophic transition in heart development. Mol. Cell Biochem. 303, 189-199 (2007).
- Bakunts, K., Gillum, N., Karabekian, Z., Sarvazyan, N. Formation of cardiac fibers in Matrigel matrix. Biotechniques. 44, 341-348 (2008).
- Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. FASEB J. 14, 669-679 (2000).
- Nawroth, J. C., et al. A tissue-engineered jellyfish with biomimetic propulsion. Nat. Biotechnol. 30, 792-797 (2012).
- Das, M., et al. Long-term culture of embryonic rat cardiomyocytes on an organosilane surface in a serum-free medium. Biomaterials. 25, 5643-5647 (2004).
- DeQuach, J. A., et al. Simple and high yielding method for preparing tissue specific extracellular matrix coatings for cell culture. PLoS One. 5, e13039 (2010).
- VanWinkle, W. B., Snuggs, M. B., Buja, L. M. Cardiogel: a biosynthetic extracellular matrix for cardiomyocyte culture. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 32, 478-485 (1996).
- Karliner, J. S., Simpson, P. C., Taylor, J. E., Honbo, N., Woloszyn, W. Adrenergic receptor characteristics of cardiac myocytes cultured in serum-free medium: comparison with serum-supplemented medium. Biochem Biophys Res Commun. 128, 376-382 (1985).
- Steinhelper, M. E., et al. Proliferation in vivo and in culture of differentiated adult atrial cardiomyocytes from transgenic mice. Am. J. Physiol. 259, H1826-H1834 (1990).
- Ahuja, P., Perriard, E., Perriard, J. C., Ehler, E. Sequential myofibrillar breakdown accompanies mitotic division of mammalian cardiomyocytes. J. Cell Sci. 117, 3295-3306 (2004).
- Iwaki, K., Sukhatme, V. P., Shubeita, H. E., Chien, K. R. Alpha- beta-adrenergic stimulation induces distinct patterns of immediate early gene expression in neonatal rat myocardial cells. fos/jun expression is associated with sarcomere assembly; Egr-1 induction is primarily an alpha 1-mediated response. J. Biol. Chem. 265, 13809-13817 (1990).
- Kirshenbaum, L. A., MacLellan, W. R., Mazur, W., French, B. A., Schneider, M. D. Highly efficient gene transfer into adult ventricular myocytes by recombinant adenovirus. J. Clin. Invest. 92, 381-387 (1993).
- Maeda, Y., et al. Adeno-associated virus-mediated transfer of endothelial nitric oxide synthase gene inhibits protein synthesis of rat ventricular cardiomyocytes. Cardiovasc Drugs Ther. 15, 19-24 (2001).
- Zhao, J., et al. Lentiviral vectors for delivery of genes into neonatal and adult ventricular cardiac myocytes in vitro and in vivo. Basic Res. Cardiol. 97, 348-358 (2002).
- Djurovic, S., Iversen, N., Jeansson, S., Hoover, F., Christensen, G. Comparison of nonviral transfection and adeno-associated viral transduction on cardiomyocytes. Mol. Biotechnol. 28, 21-32 (2004).
- van Bever, L., et al. Pore loop-mutated rat KIR6.1 and KIR6.2 suppress KATP current in rat cardiomyocytes. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 287, 850-859 (2004).
- Sakai, K., Akima, M., Tsuyama, K. Evaluation of the isolated perfused heart of mice, with special reference to vasoconstriction caused by intracoronary acetylcholine. J. Pharmacol Methods. 10, 263-270 (1983).
- Reichelt, M. E., Willems, L., Hack, B. A., Peart, J. N., Headrick, J. P. Cardiac and coronary function in the Langendorff-perfused mouse heart model. Exp Physiol. 94, 54-70 (2009).
- Tian, R. Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy. J. Vis. Exp. (42), e2069 (2010).
- Liao, R., Podesser, B. K., Lim, C. C. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303, H156-H167 (2012).
- Zakharova, L., Nural-Guvener, H., Gaballa, M. A. Cardiac explant-derived cells are regulated by Notch-modulated mesenchymal transition. PLoS One. 7, e37800 (2012).
- Rudy, D. E., Yatskievych, T. A., Antin, P. B., Gregorio, C. C. Assembly of thick, thin, and titin filaments in chick precardiac explants. Dev. Dyn. 221, 61-71 (2001).
- Thum, T., Borlak, J. Reprogramming of gene expression in cultured cardiomyocytes and in explanted hearts by the myosin ATPase inhibitor butanedione monoxime. Transplantation. 71, 543-552 (2001).
- Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 294, H1667-H1674 (2008).
