Summary
प्रोटीन परिसरों प्रमुख सेलुलर कार्यों उत्प्रेरित. कई आवश्यक परिसरों की विस्तृत कार्यात्मक और संरचनात्मक लक्षण वर्णन पुनः संयोजक उत्पादन की आवश्यकता है. MultiBac विशेष रूप यूकेरियोटिक प्रोटीन और उनके परिसरों व्यक्त करने के लिए सिलवाया एक baculovirus / कीट सेल प्रणाली है. MultiBac एक खुला मंच का उपयोग, और इसकी उपयोगिता को अधिकतम करने के लिए विकसित मानक संचालन प्रक्रिया के रूप में लागू किया गया था.
Introduction
जैविक गतिविधि प्रोटीन और सेलुलर कार्यों को उत्प्रेरित करने के लिए संगीत कार्यक्रम में कार्य करने वाले अन्य biomolecules की विधानसभाओं द्वारा नियंत्रित किया जाता है. उल्लेखनीय उदाहरण दूत शाही सेना में डीएनए में निहित वंशानुगत जानकारी transcribes कि मशीनरी शामिल हैं. मनुष्यों में, 100 से ज्यादा प्रोटीन होते हैं आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय और ऐसे TFIID, TFIIH और दूसरों के रूप में सामान्य प्रतिलेखन कारक है. 9 अन्य उदाहरणों सहित 10 और अधिक यूनिटों के साथ बड़े multiprotein परिसरों के गठन, जीन टाइप करने के लिए एक परिभाषित और विनियमित प्रक्रिया में एक साथ आते हैं राइबोसोम, प्रोटीन संश्लेषण, या eukaryotes में परमाणु लिफाफा के माध्यम से biomolecules के चक्कर के लिए जिम्मेदार है जो परमाणु ताकना जटिल catalyzes कि कई प्रोटीन और आरएनए अणुओं से मिलकर. सेल में अनिवार्य रूप से सभी multicomponent मशीनों की एक विस्तृत वास्तु और जैव रासायनिक विच्छेदन उनके कार्य को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. प्रोकार्योटिक और eukar की संरचना व्याख्याyotic राइबोसोम, उदाहरण के लिए, इन macromolecular मशीनों सेल में अपने निर्दिष्ट कार्यों को पूरा कैसे में अभूतपूर्व अंतर्दृष्टि उपज बानगी घटनाओं का गठन किया. 10,11
राइबोसोम ऊपर सेलुलर द्रव्यमान का 30% करने के लिए राइबोसोम के होते हैं कि इस तथ्य के कारण संवर्धित कोशिकाओं से अंतर्जात सामग्री, सफ़ाई द्वारा विस्तृत अध्ययन के लिए पर्याप्त गुणवत्ता और मात्रा में प्राप्त किया जा सकता है. शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय अन्य आवश्यक परिसरों की भारी बहुमत में फिर भी मौजूद हैं, जो पहले से ही खमीर संस्कृति के कम परिमाण के आदेश से प्रचुर मात्रा में है, और कई हजार लीटर है प्रतिलेखन के लिए केंद्रीय इस आवश्यक परिसर की एक विस्तृत परमाणु दृश्य प्राप्त करने के लिए संसाधित किया जा सकता था. 12 इस प्रकार देशी कोशिकाओं, और में बहुत कम मात्रा में देशी स्रोत सामग्री से पर्याप्त रूप से शुद्ध नहीं किया जा सकता. विस्तृत संरचनात्मक और कार्यात्मक विश्लेषण के लिए सुलभ ऐसे परिसरों रेंडर करने के लिए पुनः संयोजक ते का उपयोग करके heterologous उत्पादन की आवश्यकताchniques.
पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन को जीवन विज्ञान अनुसंधान पर एक बड़ा प्रभाव था. कई प्रोटीन recombinantly उत्पादन किया, और उनकी संरचना और समारोह के उच्च संकल्प पर विच्छेदित किए गए. स्ट्रक्चरल जीनोमिक्स कार्यक्रमों उच्च throughput (हिंदुस्तान टाइम्स) मोड में संपूर्ण जीवों के जीन उत्पाद प्रदर्शनों की सूची को संबोधित करने के लिए कई जीवों के जीनोम की व्याख्या का लाभ ले लिया है. प्रोटीन संरचनाओं के हजारों इस प्रकार निर्धारित किया गया है. तिथि करने के लिए, पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन के लिए सबसे prolifically इस्तेमाल किया प्रणाली ई. किया गया है कोली, और कई अभिव्यक्ति सिस्टम इस मेजबानी में heterologous उत्पादन के लिए पिछले कुछ वर्षों में विकसित और परिष्कृत किया गया है. ई. में प्रोटीन के उत्पादन को सक्षम करने के functionalities के ढेर सारे शरण प्लास्मिडों कोली वाणिज्यिक प्रदाताओं की पूरी सूची भरें.
हालांकि, ई. कोली कई यूकेरियोटिक प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए यह अनुपयुक्त है जो कुछ सीमाएं हैं और पी मेंकई यूनिटों के साथ जोड़ प्रोटीन परिसरों. इसलिए, यूकेरियोटिक मेजबान में प्रोटीन के उत्पादन को तेजी से हाल के वर्षों में चुनाव का तरीका बन गया है. यूकेरियोटिक प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए एक विशेष रूप से अच्छी तरह से अनुकूल प्रणाली प्रयोगशाला में खेती कीट सेल संस्कृतियों को संक्रमित करने heterologous जीन ले एक पुनः संयोजक baculovirus पर निर्भर करता है कि baculovirus अभिव्यक्ति वेक्टर प्रणाली (BEVs) है. MultiBac प्रणाली विशेष रूप से कई यूनिटों (चित्रा 1) के साथ यूकेरियोटिक प्रोटीन परिसरों के उत्पादन के लिए बनाया गया है, जो एक और अधिक हाल ही में विकसित BEVs है. MultiBac पहली बार 2004 में शुरू की गई थी. 13 अपनी शुरुआत के बाद से, MultiBac लगातार परिष्कृत किया गया है और, हैंडलिंग सरल बनाने के लक्ष्य प्रोटीन की गुणवत्ता में सुधार और आम तौर पर कुशल मानक संचालन प्रक्रिया (रियायतों) डिजाइन द्वारा गैर विशेषज्ञ उपयोगकर्ताओं के लिए व्यवस्था सुलभ बनाने के लिए धारा खड़े हैं. 4 MultiBac एसी में, दुनिया भर में व्यापक कई प्रयोगशालाओं में लागू किया गया हैademia और उद्योग. ग्रेनोबल में EMBL में, अंतरराष्ट्रीय पहुंच कार्यक्रमों उनके अनुसंधान को आगे बढ़ाने के लिए इस उत्पादन प्रणाली का उपयोग करने के लिए कामना की है जो वैज्ञानिकों के लिए MultiBac मंच पर विशेषज्ञ प्रशिक्षण प्रदान करने के लिए यूरोपीय आयोग द्वारा जगह में डाल रहे थे. वे EMBL ग्रेनोबल में MultiBac सुविधा पर चल रही हैं के रूप में अब तक सुलभ नहीं थे कि कई प्रोटीन परिसरों की संरचना और समारोह MultiBac के साथ उत्पादन के नमूनों का उपयोग करके स्पष्ट किया गया था. 4 बाद में, MultiBac उत्पादन के लिए आवश्यक कदम प्रोटोकॉल में संक्षेप हैं.
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Protocol
1. बहुजीनीय अभिव्यक्ति constructs बनाने के लिए मिलकर Recombineering (टीआर)
- सह अभिव्यक्ति रणनीति योजना. दाताओं और स्वीकार करने में अपनी रुचि के जीन डालने के लिए डिजाइन दृष्टिकोण. अपने परिसर के संभावित शारीरिक submodules विशिष्ट स्वीकार करने और दाताओं पर एक साथ समूहीकृत किया जाना चाहिए. व्यक्तिगत दाता और स्वीकर्ता प्लास्मिडों पर अभिव्यक्ति कैसेट गठबंधन करने BstXI जोड़े 7,8 सिलिको में सभी प्रासंगिक निर्माणों बनाएँ और प्रायोगिक कार्य के लिए आगे बढ़ने से पहले अच्छी तरह से रणनीति को मान्य - घर वापस आना endonuclease (एचई) से मिलकर गुणा मॉड्यूल का उपयोग करें.. उदाहरण के लिए, ब्याज की जीन महामहिम या अन्य प्रतिबंध साइटों और सही खुला पढ़ने फ्रेम (ORFs) की उपस्थिति मान्य किया जाना चाहिए शामिल करने के लिए नहीं की जाँच की जानी चाहिए. प्रोटीन के उत्पादन स्तर के साथ ही किसी भी exi को हटाने में सुधार करने के लिए कीट सेल कोडोन उपयोग और mRNA माध्यमिक संरचना के लिए अनुकूलित कृत्रिम जीन आदेश देने पर विचारवह ब्याज की जीन से साइटों डंक. लचीला या उजागर एन या अपनी पसंद के प्रोटीन की सी टर्मिनी बारे में साहित्य से डेटा पर आधारित शुद्धि टैग रखने पर विचार करें. व्यक्तिगत प्रोटीन के रिश्तेदार मात्रा परिसर में होने वाले stoichiometry मुद्दों को नियंत्रित करने की जरूरत है अपने परिसर में कई प्रोटीन का उत्पादन करने का उद्देश्य है कि polyprotein रणनीतियों को लागू करने पर विचार करें. "कैसे 'दस्तावेज़ (इलेक्ट्रॉनिक प्रयोगशाला पुस्तक की सिफारिश की है) 4 विस्तृत तैयार युक्त परियोजना के सभी अनुमान प्रयोगात्मक कदम पूरी बहुजीनीय निर्माण (ओं) के लिए अग्रणी. बर्जर समूह मुख पृष्ठ (से डाउनलोड किया जा सकता है, जो Cre पर ACEMBLER सॉफ्टवेयर का उपयोग करके उदाहरण के लिए Cre पर LoxP जुड़े plasmids के इलेक्ट्रॉनिक फ़ाइलें बनाएँ www.embl.fr/multibac/ multiexpression_technologies / रचनात्मक acembler ).
- चयनित दाताओं में अपने हित के जीन डालें औरप्रतिबंध एंजाइमों और ligase का उपयोग करके, या, वैकल्पिक रूप से, प्रकाशित प्रोटोकॉल का पालन बंधाव स्वतंत्र विधियों का उपयोग कर स्वीकारकर्ताओं. 5,6,14 आप एक तरल से निपटने वर्क स्टेशन के लिए उपयोग किया है और यदि आप उत्पन्न होना निर्माणों की एक बड़ी संख्या (योजना है मिश्रित दृष्टिकोण के लिए उदाहरण के लिए) एक तरल से निपटने काम स्टेशन उपलब्ध नहीं है, तो बर्जर समूह (चित्रा 2). 14,15 द्वारा विकसित और कार्यान्वित रोबोटिक्स स्क्रिप्ट का उपयोग करने पर विचार करें, microtitre प्लेट का उपयोग आपरेशन मैनुअल फैशन की तरह एक हिंदुस्तान टाइम्स में जीन की प्रविष्टि की अनुमति देता है.
- व्यक्त सब यूनिटों के stoichiometry पर नियंत्रण की आवश्यकता द्वारा लगाए गए प्रतिबन्ध अमल में लाना सकता है. एक प्रोटीन परिसर के व्यक्ति सब यूनिटों के stoichiometrically असंतुलित अभिव्यक्ति के स्तर के मामले में, एस के अंतराल पर एक बड़े ORFs में अपने परिसर के कई यूनिटों और एक विशिष्ट प्रोटीज (उदाहरण के लिए तम्बाकू खोदना वायरस एनआईए प्रोटीज) एकत्रित होना करने polyprotein रणनीतियों को लागू करने पर विचारpecific प्रोटियोलिटिक साइटों. 4,8 पर विचार सह व्यक्त आप कई यूनिटों के साथ एक बहुत बड़ी जटिल है और व्यापक रूप से व्यक्ति सब यूनिटों की आणविक भार लेकर अगर एक अभिव्यक्ति कैसेट के साथ एक या कई polyproteins. गौर कीजिए सह व्यक्त कि प्रोटीन कम उपज उत्पादन की विशेषता है अगर एक polyprotein में या कई समान अभिव्यक्ति कैसेट के रूप में एक ही प्रोटीन के लिए एन्कोडिंग कई जीनों. 4,13
- प्रतिबंध मानचित्रण (वैकल्पिक उच्च throughput में) और अनुक्रमण द्वारा क्लोन सभी दाता और स्वीकर्ता निर्माणों का सत्यापन करें. चुनाव के बहुजीनीय अभिव्यक्ति निर्माणों उत्पन्न करने के लिए Cre पर LoxP पुनर्संयोजन द्वारा दाता स्वीकर्ता संयोजन फ्यूज करने के लिए आगे बढ़ें. प्रतिबंध मानचित्रण द्वारा अपनाने-दाता संलयन प्लास्मिडों शुद्ध मान्य, Cre पर ACEMBLER या एक संदर्भ के रूप में इसी तरह के कार्यक्रमों के द्वारा बनाई गई इलेक्ट्रॉनिक दृश्यों का उपयोग करें.
- -20 डिग्री सेल्सियस पर शुद्ध और पुष्टि दाताओं, स्वीकार करने और दाता स्वीकर्ता fusions के स्टोर या -80 डिग्री सेल्सियस पुरालेख plasmids और बाद में उपयोग के लिए ध्यान से उनके दृश्यों (माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल, Filemaker, अन्य).
2. समग्र बहुजीनीय baculovirus जनरेशन, प्रवर्धन और संग्रहण
- वायरल जीनोम और Tn7 स्थानांतरण के लिए आवश्यक functionalities के शरण DH10 कोशिकाओं में बदलने से बहुजीनीय हस्तांतरण वैक्टर MultiBac baculoviral जीनोम एकीकृत. Multibac baculoviral जीनोम Tn7 एकीकरण पूर्ववर्ती विवो Cre प्रतिक्रिया में एक ने अपनी ही LoxP साइट में ब्याज की विशेष जीनों (YFP मार्कर, संरक्षक, आदि) (Tn7 लगाव साइट के लिए बाहर का जीनोम में इंजीनियर) के साथ पहले से लोड किया जा सकता है कि ध्यान दें. 13 Tn7 स्थानांतरण के बाद, ब्याज की जीन युक्त समग्र baculovirus साथ कोशिकाओं सफेद / नीले स्क्रीनिंग (β-galactosidase की α-पूरक के नुकसान में सफल Tn7 स्थानांतरण परिणामों से चुने गए हैं, इसलिए सही Tn7 स्थानांतरण के साथ कालोनियों एक चयनात्मक पर सफेद रहनाgar एक्स लड़की युक्त प्लेटें) और जीनोम क्षारीय सेल और इथेनॉल / isopropanol तेज़ी से तैयार किया जाता है. 5,6
- अभिकर्मक और प्रारंभिक वायरस उत्पादन. बाँझ हुड में जगह 6 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट. लॉग चरण Sf21 कीट सेल संस्कृति से, के रूप में वर्णित संस्कृति मीडिया में मिश्रित शुद्ध baculoviral जीनोम और एक अभिकर्मक अभिकर्मक जोड़कर कुओं और transfect में कोशिकाओं की aliquots बाहर बीज. मीडिया को हटाने से 48-60 घंटे के बाद 6 हार्वेस्ट प्रारंभिक वायरस ( उच्च गुणवत्ता, कम अनुमापांक वायरस वी 0, अच्छी तरह से प्रति आम तौर पर 3 मिलीलीटर). एक अतिरिक्त 2-3 दिनों के बाद प्रोटीन के उत्पादन के लिए नए सिरे से मीडिया, और परीक्षण (और, एक YFP मार्कर मौजूद है, रोशनी के लिए) अनुपूरक. 6,7
- वायरस के प्रवर्धन, कम MOI के आहार. छोटे (100-250 मिलीलीटर) Erlenmeyer हिलनेवाला बोतल उत्तेजित में लॉग चरण में कोशिकाओं के 25-50 मिलीलीटर (एमएल प्रति सेल घनत्व <1x10 6 कोशिकाओं) को संक्रमित करने के लिए वि 0 वायरस का प्रयोग करेंकक्षीय मंच शेकर्स पर (चित्रा 3). कक्षों की गणना और कोशिकाओं (प्रसार गिरफ्तारी) दोहरीकरण रोक जब तक हर 24 घंटा विभाजित. एक (सेल प्रति वायरस कणों का संक्रमण यानी नंबर की बहुलता) MOI कम आहार का पालन करें: सेल एक बार (MOI <1), अन्यथा वी 0 की एक छोटी मात्रा के साथ प्रयोग दोहराने (कम से कम) डबल चाहिए गयी. आम तौर पर, वी 0 के 3 मिलीलीटर 0.5x10 6 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर Sf21 कीट कोशिकाओं के 25 मिलीलीटर संक्रमित करने के लिए उपयोग किया जाता है. यह हानिकारक रोकने के लिए आवश्यक है ब्याज की heterologous जीन की हानि हो सकती है कि वायरस के अत्यधिक प्रवर्धन और ऑटो विलोपन. कोशिकाओं pelleting और वायरस युक्त मीडिया को हटाने से 48-60 घंटे के बाद फसल वी 1 वायरस (25-50 मिलीग्राम). 6, 1x10 6 कोशिकाओं हर 12 या 24 घंटे हटाने pelleting और प्रोटीन के उत्पादन और मार्कर प्रोटीन (YFP) संकेत मान्य. द्वारा YFP और प्रोटीन के उत्पादन के लिए नए सिरे से मीडिया और परीक्षण के साथ पूरक, (के लिए वायरस बढ़ानावी 2) आगे बड़ा अभिव्यक्ति संस्करणों के ऊपर कम MOI के आहार (कोशिकाओं वी 1 से संक्रमण के बाद कम से कम एक बार डबल चाहिए) का सम्मान वी 1 वायरस के साथ 2 एल हिलनेवाला बोतल में 400 मिलीलीटर सेल तक संक्रमण से करने के उद्देश्य से कर रहे हैं. इसरो अब कोई अपने हित के जीन युक्त दोषपूर्ण वायरस के संचय से बचने के लिए प्रवर्धन के दौरान प्रोटीन के उत्पादन और मार्कर प्रोटीन संकेत परीक्षा. प्रत्येक amplifications पर जमते 5-7 उपयोग सेल छर्रों ब्याज की व्यक्त प्रोटीन परिसर के लिए शुद्धि प्रोटोकॉल स्थापित करने के लिए पहले ही कदम.
- उत्पादन वायरस की BIIC भंडारण. हम दृढ़ता से उपयोग करके उत्पादन वायरस के रूप में वी 2 वायरस स्टोर करने के लिए सलाह देते हैं BIIC (बी aculovirus-मैं मैं ग Ells nsect nfected) पुनः संयोजक वायरस के संशोधनों (ब्याज की जीन का उदाहरण हानि) को रोकने के लिए और उच्च अभिव्यक्ति की रक्षा करने, विधि स्तरएस प्रसार गिरफ्तारी के बाद 24 घंटे में मनाया जाता है 16 गोली संक्रमित कोशिकाओं -. वे मीडिया में (नवोदित द्वारा) जारी किया जाएगा बस से पहले इस स्तर की कोशिकाओं को पूरी वायरल कण होते हैं. तरल नाइट्रोजन में मीडिया और सेल गोली का फ्रीज aliquots निकालें और अनिश्चित काल के लिए दुकान. 7,16
3. प्रोटीन उत्पादन और डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण
- बड़े (नि.) संस्कृतियों और निगरानी YFP से संक्रमण. उत्पादन रन (एल 2 बोतल में आम तौर पर 400 मिलीलीटर) के लिए बड़ा सेल संस्कृतियों को संक्रमित करने के लिए वी 1, वी 2 या फ्रोजन BIIC aliquots का प्रयोग करें. कम MOI के आहार (जैसे कि संक्रमित संस्कृति में कम से कम एक बार डबल्स संक्रमण के लिए इस्तेमाल वायरस मात्रा समायोजित) का पालन करें. बोतल की संख्या से गुणा करके अगर जरूरत संक्रमित संस्कृति संस्करणों बढ़ा करें. YFP मार्कर प्रोटीन मौजूद है,, परिभाषित अंतराल 1x10 6 कोशिकाओं को वापस लेने गोली और कोशिकाओं lyse और एक पठार इंडस्ट्रीज़ तक पहुँच जाता है YFP संकेत के विकास की निगरानीअधिकतम पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन icating. YFP स्तरों प्रतिदीप्ति संकेत (जैसे Tecan SPECTRAFluor) रिकॉर्डिंग में सक्षम एक मानक 96 अच्छी तरह से थाली पाठक में मापा जा सकता है. इस स्तर पर हार्वेस्ट कोशिकाओं. -20 डिग्री सेल्सियस (अल्पावधि) या -80 पर स्टोर सेल छर्रों डिग्री सेल्सियस (दीर्घावधि).
- सेल और विभाजन. अपने प्रोटीन की आवश्यकताओं (फ्रीज पिघलना, sonication, फ्रेंच प्रेस, अन्य) के आधार पर अपनी पसंद के पसंदीदा विधि के द्वारा कोशिकाओं lyse. 5-7 fractionate cytosol और अपने हित के प्रोटीन की उपस्थिति के लिए नाभिक और परीक्षण. प्रोटीन शुद्धि को सरल करने के परिणामों के आधार पर शुद्धि प्रोटोकॉल का विकास करना. अपने प्रोटीन नाभिक में रहते हैं उच्च KCl परिस्थितियों में परमाणु अंश से अपने प्रोटीन निकालने के लिए भिगोने प्रक्रियाओं को लागू करने पर विचार करें. 7,18
- प्रोटीन शुद्धि (सूक्ष्म पैमाने पर, बड़े पैमाने पर). सेल संस्कृति की अक्सर छोटी मात्रा में (10 या 25 मिलीलीटर) र रहे हैं कि नोटकारण baculovirus / कीट सेल प्रणाली (एल संस्कृति और अधिक प्रति प्रोटीन की अक्सर 10-100 मिलीग्राम) में heterologous प्रोटीन की आम तौर पर उच्च या बहुत अधिक उत्पादन के स्तर को अपने हित के प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा में शुद्ध के लिए सेल छर्रों प्राप्त करने के लिए fficient. सूक्ष्म शोधन (multiwell प्लेटों, microtip तरीकों, जीई हेल्थकेयर ÄKTAmicro प्रणाली, अन्य) के साथ संयोजन के रूप में यह जैव रासायनिक और गतिविधि डेटा और अक्सर भी nanoliter पैमाने पर उच्च throughput क्रिस्टलीकरण के लिए वांछित प्रोटीन और परिसरों के लिए पर्याप्त राशि (HTX प्राप्त करने के लिए संभव है ). छोटे में आयन एक्सचेंज और आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी के साथ संयोजन के रूप में, शोधन की सुविधा के लिए परिसर में अपने प्रोटीन के संपर्क में सब यूनिटों पर धातु संबंध शुद्धीकरण (Clonetech Takara के नाखून, क्विएज़न NiNTA धातु chelator रेजिन) और एक oligo हिस्टडीन (6-10 अवशेषों) टैग का उपयोग पर विचार उदाहरण के लिए ÄKTAmicro या इसी तरह की एक छोटी मात्रा शुद्धि मशीन (चित्रा 4 का उपयोग कर संस्करणों
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Representative Results
MultiBac प्रणाली द्वारा प्राप्त heterologous प्रोटीन की मजबूत सह अभिव्यक्ति चित्रा 1 माह (एक निलंबन सेल संस्कृति से संक्रमण के बाद 48 घंटे उठाए जांच) में दिखाया गया है. overexpressed प्रोटीन बैंड के पूरे सेल निकालने (एसएनपी) और मंजूरी दे दी lysate (एस एन) में स्पष्ट रूप से प्रत्यक्ष कर रहे हैं. उत्पादित प्रोटीन सामग्री की गुणवत्ता और मात्रा अक्सर चित्रा 1e में दिखाया ऐसी mitotic चौकी परिसर में एमसीसी के रूप में प्रोटीन परिसरों की संरचना निर्धारण को सक्षम करने के लिए पर्याप्त है. 17
चित्रा 2 रोबोट की मदद से मिलकर recombineering (टीआर) द्वारा एक जीन विधानसभा प्रयोग के काम के प्रवाह को प्रदर्शित करता है. मजबूत डीएनए विधानसभा प्रोटोकॉल बहुजीनीय अभिव्यक्ति निर्माणों की parallelized विधानसभा के लिए रोबोटिक्स दिनचर्या में पटकथा थे. व्यक्तिगत रोबोट कदम स्नैप शॉट (- चतुर्थ चित्रा 2c, मैं) में दिखाया गया है. इकट्ठे करने के लिए डीएनए घटकों पीसीआर द्वारा उत्पन्न और गुणवत्ता द्वारा नियंत्रित कर रहे हैंई जैल (चित्रा 2, बाएं); इकट्ठे बहुजीनीय निर्माणों वैसे ही प्राइमरों का विशेष रूप से डिजाइन सेट (चित्रा 2, सही) के साथ पीसीआर की पुष्टि करते हैं 14,15.
संयोजक baculovirus पीढ़ी और प्रवर्धन मानक संचालन प्रक्रिया (रेखाचित्र के रूप में चित्रा 3a में प्रदर्शित) इस प्रकार है. एक monolayer में संवर्धित कोशिकाओं की फोटो एक MultiBac वायरस से (चित्रा 3b, मैं और द्वितीय.) निम्नलिखित संक्रमण दिखाए जाते हैं.
पुनः संयोजक प्रोटीन परिसरों की डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण जैसे काम के प्रवाह छोटे पैमाने पर सिस्टम में एकीकृत करके परिसरों का आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) के बाद आत्मीयता शुद्धि के लिए बहु - अच्छी तरह से थाली या microtip आधारित क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके छोटी किया जा सकता है ÄKTAmicro (चित्रा -4 ए). एक ~ 700 केडीए मानव प्रतिलेखन कारक परिसर के एक प्रतिनिधि एसईसी प्रोफ़ाइल दिखाया गया है. नमूना का उपयोग करके शुद्धछोटे पैमाने में ÄKTAmicro इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (चित्रा 4b) सहित जैव रासायनिक और biophysical साधन के द्वारा लक्षण वर्णन के लिए आम तौर पर पर्याप्त है.
चित्रा 1. Multiprotein जटिल उत्पादन के लिए MultiBac मंच प्रौद्योगिकी. (क) ब्याज की जीन नीले / सफेद स्क्रीनिंग के साथ संयोजन के रूप में Tn7 स्थानांतरण का उपयोग करके Multibac baculoviral जीनोम में एकीकृत कर रहे हैं. वायरस रीढ़ की हड्डी पर एक LoxP साइट में इस तरह के एक फ्लोरोसेंट मार्कर प्रोटीन के रूप में आगे functionalities के अलावा वायरस प्रदर्शन और heterologous प्रोटीन के उत्पादन पर नजर रखने के लिए अनुमति देता है. (ख) baculovirus एक लम्बी छड़ी आकार को गोद ले और समायोजित करने के लिए वृद्धि कर सकते हैं कि एक लचीला लिफाफा की विशेषता है बड़े (> 130 केबी) परिपत्र डबल असहाय डीएनए जीनोम. जीनोम में बड़े heterologous जीन सम्मिलन ख सहन कर रहे हैंवाई लिफाफा elongating. (ग) कक्षीय हिलनेवाला प्लेटफार्मों पर मानक Erlenmeyer बोतल heterologues प्रोटीन के उत्पादन के लिए बड़े पैमाने पर कीट सेल संस्कृतियों उगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. (घ) MultiBac प्रणाली कुशलतापूर्वक में पहले से ही अक्सर स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं, जो पुनः संयोजक प्रोटीन का उत्पादन पूरे सेल निकालने (एसएनपी). (ई) mitotic चौकी परिसर की संरचना MultiBac प्रणाली. 17 के साथ उत्पादन नमूना से बढ़ी क्रिस्टल से एक्स - रे विवर्तन द्वारा स्पष्ट किया गया था बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 2. (ऑटोमेटेड) मिलकर Recombineering (टीआर). (क) मिलकर recombineering mult संयोजन के लिए दाताओं और स्वीकारकर्ताओं सिंथेटिक प्लाज्मिड डीएनए अणु के छोटे सरणियों कहा जाता है का इस्तेमालigene अभिव्यक्ति निर्माणों, वैकल्पिक रोबोट की मदद से मोड में एक तरल से निपटने काम स्टेशन (दाएं) का उपयोग कर. (ख) टी.आर. कार्यप्रवाह दिखाया गया है. SLIC के अनुक्रम और बंधाव स्वतंत्र क्लोनिंग के लिए खड़ा है, Cre ब्याज की जीन SLIC के द्वारा डाला गया है जो में Cre-LoxP संलयन concatenating दाताओं और स्वीकार करने के लिए खड़ा है. बहुजीनीय अभिव्यक्ति तो MultiBac baculovirus जीनोम में एकीकृत और पुनः संयोजक वायरस से संक्रमित कीट सेल संस्कृतियों में छोटे और बड़े पैमाने पर अभिव्यक्ति के लिए उपयोग किया जाता है मिलकर में SLIC और रचनात्मक उपयोग करते हुए इस recombineering प्रक्रिया द्वारा उत्पन्न constructs. रोबोट की मदद से टीआर (ग) फोटो प्रक्रिया (बहु अच्छी तरह प्लेटें में क्षारीय सेल द्वारा जीवाणु संस्कृति में विकसित constructs टेम्पलेट डीएनए और प्राइमरों (आई), multiwell प्लेट (द्वितीय), पीसीआर DNAs (तृतीय) के प्रवर्धन और बहुजीनीय की तैयारी में पीसीआर प्रतिक्रियाओं की तैयारी के प्रावधान सहित दिखाए जाते हैं चतुर्थ). (घ) टी.आर. के लिए इस्तेमाल पीसीआर उत्पादों हमारे द्वारा कल्पना कर रहे हैंई जेल प्रणाली (बाएं) आईएनजी. पूरे किए बहुजीनीय निर्माणों एक ई जेल (दाएं) पर लोड विश्लेषणात्मक पीसीआर प्रतिक्रियाओं की पुष्टि करते हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 3. MultiBac वायरस पीढ़ी, प्रवर्धन, भंडारण. (क) EMBL ग्रेनोबल में MultiBac मंच के मानक संचालन प्रक्रिया (एसओपी) एक योजनाबद्ध दृश्य में दिखाया गया है. संयोजक MultiBac वायरस नीला सफेद स्क्रीनिंग द्वारा की पहचान की है और बैक्टीरियल संस्कृतियों से तैयार किया जाता है. प्रारंभिक अभिकर्मक कीट कोशिकाओं के monolayers (Sf21, Sf9, हाई 5, अन्य) के साथ वरीयता प्राप्त 6 अच्छी तरह से प्लेटों पर जगह लेता है. वायरस Erlenmeyer शेकर्स में परिलक्षित और लक्ष्य प्रोटीन का उत्पादन किया है. वायरस संक्रमित कीट कोशिकाओं की ठंड aliquots (BIIC) द्वारा संग्रहित है. पुष्पन एक विश्लेषणात्मक उपकरण के रूप में अगर दर्ज की गई हैYFP (या किसी अन्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन) MultiBac baculoviral जीनोम पर loxP साइट वर्तमान में उदाहरण के लिए एक मार्कर प्रोटीन के रूप में एकीकृत किया गया है. (ख) MultiBac baculovirus से संक्रमित कीट कोशिकाओं की फोटो दिखाई जाती हैं. कोशिकाओं के प्रसार को रोकने, आकार (मैं) में वृद्धि हुई है. सेल fusions (द्वितीय) मनाया जाता है. मीडिया में संक्रमित कोशिकाओं को अंकुरित वायरस एकत्र और प्रोटीन जटिल उत्पादन (तृतीय, चतुर्थ) के लिए बड़ा सेल संस्कृतियों को संक्रमित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
4 चित्रा. प्रोटीन जटिल उत्पादन और डाउन स्ट्रीम प्रसंस्करण. प्रोटीन जटिल नमूना पहले ही आसानी से ऐसी multiwall या के रूप में छोटी शुद्धि विधियों के उपयोग के द्वारा छोटे पैमाने पर प्रारंभिक सेल संस्कृतियों से शुद्ध किया जा सकता microtip-वैकल्पिक रूप से कम संख्या में सिस्टम क्रोमैटोग्राफी (बाएं) के साथ संयोजन के रूप में आधारित शुद्धि,. अक्सर पहले से ही इन "विश्लेषणात्मक" शुद्धि रन (मध्य) की उपज इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (दाएं) सहित मतलब है की एक किस्म के द्वारा शुद्ध परिसर की संरचना और समारोह का विश्लेषण करने के लिए पर्याप्त है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
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Discussion
आंकड़े 2 और 3 में वीडियो तस्वीर शॉट्स बहुजीनीय अभिव्यक्ति की सीडीएनए से रोबोट की मदद से पीढ़ी से पूरी प्रक्रिया को वर्णन प्रोटीन के उत्पादन के लिए कीट सेल संस्कृतियों के संक्रमण के लिए सभी तरह निर्माण करती है. नई अभिकर्मकों (plasmids और वायरस) और मजबूत प्रोटोकॉल रियायतों पर निर्भर एक पाइपलाइन सक्षम करने के लिए विकसित किया गया है. पूरे पाइपलाइन ग्रेनोबल में EMBL में एक मंच प्रौद्योगिकी के रूप में लागू किया गया है. MultiBac मंच multiprotein अनुसंधान में लगे हुए हैं जो शिक्षाविदों और उद्योग से कई वैज्ञानिकों द्वारा देखा गया है. प्रशिक्षण का उपयोग यूरोपीय आयोग (पी घन, BioSTRUCT एक्स) द्वारा वित्त पोषित समर्पित पहुँच कार्यक्रमों के द्वारा समर्थित है.
MultiBac प्रणाली का उपयोग करके प्रोटीन जटिल अभिव्यक्ति बाहर ले जाने के लिए रियायतों की उपलब्धता गैर विशेषज्ञ उपयोगकर्ताओं के लिए भी आसानी से उत्तरदायी इस प्रौद्योगिकी प्रदान की गई है. रोबोट की मदद से आपरेशन खास में multiprotein जटिल उत्पादन acceleratesular जब परिसरों की एक पर्याप्त बड़ी संख्या में ब्याज का एक नमूना के उदाहरण वेरिएंट और म्यूटेंट के लिए, समानांतर में उत्पन्न करने की आवश्यकता है. रियायतों की उपलब्धता से हालांकि, कम से मध्यम throughput में मैनुअल आपरेशन भी बहुत फायदा होता है. पर्याप्त रूप से मजबूत प्रोटोकॉल एक रोबोट का उपयोग करने के साथ संगत कर रहे हैं कि प्राप्त किया गया जब तक हमारे अनुभव में, रोबोटिक्स दिनचर्या में सफलतापूर्वक लिखा जा सकता है कि प्रक्रियाओं महत्वपूर्ण प्रयास के साथ पहली परिष्कृत किए जाने की आवश्यकता. ऐसे प्रोटोकॉल हमारे रियायतों का आधार बनेगी. 5,6,14,15 दरअसल, रोबोट के लिए इन मजबूत प्रोटोकॉल के कार्यान्वयन हमारी प्रयोगशाला में भी मैनुअल संचालन का एक बहुत काफी दक्षता हासिल करने के लिए नेतृत्व.
कई प्रोटीन और प्रोटीन परिसरों किया गया है और उत्पादन किया जा रहा है कि हम विकसित MultiBac प्रणाली का उपयोग करके, और दुनिया चौड़ा करने के लिए करीब 500 प्रयोगशालाओं अभिकर्मकों प्राप्त किया है. MultiBac संरचनात्मक जीव विज्ञान में बल्कि कई अन्य संगठनों में न केवल अनुसंधान समर्थ हैजांच या बड़े विधानसभाओं में प्रोटीन के बीच बातचीत का फायदा उठाने कि जीवन विज्ञान के एर क्षेत्रों. MultiBac भी द्वारा अभी हाल ही में 4, MultiBac भी स्तनधारी कोशिकाओं और सेल संस्कृतियों में जीन देने के लिए इस्तेमाल किया गया है. उपयोगी वैक्सीन उम्मीदवारों बन सकते हैं जो वायरस की तरह कणों, सहित काफी औषधीय ब्याज की प्रोटीन लक्ष्य का उत्पादन किया जाता है, या यहां तक कि पूरे जीवों की गई है जीन थेरेपी. 4 हम इस तरह के योगदान में सचित्र उन के रूप में दृष्टिकोण multiprotein विधानसभाओं और स्वास्थ्य और रोग में सेलुलर प्रक्रियाओं के आधार फार्म कि जैविक अणुओं की जटिल परस्पर क्रिया से जुड़े शोध के कई क्षेत्रों के लिए उपयोगी साबित होगा कि आशा.
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Disclosures
आईबी यहाँ वर्णित प्रौद्योगिकी के कुछ हिस्सों का ब्यौरा पेटेंट और पेटेंट आवेदनों पर आविष्कारक है.
Acknowledgments
हम क्रिस्टोफ Bieniossek, साइमन Trowitzsch, डैनियल फिजराल्ड़, Yuichiro Takagi, क्रिस्टियन Schaffitzel, युवान Hunziker, टिमोथी रिचमंड और मदद और सलाह के लिए बर्गर प्रयोगशाला के सभी पूर्व और वर्तमान सदस्यों को धन्यवाद. MultiBac मंच और इसके विकास के लिए किया गया है और उदारता से स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (SNSF), एजेंस राष्ट्रीय डी Recherche (ANR) और केंद्र में राष्ट्रीय डी Recherche Scientifique (CNRS) और यूरोपीय आयोग (ईसी) सहित आर्थिक सहायता एजेंसियों द्वारा समर्थित हैं फ्रेमवर्क कार्यक्रमों में (एफपी) 6 और 7. अंतरराष्ट्रीय पहुंच के लिए समर्थन ईसी परियोजनाओं FP7 पी घन (द्वारा प्रदान की गई है www.p-cube.eu ) और BioStruct एक्स ( www.biostruct-x.eu ). विज्ञान के फ्रेंच मंत्रालय विशेषकर Investissement डी Avenir परियोजना FRISBI माध्यम EMBL में MultiBac मंच का समर्थन करने के लिए स्वीकार किया है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bluo-Gal | Invitrogen | 15519-028 (1 g) | |
| Tetracycline | Euromedex | UT2965-B (25 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| Kanamycine | Euromedex | EU0420 (25 g) | 1,000X at 50 mg/ml |
| Gentamycine | SIGMA | G3632 (5 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| IPTG | Euromedex | EU0008-B (5 g) | 1,000X at 1M |
| Cre-recombinase | New England BioLabs | M0298 | |
| X-Treme GENE HP transfection reagent | Roche | 06 366 236 001 | |
| Hyclone SFM4 Insect | Thermo Scientific | SH 30913.02 | |
| 6-well plate Falcon | Dominique Dutscher | 353046 | |
| 2 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357507 | |
| 5 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357543 | |
| 10 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357551 | |
| 25 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357535 | |
| 50 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357550 | |
| 50 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352070 | |
| 15 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352096 | |
| 1.8 ml cryotube Nunc | Dominique Dutscher | 55005 | |
| 100 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211917 | |
| 250 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211918 | |
| 500 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211919 | |
| 2 L shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211921 | |
| Certomat Orbital Shaker + plateau | Sartorius | 4445110, 4445233 | |
| Liquid nitrogen tank dewar 35 L | Fisher Scientific | M76801 | |
| Biological Safety Cabinet Faster | Sodipro | FASV20000606 | |
| Optical Microscope | Zeiss | 451207 | |
| Sf21 Insect cells | |||
| Hi5 Insect cells | Invitrogen | B855-02 | |
| Tecan freedom EVO running Evoware plus | TECAN | ||
| 10 μl conductive tips (black), | TECAN | 10 612 516 | |
| 200 μl conductive tips (black) | TECAN | 10 612 510 | |
| disposable trough for reagents, 100 ml | TECAN | 10 613 049 | |
| twin.tec PCR plate 96, skirted | Eppendorf | 0030 128.648 | |
| 96 well V bottom, non sterile | BD falcon | 353263 | |
| 96 deepwell plate color natural, PP) | Fisher | M3752M | |
| PS microplate, 96 well flat bottom | Greiner | 655101 | |
| 96 deepwell plate | Thermo scientific | AB-0932 | |
| 24 well blocks RB | Qiagen | 19583 | |
| DpnI restriction enzyme | NEB | R0176L | 20 U/uL |
| NEBuffer 4 10X | NEB | B7004S | |
| 2X phusion mastermix HF | Finnzyme | ref F-531L | |
| 2X phusion mastermix GC | Finnzyme | ref F-532L | |
| DGLB 1.5X | homemade | 7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF | |
| High DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10496-016 | |
| Low DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10068-013 | |
| E-gel 48 1% agarose GP | Life Technologies | G8008-01 | |
| Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit | Macherey Nagel | 740 708.24 | |
| PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract | Macherey Nagel | 740 707.2 | |
| Gotaq green master mix | Promega | M7113 | |
| T4 DNA polymerase, LIC-qualified | Novagen | 70099-3 | |
| DTT 100 mM | homemade | ||
| Urea 2 M | homemade | ||
| EDTA 500 mM pH 8.0 | Homemade | ||
| LB broth (Miller) 500 g | Athena ES | 103 |
References
- Nie, Y., Viola, C., Bieniossek, C., Trowitzsch, S., Vijay-Achandran, L. S., Chaillet, M., Garzoni, F., Berger, I. Getting a Grip on Complexes. Curr. Genomics. 10 (8), 558-572 (2009).
- Robinson, C. V., Sali, A., Baumeister, W. The molecular sociology of the cell. Nature. 450 (7172), 973-982 (2007).
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).
- Bieniossek, C., Imasaki, T., Takagi, Y., Berger, I. MultiBac: expanding the research toolbox for multiprotein complexes. Trends Biochem. Sci. 37 (2), 49-57 (2012).
- Fitzgerald, D. J., Berger, P., Schaffitzel, C., Yamada, K., Richmond, T. J., Berger, I. Protein complex expression by using multigene baculoviral vectors. Nat. Methods. 3 (12), 1021-1032 (2006).
- Bieniossek, C., Richmond, T. J., Berger, I. MultiBac: multigene baculovirus-based eukaryotic protein complex production. Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 5, Unit 5.20 (2008).
- Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Nie, Y., Garzoni, F., Berger, I. New baculovirus expression tools for recombinant protein complex production. J. Struct. Biol. 172 (1), 45-54 (2010).
- Vijayachandran, L. S., Viola, C., Garzoni, F., Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Chaillet, M., Schaffitzel, C., Busso, D., Romier, C., Poterszman, A., Richmond, T. J., Berger, I. Robots, pipelines, polyproteins: enabling multiprotein expression in prokaryotic and eukaryotic cells. J. Struct. Biol. 175 (2), 198-208 (2011).
- Thomas, M. C., Chiang, C. M. The general transcription machinery and general cofactors. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 105-178 (2006).
- Klinge, S., Voigts-Hoffmann, F., Leibundgut, M., Ban, N. Atomic structures of the eukaryotic ribosome. Trends Biochem. Sci. 37 (5), 189-198 (2012).
- Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. One core, two shells: bacterial and eukaryotic ribosomes. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (6), 560-567 (2012).
- Cramer, P., Bushnell, D. A., Fu, J., Gnatt, A. L., Maier-Davis, B., Thompson, N. E., Burgess, R. R., Edwards, A. M., David, P. R., Kornberg, R. D. Architecture of RNA polymerase II and implications for the transcription mechanism. Science. 288 (5466), 640-649 (2000).
- Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nat. Biotechnol. 22 (12), 1583-1587 (2004).
- Bieniossek, C., Nie, Y., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Collinson, I., Romier, C., Berger, P., Richmond, T. J., Steinmetz, M. O., Berger, I. Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production. Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).
- Nie, Y., Bieniossek, C., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Steinmetz, M. O., Berger, I. ACEMBLing multigene expression constructs by recombineering. Nat. Protocols. , (2009).
- Wasilko, D. J., Lee, S. E., Stutzman-Engwall, K. J., Reitz, B. A., Emmons, T. L., Mathis, K. J., Bienkowski, M. J., Tomasselli, A. G., Fischer, H.D. titerless infected-cells preservation and scale-up (TIPS) method for large-scale production of NO-sensitive human soluble guanylate cyclase (sGC) from insect cells infected with recombinant baculovirus. Protein Expr. Purif. 65 (2), 122-132 (2009).
- Chao, W. C., Kulkarni, K., Zhang, Z., Kong, E. H., Barford, Structure of the mitotic checkpoint complex. Nature. 484 (7393), 208-213 (2012).
- Yamada, K., Frouws, T. D., Angst, B., Fitzgerald, D. J., DeLuca, C., Schimmele, K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Structure and mechanism of the chromatin remodelling factor ISW1a. Nature. 472 (7344), 448-453 (2011).
