Summary
קומפלקסי חלבונים לזרז תפקודים תאיים מרכזיים. אפיון פונקציונלי והמבני מפורט של מתחמים רבים חיוניים דורש ייצור רקומביננטי. MultiBac הוא מערכת תא baculovirus / חרק מותאם במיוחד לביטוי חלבונים אוקריוטים והמתחמים שלהם. MultiBac יושם כפלטפורמת גישה פתוחה, ונהלי עבודה סטנדרטיים שפותחו על מנת למקסם את התועלת שלו.
Abstract
Proteomics מחקר חשף את המורכבות מרשימות של proteomes אוקריוטים בפירוט חסר תקדים. עכשיו זה רעיון מקובל שבעיקר חלבונים בתאים לא קיימים כישויות בודדות אלא להפעיל את הפעילות הביולוגית שלהם בשיתוף עם הרבה חלבונים אחרים, בבני אדם עשרה או יותר, ויוצרים קווי הרכבה בתא עבור רוב אם לא את כל הפונקציות החיוניות. 1 , 2 ידע של הפונקציה והאדריכלות של מכלולי multiprotein אלה מחייב מתן שלהם באיכות מעולה ובכמות מספקת לניתוח מפורט. מיעוט של קומפלקסי חלבונים רבים בתאים, במיוחד באאוקריוטים, אוסר על חילוצם ממקורות מקומיים, ומחייב ייצור רקומביננטי. מערכת וקטור ביטוי baculovirus (BEVS) הוכיחה להיות שימושי במיוחד עבור ייצור חלבונים אוקריוטים, הפעילות אשר לעתים קרובות מסתמכת על עיבוד שלאחר translational כי מערכות ביטוי נפוצות אחרות לעתים קרובות יכולהלא תומך. 3 BEVS להשתמש baculovirus רקומביננטי שלתוכו הגן של עניין הוכנס להדביק תרביות תאי חרקים אשר בתורו מייצרים את החלבון של בחירה. MultiBac הוא BEVS כי כבר מותאם במיוחד לייצור של קומפלקסי חלבונים אוקריוטים המכילים יחידות משנה רבות. 4 תנאי חיוני לייצור יעיל של חלבונים והקומפלקסים שלהם הם פרוטוקולים חזקים לכל המעורבים בניסוי שביטוי אידיאלי יכול להיות מיושם כצעדים נהלים סטנדרטיים (SOPs הפעלה) ולאחר מכן גם על ידי משתמשים שאינם מומחים בקלות יחסית. פלטפורמת MultiBac בביולוגיה המולקולרית המעבדה האירופית (EMBL) משתמשת בכתיבת נהלים לכל המעורבים בניסוי ביטוי מורכב multiprotein השלבים, החל מהחדרת הגנים לתוך הגנום baculoviral מהונדס מותאם למאפייני ייצור חלבון Heterologous לניתוח בקנה מידה קטנה של החלבון דגימות הופקו. 5-8 הפלטפורמהמותקן במצב פתוח גישה בEMBL גרנובל ותמך במדענים רבים מהאקדמיה ומהתעשייה להאצת פרויקטים של מחקר מורכב חלבון.
Introduction
הפעילות ביולוגית נשלט על ידי אסיפות של חלבונים ויומולקולות אחרות הפועלות בתיאום כדי לזרז פונקציות סלולריות. דוגמאות בולטות ניתן למנות את המנגנון שמעתיק את המידע התורשתי הכלולים בדנ"א לתוך RNA השליח. בבני אדם, יותר מ -100 חלבונים לבוא יחד בתהליך מוגדר ומוסדר לתמלל גנים, ויוצרים מתחמי multiprotein גדולים עם 10 ויותר יחידות משנה כולל RNA פולימראז II ואת גורמי השעתוק הכלליים כגון TFIID, TFIIH ואחרים. 9 דוגמאות נוספות הם הריבוזום, המורכב מהרבה חלבונים ומולקולות רנ"א, שמזרזים סינתזה של חלבון, או מורכב הנקבובית גרעין האחראית על הלוך ביומולקולות דרך מעטפת הגרעין באאוקריוטים. נתיחה ביוכימי ואדריכלית מפורטת של מהות כל מכונות multicomponent בתא היא חיונית כדי להבין את תפקידם. הבהרת המבנה של פרוקריוטים וeukarהריבוזומים yotic, למשל, היוו סימן ההיכר אירועים מניבים תובנה חסרת תקדים לתוך כמה מכונות macromolecular אלה לבצע את התפקיד המיועד שלהם בתא. 10,11
ניתן להשיג הריבוזומים באיכות ובכמות מספיקות למחקר מפורט על ידי מטהר את חומר אנדוגני מהתאים בתרבית, בשל העובדה כי עד 30% מהמסה התאית מורכבת של הריבוזומים. RNA פולימראז II הוא כבר פחות נפוץ בסדרי גודל, והרבה אלף ליטרים של תרבית שמרים הייתי צריך להיות מעובד כדי לקבל תצוגה מפורטת של האטום מורכב חיוני זה מרכזי לשעתוק. 12 רובם המכריע של מתחמים החיוניים האחרים נמצאים באולם סכומים נמוכים בהרבה בתאים מקומיים, ולכן לא יכולים להיות מטוהרים במידה מספקת ממקור חומר מקורי. כדי להבהיר מתחמים כאלה נגישים לניתוח מבני ותפקודי מפורט דורש ייצור Heterologous באמצעות te רקומביננטיchniques.
היה לי ייצור חלבון רקומביננטי השפעה גדולה על מחקר במדעי חיים. חלבונים רבים יוצרו recombinantly, והמבנה והתפקוד שלהם גזורים ברזולוציה גבוהה. תוכניות גנומיקה מבניות ניצלו ההבהרה את הגנום של אורגניזמים רבים כדי לטפל ברפרטואר מוצר הגן של אורגניזמים שלמים במצב תפוקה גבוהה (HT). אלפי מבנים חלבוניים יש בכך נקבעו. עד כה, המערכת הנפוצה ביותר prolifically לייצור חלבון רקומביננטי כבר E. coli, ומערכות ביטוי רבות פותחו ושוכללו במשך השנים לייצור Heterologous בשורה זו. פלסמידים מחסה שפע של פונקציות כדי לאפשר ייצור חלבון בE. coli למלא קטלוגים שלמים של ספקים מסחריים.
עם זאת, א ' יש coli מגבלות מסוימות שהופכות אותו מתאימה לייצור חלבונים אוקריוטים רבים ובעמ 'קומפלקסי חלבונים במפרק עם יחידות משנה רבות. לכן, ייצור חלבון במארחים אוקריוטים הפך יותר ויותר את שיטת הבחירה בשנים האחרונות. מערכת המתאימה במיוחד היטב כדי לייצר חלבונים אוקריוטים היא מערכת וקטור baculovirus הביטוי (BEVS) המסתמכת על baculovirus רקומביננטי נושא את הגנים Heterologous להדביק תרביות תאי חרקים שגדלו במעבדה. מערכת MultiBac היא BEVS פותחה לאחרונה המותאמים במיוחד לייצור של קומפלקסי חלבונים אוקריוטים עם יחידות משנה רבות (איור 1). MultiBac הוצג לראשונה בשנת 2004. -13 מאז השקתו, MultiBac שוכלל ברציפות והזרם בשורה כדי לפשט את הטיפול, לשפר את איכות חלבון המטרה, ובדרך כלל מה שהופך את המערכת נגישה למשתמשים שאינם מומחים על ידי עיצוב נהלי עבודה סטנדרטי (SOPs יעילים). 4 MultiBac יושם במעבדות רבות ברחבי העולם, בACademia ותעשייה. בEMBL בגרנובל, תוכניות לגישה רב לאומיים היו לשים במקום על ידי הנציבות האירופית לספק הכשרה מקצועית בפלטפורמת MultiBac למדענים, שבקשו להשתמש במערכת הייצור הזה לקידום המחקר שלהם. המבנה והתפקוד של קומפלקסי חלבונים רבים שהיו עד כה לא היו נגישים הובהרו על ידי שימוש בדגימות המיוצרות עם MultiBac. 4 בחלק הבא, את הצעדים החיוניים של ייצור MultiBac מסוכמים בפרוטוקולים כפי שהם במבצע במתקן MultiBac ב EMBL גרנובל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Recombineering טנדם (CT) ליצירת בונה ביטוי Multigene
- תכנון אסטרטגיית שיתוף הביטוי. גישת תכנון להחדרת גני העניין שלך לתורמי acceptors. submodules הפיזיולוגי המורכב הפוטנציאלי שלך צריך להיות מקובצים יחד על acceptors ותורמים ספציפיים. השתמש במודול כפל היקף של endonuclease ביות (HE) - זוגות BstXI לשלב קלטות ביטוי בתורם פרט ופלסמידים acceptor 7,8 ליצור את כל המבנים הרלוונטיים בסיליקון ואסטרטגיה ולאמת באופן יסודי לפני שתמשיך לעבודה ניסויית.. לדוגמה, הגנים של עניין יש לבדוק שלא מכילים הוא או אתרי הגבלה אחרים ואת הנוכחות של מסגרות קריאה פתוחות נכונות (ORFs) צריכים להיות מאומתים. לשקול הזמנת גנים סינטטיים מותאמים לשימוש קודון תא חרק ומבנה המשני mRNA כדי לשפר את רמות ייצור חלבון, כמו גם להסרת של כל exiעוקץ אתרים מהגנים של עניין. לשקול הצבת תגי טיהור המבוסס על נתונים מהספרות על N-או גמישים או חשוף C-Termini של החלבונים על פי בחירתך. לשקול יישום אסטרטגיות polyprotein שמטרה בהפקה כמה יחידות משנה חלבון במתחם שלך, אם את הכמויות היחסיות של חלבונים בודדים צריכים להיות מבוקרות עקב בעיות stoichiometry במתחם. 4 כן מפורט "כיצד לבצע" מסמך (ספר אלקטרוני מעבדה מומלץ) המכיל כל צעדי הניסוי הצפויים של הפרויקט שהובילו למבנה multigene המלא (ים). יצירת קבצים אלקטרוניים של פלסמידים התמזגו Cre-loxP למשל על ידי שימוש בתוכנת Cre-ACEMBLER אשר ניתן להוריד מדף הבית של קבוצת ברגר (multiexpression_technologies www.embl.fr/multibac/ / cre-acembler).
- הכנס הגנים של עניין שלך לתורמים ונבחריםAcceptors באמצעות אנזימי הגבלה ואנזים, או, לחלופין, על ידי שימוש בשיטות עצמאיות קשירת בעקבות פרוטוקולים שפורסמו. 5,6,14 אם יש לך גישה לטיפול נוזלי תחנת עבודה ואם אתה מתכנן מספר גדול של מבנים שיופקו ( למשל לגישות קומבינטורית) לשקול השימוש ברובוטיקה תסריטים שפותחו ומיושמים על ידי קבוצת ברגר (איור 2). 14,15 אם טיפול נוזלי תחנת עבודה אינו זמין, להפעלה ידנית באמצעות צלחות microtitre מאפשרת החדרת הגן בHT כמו אופנה.
- אילוצים שהוטלו על ידי הצורך לשלוט בהרכב של יחידות מהשנה הביעה להתממש. במקרה של רמות ביטוי לא מאוזנים של יחידות משנה stoichiometrically בודדות של חלבון מורכב, לשקול יישום אסטרטגיות polyprotein לconjoin כמה יחידות משנה שלך מורכב ופרוטאז ספציפי (למשל הטבק לחרוט NIA פרוטאז וירוס) בORFs גדול בודד במרווחים על ידי Sאתרי proteolytic pecific. 4,8 שקלו שיתוף עם קלטות להביע ביטוי יחידה polyproteins אחד או כמה אם יש לך מורכב מאוד גדול עם יחידות משנה רבות ונרחב הנע משקולות מולקולריות של יחידות משנה נפרדות. לשקול שיתוף להביע כמה הגנים מקודדים לחלבון באותו polyprotein או כמספר קלטות ביטוי זהות אם החלבון שמאופיין בתשואה נמוכה ייצור. 4,13
- לאמת את כל מבני תורם acceptor המשובטים על ידי מיפוי הגבלה (אופציונלית בתפוקה גבוהה) וסדר. המשך הפתיל שילובי התורם acceptor ידי רקומבינציה Cre-LoxP כדי ליצור את בונה ביטוי multigene של בחירה. לאמת מטוהר פלסמידים היתוך Acceptor תורם על ידי מיפוי הגבלה, השתמש רצפים אלקטרוניים שנוצרו על ידי תוכניות דומות כמו התייחסות Cre-ACEMBLER או.
- אחסנו מטוהרים ומאומתים תורמים, וacceptors fusions-acceptor התורם ב -20 ° C או -80 ° C. ארכיון plasmids והרצפים שלהם (Microsoft Excel, Filemaker, אחרים) בזהירות לשימוש מאוחר יותר.
2. Composite Multigene דור baculovirus, הגברה ואחסון
- לשלב וקטורי העברת multigene הגנום baculoviral MultiBac ע"י הפיכה לDH10 תאי מחסה הגנום הנגיפי ואת הפונקציות הנדרשות לTn7 טרנספוזיציה. שים לב שהגנום baculoviral Multibac ניתן מראש עם גנים מסוימים של עניין (YFP סמן, מלווים, וכו ') באתר שלו (LoxP הונדס לתוך הגנום הדיסטלי לאתר המצורף Tn7) על ידי בתגובת vivo Cre קדמה Tn7 אינטגרציה. 13 לאחר Tn7 טרנספוזיציה, תאים עם baculovirus מורכב המכיל את הגנים של עניין נבחרים על ידי הקרנה כחולה / לבן (תוצאות טרנספוזיציה Tn7 מוצלחות בהפסד של α-שלמה של β-גלקטוזידאז, ולכן, עם מושבות Tn7 טרנספוזיציה נכונה להישאר לבנים על סלקטיביתצלחות גאר המכילים X-גל) והוא הוכן על ידי הגנום תמוגה ואתנול / ממטרים isopropanol אלקליין. 5,6
- Transfection וייצור וירוס ראשוני. מקום צלחת תרבית רקמה 6 היטב לתוך מכסה המנוע סטרילית. מתרבית תאי חרקים Sf21 יומן שלב, זרע החוצה aliquots של תאים בבארות וtransfect ידי הוספת הגנום baculoviral מטוהר ומגיב transfection מעורב בתקשורת ובתרבות כפי שתואר. 6 קציר וירוס ראשוני לאחר 48-60 שעות על ידי הסרת בתקשורת ( איכות גבוהה, וירוס כייל נמוך 0 V, בדרך כלל 3 מ"ל לכל טוב). מוסף תקשורת טרי, ולבדוק לייצור חלבון (ואם סמן YFP הוא הווה, לקרינה) לאחר 2-3 ימים נוספים. 6,7
- הגברה של נגיף, נמוך משרד הפנים משטר. השתמש וירוס V 0 להדביק 25-50 מ"ל של תאים בשלב יומן (צפיפות תאים <1x10 6 תאים למ"ל) בקטן (100-250 מ"ל) Erlenmeyer ייקר צלוחיות נסערותעל המלשינים פלטפורמת מסלולית (איור 3). ספירת תאים ולפצל כל 24 שעות עד שתאים להפסיק הכפלה (מעצר הפצה). עקוב משטר נמוך משרד הפנים (ריבוי של זיהום כלומר מספר של חלקיקי וירוסים לכל תא): תאים חייבים להכפיל (לפחות) פעם אחת (משרד הפנים <1), אחרת יחזרו על ניסוי בהיקף קטן יותר של V 0 הוסיף. בדרך כלל, 3 מ"ל של V 0 משמשים להדביק 25 מ"ל של Sf21 תאי חרקים בצפיפות של 0.5x10 6 תאים / מ"ל. זה חיוני כדי למנוע מזיק על ההגברה ומחיקה האוטומטית של וירוס שיכול לגרום לאובדן של גני Heterologous של עניין. קציר וירוס V 1 (25-50 מ"ל) אחרי 48-60 שעות על ידי pelleting תאים והסרה של התקשורת המכיל את הנגיף. להשלים עם תקשורת ולבדוק הטריים לYFP וייצור חלבון על ידי הסרת 1x10 6 תאים בכל שעה 12 או 24, pelleting ואימות ייצור חלבון וחלבון אות סמן (YFP). 6, להגביר את הווירוס (לV 2) עוד יותר אם כרכי ביטוי גדולים יותר מכוונים על ידי הדבקה של עד 400 מ"ל בתאים 2 ליטר שייקר צלוחיות עם וירוס V 1 מכבד את משרד הפנים הנמוך מעל המשטר (תאים חייבים להכפיל לפחות פעם אחת לאחר הדבקה עם 1 V). מקפידים לבדוק את ייצור חלבון וחלבון אות סמן במהלך ההגברה, כדי למנוע הצטברות של וירוסים פגומים כבר לא מכילים את הגנים של עניין שלך. כדורי תא השתמש 5-7 צבירה בכל צעד amplifications כבר להקמת פרוטוקולים לטיהור החלבון המורכבת הביע עניין.
- אחסון BIIC של וירוס ייצור. אנו ממליצים בחום לאחסון וירוס V 2 כוירוס ייצור באמצעות BIIC (B-aculovirus אני nfected אני nsect ג אמות) שיטה, כדי למנוע שינויים (לדוגמא אובדן של הגן של עניין) של נגיף רקומביננטי ולשמר ביטוי גבוה רמהשל 16 תאים נגועים גלולה 24 שעות לאחר מעצרו הוא ציין - התפשטות. בתאי שלב זה מכילים חלקיקים נגיפיים שלמים רגע לפני שהם ישוחררו (בניצנים) לכלי התקשורת. הסירו תקשורת וaliquots הקפאה של התא גלולה בחנקן נוזלי ולאחסן לזמן בלתי מוגבל. 7,16
3. ייצור חלבון ועיבוד במורד זרם
- הדבקה (r) תרבויות גדולות וYFP ניטור. השתמש 1 V, V 2 או aliquots BIIC קפוא להדביק תרביות תאים גדולות יותר לריצות ייצור (בדרך כלל 400 מ"ל ב2 צלוחיות L). לדבוק במשטר נמוך משרד הפנים (להתאים את עוצמת קול וירוס המשמש לזיהום התרבות נגועה כזה שמכפילה לפחות פעם אחת). הגדלת נפחי תרבות נגועים במידת צורך על ידי הכפלת מספר צלוחיות. אם חלבון סמן YFP הוא הווה, לסגת במרווחים מוגדרים 6 תאי 1x10, גלולה וlyse תאים ולעקוב אחר התפתחות של אות YFP עד רמה הוא הגיע indicating ייצור חלבון רקומביננטי מרבי. רמות YFP ניתן למדוד בקורא גם 96 סטנדרטי צלחת מסוגל להקליט אותות הקרינה (למשל טקאן SPECTRAFluor). קציר תאים בשלב זה. כדורי תא לאחסן ב -20 ° C (טווח קצר) או -80 מעלות צלזיוס (לטווח ארוך).
- תמוגה תא וחלוקה. Lyse תאים בשיטה האהובה עליך של בחירה, המותאמים לדרישות החלבון שלך (בהקפאת הפשרה, sonication, עיתונות צרפתית, ואחרים). Cytosol fractionate 5-7 וגרעינים ולבדוק את הימצאותם של חלבוני עניין שלך. לפתח פרוטוקולי טיהור המבוססים על התוצאות כדי לפשט טיהור חלבונים. לשקול יישום נהלי שרייה לחלץ החלבון שלך מהשבריר הגרעיני בתנאי KCl גבוהים אם החלבונים שלך מתגוררים בגרעין. 7,18
- טיהור חלבונים (בקנה מידה מיקרו, בקנה מידה גדול). שימו לב שלעתים קרובות כמויות קטנות (10 או 25 מ"ל) של תרבית תאים הן sufficient לקבלת כדורי תא לטיהור כמויות ניכרות של חלבוני העניין שלך בשל רמות הייצור בדרך כלל הגבוהות או גבוהות מאוד של חלבוני Heterologous במערכות הסלולריים baculovirus / חרק (לעתים קרובות 10-100 מ"ג של חלבון לכל תרבות ויותר לליטר). בשילוב עם מיקרו טיהור (multiwell צלחות, שיטות microtip, מערכת GE Healthcare ÄKTAmicro, אחרים) אפשר לקבל נתונים ביוכימיים ופעילות ולעתים קרובות גם כמות מספקת של החלבונים והמתחמים הרצויים להתגבשות תפוקה גבוהה nanoliter קנה מידה (HTX ). שקול להשתמש בטיהור זיקת מתכת (Clonetech Takara טאלון, שרפי Qiagen NiNTA מתכת chelator) ותג אוליגו-היסטידין (6-10 שאריות) ביחידות משנה חשופות של החלבון שלך מורכבות כדי להקל על טיהור, בשיתוף עם חילוף יונים וכרומטוגרפיה הדרת גודל בקטן כרכים באמצעות למשל ÄKTAmicro או מכונה טיהור דומה קטנה נפח (איור 4
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שיתוף ביטוי חזק של חלבוני Heterologous שהושגו על ידי מערכת MultiBac מוצג באיור 1D (בדיקות שנלקחו 48 שעות לאחר הדבקת תרבית תאי השעיה). להקות חלבון overexpressed הם בבירור להבחין בכל תמצית התא (SNP) וlysate פינה (SN). האיכות והכמות של חומר החלבון המיוצר היא לעתים קרובות מספיק כדי לאפשר קביעת מבנה של קומפלקסי חלבונים, כגון mitotic המחסום המורכב MCC שמוצגת באיור 1E. 17
איור 2 מציג את זרימת העבודה של ניסוי הרכבה גן על ידי recombineering מקביל בסיוע הרובוט (CT). פרוטוקולי הרכבה DNA חזקים היו תסריט לשגרת רובוטיקה להרכבת parallelized של בונה ביטוי multigene. צעדים רובוטיות אישיות שמוצג בSnap-יריות (איור 2 ג, אני - הרביעי). רכיבי ה-DNA שנאסף מופקים על ידי PCR ואיכות הנשלטת על ידידואר ג'לי (איור 2, משמאל); מבני multigene התאספו גם הם תוקף על ידי PCR עם ערכות שתוכננו במיוחד של פריימרים (איור 2, מימין) 14,15.
דור baculovirus רקומביננטי והגברה כדלקמן נהלי עבודה סטנדרטיים (מוצג סכמטי באיור 3 א). תמונות של תאים בתרבית בשכבה מוצגות (איור 3 ב, י והשני.) זיהום בוירוס הבא MultiBac.
עיבוד במורד זרם של קומפלקסי החלבונים רקומביננטיים ניתן מוקטן באמצעות רב גם צלחת או מבוסס microtip כרומטוגרפיה לטיהור זיקה ואחרי הרחקת גודל כרומטוגרפיה (ה-SEC) מהמתחמים על ידי השתלבות בעבודה של תזרים המערכות בקנה מידה קטנה, כגון ÄKTAmicro (איור 4 א). פרופיל נציג של רשות לניירות ערך ~ מורכבת גורם שעתוק אנושי kDa 700 מוצג. מדגם מטוהר באמצעותÄKTAmicro בקנה המידה קטנה הוא בדרך כלל מספיק לאפיון באמצעות יוכימיים וbiophysical כוללים מיקרוסקופ אלקטרונים (איור 4).
איור 1. פלטפורמה טכנולוגית לייצור מורכב MultiBac multiprotein. (א) הגנים של עניין משולבים לתוך הגנום baculoviral Multibac באמצעות Tn7 טרנספוזיציה בשיתוף עם הקרנה כחולה / לבן. אתר LoxP על עמוד השדרה הווירוס מאפשר תוספת של פונקציות נוספות, כגון חלבון סמן פלואורסצנטי כדי לעקוב אחר ביצועים של וירוס וייצור חלבון Heterologous. (ב) baculovirus מאמץ צורת מקל מוארכת ומאופיין במעטפה גמישה שיכול להגדיל כדי להתאים גנום גדול (> 130 KB) חוזר פעמיים תקועים DNA. הוספות גנים Heterologous גדולות בגנום הן נסבלות בy האריך את המעטפה. (ג) צלוחיות רגילות Erlenmeyer על פלטפורמות ייקרו מסלולית יכולות לשמש לגידול תרביות תאי חרקים בקנה מידה גדולות לייצור חלבון heterologues. (ד) מערכת MultiBac יעילות מייצרת חלבונים רקומביננטיים אשר לעתים נראה בבירור כבר בכולו תמצית תא (SNP). (ה) המבנה של מתחם מחסום mitotic היה הובהר על ידי השתברות קרן ה-X מגבישים שגודלו ממדגם מיוצר עם מערכת MultiBac. 17 לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 2. (אוטומטי) Recombineering טנדם (CT). (א) recombineering טנדם מנצל מערכים קטנים של מולקולות דנ"א סינטטיים הנקרא פלסמיד תורמי acceptors להרכבת multבונה ביטוי igene, לחלופין במצב רובוט בסיוע באמצעות טיפול נוזלי תחנת עבודה (מימין). (ב) העבודה TR מוצגת. SLIC עומד על רצף ושיבוט עצמאי קשירה, Cre מייצג את תורמי Cre-loxP היתוך השרשור וacceptors שלתוכו הגנים של עניין הוכנסו על ידי SLIC. ביטוי Multigene בונה נוצר על ידי הליך זה באמצעות recombineering SLIC וCre במקביל משולבים לאחר מכן לתוך הגנום baculovirus MultiBac ומשמש לביטוי בקנה מידה קטן וגדול בתרביות תאי חרקים שנדבקו על ידי נגיף רקומביננטי. (ג) תצלומי מסך של TR בסיוע הרובוט תהליך מוצג כולל הפרשה של ה-DNA תבנית ופריימרים (אני), הכנת PCR התגובות בmultiwell צלחות (השני), ההגברה PCR של DNAs (III) והכנת multigene בונה גדל בתרבית חיידקים על ידי תמוגה אלקליין בצלחות רב גם ( IV). (ד) המשמשים למוצרי ה-PCR TR הם דמיינו על ידינוing מערכת דואר ג'ל (משמאל). מבני multigene הושלמו אומתו על ידי PCR תגובות אנליטיים נטענים בדואר ג'ל (מימין). לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 3. דור MultiBac וירוס, הגברה, אחסון. (א) נוהל העבודה הרגיל (SOP) של פלטפורמת MultiBac בגרנובל EMBL מוצג בתצוגה סכמטית. רקומביננטי וירוס MultiBac מזוהה על ידי הקרנת כחול לבנה והכין מתרבויות חיידקים. transfection הראשונית מתרחשת על 6 גם צלחות שנזרעו עם monolayers של תאי חרקים (Sf21, SF9, Hi5, אחרים). וירוס מוגבר וחלבון המטרה המיוצר במלשיני Erlenmeyer. וירוס מאוחסן על ידי aliquots המקפיא של תאי חרקים נגועים (BIIC). תפרחת נרשמת ככלי אנליטי אםYFP (או חלבון פלואורסצנטי אחר) כבר משולב כסמן חלבון למשל אל הווה אתר loxP על הגנום baculoviral MultiBac. (ב) מול המצלמה של תאים נגועים בחרקי baculovirus MultiBac מוצגת. התאים מתרבים לעצור, להגדיל את שטחיו (י '). fusions הסלולרי הם נצפו (השני). וירוס הנץ את התאים הנגועים לתקשורת נאסף ומשמש להדביק תרביות תאים גדולות יותר לייצור חלבון מורכב (III, IV). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 4. ייצור החלבון מורכב ועיבוד במורד זרם. מדגם מורכב חלבון ניתן כבר מטוהר בנוחות מתרביות תאים ראשוניות בקנה מידה קטנה על ידי שימוש בשיטות זעירות טיהור כגון multiwall או microtip-טיהור מבוססת, לחלופין בשילוב עם מערכות כרומטוגרפיה קטנה בנפח (משמאל). לעתים קרובות התשואה של הטיהור כבר פועל אלה "האנליטיות" (באמצע) מספיקה לניתוח המבנה והתפקוד של המתחם מטוהר על ידי מגוון של אמצעים, כולל מיקרוסקופ אלקטרונים (מימין). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
וידאו Snap-יריות באיורים 2 ו -3 ממחישות את התהליך כולו מדור רובוט בסיוע מcDNA ביטוי multigene בונה את כל הדרך לזיהום של תרביות תאי חרקים לייצור חלבון. ריאגנטים חדשים (פלסמידים ווירוס) ופרוטוקולים חזקים פותחו כדי לאפשר לצינור להסתמך על כתיבת נהלים. כל הצנרת כבר מיושם כפלטפורמה טכנולוגית בEMBL בגרנובל. פלטפורמת MultiBac נצפה על ידי מדענים רבים מהאקדמיה והתעשייה העוסקים במחקר multiprotein. הגישה ההכשרה נתמכת על ידי תוכניות לגישה ייעודיות הממומנות על ידי הנציבות האירופית (P-Cube, BioSTRUCT-X).
הזמינות לכתיבת נהלים לביצוע ביטוי חלבון מורכב על ידי שימוש במערכת MultiBac הפך את הטכנולוגיה הזו בקלות נוחה גם למשתמשים שאינם מומחים. מבצע בסיוע הרובוט מאיץ ייצור מורכב multiprotein בparticתואר בלבד, כאשר מספר גדול מספיק של מתחמים, לדוגמא גרסאות ומוטציות של דגימה של עניין, צריך להיות שנוצר במקביל. עם זאת, פעולה ידנית בתפוקה בינונית נמוכה לנהנתה גם מאוד מזמינה לכתיבת נהלים. מניסיוננו, תהליכים שיכולים להיות תסריט בהצלחה לשגרת רובוטיקה צריכים להיות מעודנים ראשונה עם מאמץ משמעותי עד פרוטוקולים מספיק חזקים שהתקבלו בקנה אחד עם השימוש ברובוט. פרוטוקולים אלה מהווים את הבסיס לכתיבת הנהלים שלנו. 5,6,14,15 ואכן, יישום הפרוטוקולים החזקים אלה לרובוט להוביל לעלייה ביעילות רבה מאוד גם מפעולות ידניות במעבדה שלנו.
רבים חלבונים וקומפלקסי חלבונים כבר ושיופקו על ידי שימוש במערכת MultiBac שפיתחנו, וקרוב ל 500 מעבדות ברחבי העולם שהשיגו את חומרים כימיים. MultiBac יש catalyzed מחקר לא רק בביולוגיה מבנית, אלא גם ברבי othאה אזורים של מדעי חיים, הבודקים או לנצל את האינטראקציות בין חלבונים במכלולים גדולים. MultiBac שימש גם למטרות לייצר חלבון של עניין תרופתי ניכר בין חלקיקים דמויי נגיף, אשר עשוי להיות מועמדי חיסון שימושיים. 4 לאחרונה, MultiBac שימש גם כדי להעביר גנים לתוך תאי יונקים ותרביות תאים, אורגניזמים או אפילו כולו על ידי ריפוי גנטי. 4 אנו צופים כי גישות כגון אלה לידי ביטוי בתרומה זו תהיה להוכיח להיות שימושית לתחומים רבים של מחקר מעורב מכלולי multiprotein ויחסי גומלין מורכבים של מולקולות ביולוגיות המהוות את הבסיס של תהליכים תאיים בבריאות ובחוליים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
IB הוא ממציא על פטנטים ובקשות לפטנטים המפרטים חלקים של הטכנולוגיה שתוארה כאן.
Acknowledgments
אנו מודים לכריסטוף Bieniossek, סיימון Trowitzsch, דניאל פיצג'רלד, Yuichiro טאקאגי, כריסטיאן Schaffitzel, איבון Hunziker, טימותי ריצ'מונד וכל חברים בעבר ובהווה של המעבדה ברגר לעזרה ועצה. פלטפורמת MultiBac והפיתוח שלה היו ונתמכים בנדיבות על ידי סוכנויות מימון כולל שוויצרי הקרן הלאומית למדע (SNSF), סוכנות הידיעות הלאומית דה משוכלל ונדיר (ANR) והמרכז הלאומי de משוכלל ונדיר Scientifique (CNRS) והנציבות האירופית (EC) במסגרת תוכניות (FP) 6 ו -7. תמיכה בגישה חוצה גבולות מסופקת על ידי FP7 פרויקטי EC P-Cube (www.p-cube.eu) וBioStruct-X (www.biostruct-x.eu). המשרד הצרפתי למדע הוא הודה במיוחד לתמיכה בפלטפורמת MultiBac בEMBL דרך Investissement d'Avenir פרויקט FRISBI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bluo-Gal | Invitrogen | 15519-028 (1 g) | |
| Tetracycline | Euromedex | UT2965-B (25 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| Kanamycine | Euromedex | EU0420 (25 g) | 1,000X at 50 mg/ml |
| Gentamycine | SIGMA | G3632 (5 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| IPTG | Euromedex | EU0008-B (5 g) | 1,000X at 1M |
| Cre-recombinase | New England BioLabs | M0298 | |
| X-Treme GENE HP transfection reagent | Roche | 06 366 236 001 | |
| Hyclone SFM4 Insect | Thermo Scientific | SH 30913.02 | |
| 6-well plate Falcon | Dominique Dutscher | 353046 | |
| 2 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357507 | |
| 5 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357543 | |
| 10 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357551 | |
| 25 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357535 | |
| 50 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357550 | |
| 50 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352070 | |
| 15 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352096 | |
| 1.8 ml cryotube Nunc | Dominique Dutscher | 55005 | |
| 100 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211917 | |
| 250 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211918 | |
| 500 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211919 | |
| 2 L shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211921 | |
| Certomat Orbital Shaker + plateau | Sartorius | 4445110, 4445233 | |
| Liquid nitrogen tank dewar 35 L | Fisher Scientific | M76801 | |
| Biological Safety Cabinet Faster | Sodipro | FASV20000606 | |
| Optical Microscope | Zeiss | 451207 | |
| Sf21 Insect cells | |||
| Hi5 Insect cells | Invitrogen | B855-02 | |
| Tecan freedom EVO running Evoware plus | TECAN | ||
| 10 μl conductive tips (black), | TECAN | 10 612 516 | |
| 200 μl conductive tips (black) | TECAN | 10 612 510 | |
| disposable trough for reagents, 100 ml | TECAN | 10 613 049 | |
| twin.tec PCR plate 96, skirted | Eppendorf | 0030 128.648 | |
| 96 well V bottom, non sterile | BD falcon | 353263 | |
| 96 deepwell plate color natural, PP) | Fisher | M3752M | |
| PS microplate, 96 well flat bottom | Greiner | 655101 | |
| 96 deepwell plate | Thermo scientific | AB-0932 | |
| 24 well blocks RB | Qiagen | 19583 | |
| DpnI restriction enzyme | NEB | R0176L | 20 U/uL |
| NEBuffer 4 10X | NEB | B7004S | |
| 2X phusion mastermix HF | Finnzyme | ref F-531L | |
| 2X phusion mastermix GC | Finnzyme | ref F-532L | |
| DGLB 1.5X | homemade | 7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF | |
| High DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10496-016 | |
| Low DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10068-013 | |
| E-gel 48 1% agarose GP | Life Technologies | G8008-01 | |
| Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit | Macherey Nagel | 740 708.24 | |
| PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract | Macherey Nagel | 740 707.2 | |
| Gotaq green master mix | Promega | M7113 | |
| T4 DNA polymerase, LIC-qualified | Novagen | 70099-3 | |
| DTT 100 mM | homemade | ||
| Urea 2 M | homemade | ||
| EDTA 500 mM pH 8.0 | Homemade | ||
| LB broth (Miller) 500 g | Athena ES | 103 |
References
- Nie, Y., Viola, C., Bieniossek, C., Trowitzsch, S., Vijay-Achandran, L. S., Chaillet, M., Garzoni, F., Berger, I. Getting a Grip on Complexes. Curr. Genomics. 10 (8), 558-572 (2009).
- Robinson, C. V., Sali, A., Baumeister, W. The molecular sociology of the cell. Nature. 450 (7172), 973-982 (2007).
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).
- Bieniossek, C., Imasaki, T., Takagi, Y., Berger, I. MultiBac: expanding the research toolbox for multiprotein complexes. Trends Biochem. Sci. 37 (2), 49-57 (2012).
- Fitzgerald, D. J., Berger, P., Schaffitzel, C., Yamada, K., Richmond, T. J., Berger, I. Protein complex expression by using multigene baculoviral vectors. Nat. Methods. 3 (12), 1021-1032 (2006).
- Bieniossek, C., Richmond, T. J., Berger, I. MultiBac: multigene baculovirus-based eukaryotic protein complex production. Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 5, Unit 5.20 (2008).
- Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Nie, Y., Garzoni, F., Berger, I. New baculovirus expression tools for recombinant protein complex production. J. Struct. Biol. 172 (1), 45-54 (2010).
- Vijayachandran, L. S., Viola, C., Garzoni, F., Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Chaillet, M., Schaffitzel, C., Busso, D., Romier, C., Poterszman, A., Richmond, T. J., Berger, I. Robots, pipelines, polyproteins: enabling multiprotein expression in prokaryotic and eukaryotic cells. J. Struct. Biol. 175 (2), 198-208 (2011).
- Thomas, M. C., Chiang, C. M. The general transcription machinery and general cofactors. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 105-178 (2006).
- Klinge, S., Voigts-Hoffmann, F., Leibundgut, M., Ban, N. Atomic structures of the eukaryotic ribosome. Trends Biochem. Sci. 37 (5), 189-198 (2012).
- Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. One core, two shells: bacterial and eukaryotic ribosomes. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (6), 560-567 (2012).
- Cramer, P., Bushnell, D. A., Fu, J., Gnatt, A. L., Maier-Davis, B., Thompson, N. E., Burgess, R. R., Edwards, A. M., David, P. R., Kornberg, R. D. Architecture of RNA polymerase II and implications for the transcription mechanism. Science. 288 (5466), 640-649 (2000).
- Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nat. Biotechnol. 22 (12), 1583-1587 (2004).
- Bieniossek, C., Nie, Y., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Collinson, I., Romier, C., Berger, P., Richmond, T. J., Steinmetz, M. O., Berger, I. Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production. Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).
- Nie, Y., Bieniossek, C., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Steinmetz, M. O., Berger, I. ACEMBLing multigene expression constructs by recombineering. Nat. Protocols. , (2009).
- Wasilko, D. J., Lee, S. E., Stutzman-Engwall, K. J., Reitz, B. A., Emmons, T. L., Mathis, K. J., Bienkowski, M. J., Tomasselli, A. G., Fischer, H.D. titerless infected-cells preservation and scale-up (TIPS) method for large-scale production of NO-sensitive human soluble guanylate cyclase (sGC) from insect cells infected with recombinant baculovirus. Protein Expr. Purif. 65 (2), 122-132 (2009).
- Chao, W. C., Kulkarni, K., Zhang, Z., Kong, E. H., Barford, Structure of the mitotic checkpoint complex. Nature. 484 (7393), 208-213 (2012).
- Yamada, K., Frouws, T. D., Angst, B., Fitzgerald, D. J., DeLuca, C., Schimmele, K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Structure and mechanism of the chromatin remodelling factor ISW1a. Nature. 472 (7344), 448-453 (2011).
