Summary
Protein kompleksleri önemli hücre fonksiyonlarını katalize eder. Birçok temel komplekslerinin detaylı fonksiyonel ve yapısal karakterizasyonu rekombinant üretimi gerektirir. MultiBac özellikle ökaryotik protein ve kompleksleri ifade etmek için özel bir bakülovirüs / böcek hücre sistemidir. MultiBac açık erişim platformu ve faydayı maksimize için geliştirilmiş standart çalışma prosedürleri olarak uygulanmıştır.
Abstract
Proteomics araştırmalar benzeri görülmemiş ayrıntılı olarak ökaryot proteomlarda etkileyici karmaşıklığı ortaya çıkardı. Şimdi hücrelerdeki protein soyutlanan varlıklar olarak değil var ama çoğu değilse tüm hayati fonksiyonları için hücrede montaj hatları oluşturan, insanlar on veya daha fazla, pek çok diğer proteinler ile birlikte biyolojik aktivite uygulamayın bir genel kabul gören bir kavramdır. 1 , bu multiprotein meclislerin işlevi ve mimarisi 2 Bilgi detaylı analiz için üstün kalite ve yeterli miktarda kendi ayrılmasını gerektiren. Hücreleri içinde birçok protein kompleksleri yetersizliği, ökaryotlarda, özellikle doğal kaynaklardan ekstraksiyon yasaklar, ve rekombinant üretim gerektirir. Bakulovirüs ekspresyon vektör sistemi (BEVs) ökaryotik proteinler üretmek için özellikle yararlı olduğu kanıtlanmıştır, ve aktivite genellikle translasyon sonrası işleme dayanan yaygın olarak kullanılan diğer ekspresyon sistemleri genellikle mümkün olduğudesteklemez. 3 BEVs ilgilenilen genin da tercih edilen bir proteini üretmek böcek hücresi kültürleri enfekte içine eklenmiş bir rekombinan bakulovirüs kullanın. MultiBac özellikle birçok alt birimleri içeren ökaryotik protein kompleksleri üretimi için özel olan bir BEVs olduğunu. 4 verimli proteinlerin üretimi ve kompleksleri için hayati bir ön koşul ideal olarak uygulanabilir bir ifade deneyde ilgili tüm adımlar için sağlam protokolleri standart operasyon prosedürleri (SOP) ve karşılaştırmalı kolaylıkla uzman olmayan kullanıcılar tarafından da takip. Avrupa Moleküler Biyoloji Laboratuarı (EMBL) de platformun MultiBac proteinin küçük ölçekli analizlerine heterolog protein üretimi özellikleri için optimize edilmiş bir mühendislik bakuloviral genlerin genomun içine sokulmasını başlayarak, bir multiprotein karmaşık ifade deney ile ilgili tüm adımlar için SOP kullanır üretilen numuneler. 5-8 platformuEMBL Grenoble bir açık erişim modunda yüklenir ve akademi ve protein kompleksi araştırma projeleri hızlandırmak için sanayiden birçok bilim adamı desteklemiştir.
Introduction
Biyolojik aktivite protein ve hücresel fonksiyonları katalize uyum içinde hareket diğer biyomoleküllerin meclisleri tarafından kontrol edilir. Önemli örnekler mesajcı RNA DNA bulunan kalıtsal bilgi transkripsiyonun makine içerir. İnsanlarda, 100'den fazla protein olan RNA polimeraz II ve bu TFIID, ve diğerleri gibi TFIIH genel transkripsiyon faktörlerini içerir. 9 Diğer örnekler de dahil olmak üzere 10 ve daha fazla alt-birimleri ile büyük multiprotein kompleksleri oluşturarak, gen transkripsiyonu için bir tanımlanmış ve regülasyonuyla bir araya gelip ribozom, protein sentezi, ya da ökaryotlarda çekirdek zarı yoluyla biyomoleküllerin mekik sorumludur nükleer gözenek kompleks katalize birçok protein ve RNA molekülleri arasında oluşur. Hücrede aslında tüm bileşenli makineleri ayrıntılı bir mimari ve biyokimyasal diseksiyon işlevlerini anlamak için çok önemlidir. Prokaryotik ve eukar yapısı aydınlatılmasıyotic ribozomlar, örneğin, bu makromoleküler makineleri hücre n belirlenen işlevlerini yerine nasıl içine görülmemiş fikir veren damgasını olaylar oluşturmuştur. 10,11
Ribozomlar hücre kütlesinin% 30'u ribozomların oluşması nedeniyle, kültürlenmiş hücrelerden endojen malzeme saflaştırılmasıyla detaylı bir çalışma için yeterli kalitede ve miktarda elde edilebilir. RNA polimeraz II diğer önemli kompleksler ezici çoğunluğu ancak mevcut zaten maya kültürü daha az büyüklükte siparişleri ile bol ve birçok bin litredir transkripsiyon merkezi bu temel karmaşık ayrıntılı bir atom görünümü elde etmek için işlenecek vardı. 12 böylece yerli hücrelerinde olmuş, ve çok daha düşük miktarda yerel kaynak malzemeden yeterli saflaştırılmış edilemez. Ayrıntılı yapısal ve fonksiyonel analiz için erişilebilir bu tür kompleksleri işlemek için rekombinant te kullanarak heterolog üretim gerektirirchniques.
Rekombinant protein üretimi yaşam bilim araştırma üzerinde önemli bir etkisi vardı. Birçok protein yeniden birleştirilerek üretilen ve kendi yapısı ve işlevi yüksek çözünürlükte disseke edildi. Yapısal genomik programları yüksek verimli (HT) modda tüm organizmaların gen ürünü repertuar yönelik birçok organizmaların genomları en aydınlatılması yararlanmaktadır. Protein yapılarının Binlerce böylece belirlenmiştir. Bugüne kadar, yeniden birleştirici protein üretimi için en çok üretken kullanılan sistem E. olmuştur coli ve birçok ekspresyon sistemleri bu ev sahibi heterolog üretimi için yılda gelişmiş ve rafine edilmiştir. E. protein üretimini sağlamak için işlevleri bir bolluk barındıran plazmid coli ticari sağlayıcılarının tüm katalogları doldurun.
Bununla birlikte, E. coli birçok ökaryotik protein üretmek için uygun yapmak bazı sınırlamaları vardır ve pçok sayıda alt-birimleri ile eklem protein kompleksleri. Bu nedenle, ökaryotik ana protein üretimi giderek son yıllarda tercih edilen yöntem haline gelmiştir. Ökaryotik proteinler üretmek için özellikle çok uygun sistem laboratuarda yetiştirilir böcek hücresi kültürleri bulaştırmak için, heterolog genleri taşıyan bir rekombinan bakulovirüs dayanır bakulovirüs ekspresyon vektörü sistemine (BEVs) 'dir. MultiBac sistem özellikle birçok alt birimden (Şekil 1) ile ökaryotik protein komplekslerinin üretimi için uygun olan, daha yakın zamanda geliştirilmiş BEVs olup. MultiBac ilk olarak 2004 yılında tanıtıldı. 13 tanıtılmasından bu yana, MultiBac sürekli geliştirildi ve kullanımı kolaylaştırmak hedef protein kalitesini artırmak ve genel olarak verimli standart operasyon prosedürleri (SOP) tasarlayarak uzman olmayan kullanıcılar için sistem erişilebilir hale getirmek için dere-astarlı. 4 MultiBac ac içinde, dünya çapında birçok laboratuvarda uygulamaya konmuşturademia ve sanayi. Grenoble EMBL de, uluslararası erişim programları araştırma ilerleyen bu üretim sistemi kullanmak isteyen bilim adamları için MultiBac platformda uzman eğitim vermek için Avrupa Komisyonu tarafından uygulamaya konuldu. Onlar EMBL Grenoble de MultiBac tesisinde operasyonda olduğu gibi şimdiye kadar erişilebilir değildi birçok protein komplekslerinin yapısı ve fonksiyonu MultiBac ile üretilen numuneler kullanılarak aydınlatıldı. 4 Aşağıda, MultiBac üretim önemli adımlar protokolleri özetlenmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Multigen İfade Yapıları oluşturmak için tandem Recombineering (TR)
- Ortak ifade stratejisini planlama. Vericiler ve alıcılar içine ilgi genler eklemek için tasarım yaklaşımı. Lütfen kompleks potansiyel fizyolojik alt modüller özel alıcıları ve Bağış birlikte gruplandırılmalıdır. Bireysel Donör ve Alıcı plazmid üzerinde ifade kasetleri birleştirmek BstXI çift 7,8 siliko ilgili tüm yapıları oluşturma ve deneysel çalışma geçmeden önce iyice strateji doğrulamak - Homing endonükleaz (HE) oluşan Çarpma Modülü kullanın.. Örneğin, ilgili genleri, o ya da diğer sınırlama sitelerini ve doğru açık okuma çerçeveleri (ORF'ler) varlığı teyit edilmesi gerekmektedir içeren değil kontrol edilmelidir. Protein üretimi seviyeleri hem de herhangi bir exi çıkarılmasını geliştirmek için böcek hücre kodon kullanımı ve mRNA ikincil yapısını optimize sentetik genler sipariş düşününHE ilgi genlerinden siteleri acı. Esnek veya maruz N-ya da seçtiğiniz proteinlerin C-Termini ile ilgili literatür verilerine dayanarak arıtma etiketleri yerleştirerek düşünün. Bireysel proteinlerin nispi miktarları karmaşık nedeniyle stokiyometri sorunları kontrol edilmesi gerekiyorsa karmaşık birçok protein alt üretmeyi hedefliyoruz poliprotein stratejileri uygulayarak düşünün. "Nasıl Yapılır" belge (elektronik laboratuar kitap tavsiye edilir) 4 ayrıntılı hazırlayın içeren projenin tüm öngörülen deneysel adımlar tam multigen yapı (lar) kadar lider. Berger grup ana sayfa (indirilebilir Cre-ACEMBLER yazılımı kullanarak örneğin Cre-LoxP erimiş plazmid elektronik dosyaları oluşturmak www.embl.fr/multibac/ multiexpression_technologies / CRE-acembler ).
- Seçilen Bağış içine ilgi genler yerleştirin veRestriksiyon enzimleri ve ligaz kullanılarak, veya alternatif olarak, yayınlanan protokolleri takip ligasyon bağımsız yöntemler kullanarak alıcıları. 5,6,14 bir sıvı taşıma iş-istasyonuna erişimi varsa ve elde edilecek yapıları çok sayıda (planlıyorsanız kombinatoryal yaklaşımlar için örneğin) bir sıvı taşıma iş istasyonu mevcut değilse Berger grubu (Şekil 2). 14,15 tarafından geliştirilen ve uygulanan robotik komut dosyalarını kullanarak düşünün, mikrotitre plakaları kullanarak manuel kullanım moda gibi bir HT gen ekleme sağlar.
- Ifade alt birimlerinin stokiyometri kontrol etmek için ihtiyaç dayattığı kısıtlamaları hayata olabilir. Bir protein kompleksinin tek tek alt birimlerinin stokiyometrik olarak dengesiz ekspresyon düzeylerinin durumunda, s aralıklı tek bir büyük ORF da kompleks birçok alt birimden ve belirli bir proteaz (örneğin tütün etch virüsü Nla proteaz) birleşmek için poliprotein stratejiler uygulayarak dikkatepecific proteolitik siteleri. 4,8 düşünün eş-ifade eden bir çok alt-birimleri ile çok büyük bir kompleks olan ve yaygın olarak tek tek alt biriminin moleküler ağırlığı arasında değişen eğer tek bir ekspresyon kasetleri, bir kez ya da birkaç poliproteinlerin. Göz önünde ko-ifade bu proteinin düşük üretim verimi ile karakterize edilir, bir poliprotein içinde, ya da daha fazla özdeş ekspresyon kasetleri ile aynı proteini kodlayan birçok gen. 4,13
- Kısıtlama haritalama (isteğe bağlı olarak yüksek verimli) ve sıralama ile klonlanmış tüm Donör ve Alıcı yapıları doğrulayın. Tercih multigen ifade yapıları oluşturmak için Cre-LoxP rekombinasyon tarafından Donör-Alıcı kombinasyonları sigorta geçin. Kısıtlama haritalama Alıcı-Verici füzyon plazmid arıtılmış doğrulamak, Cre-ACEMBLER veya bir referans olarak benzer programlar tarafından oluşturulan elektronik dizileri kullanın.
- -20 ° C'de saf ve doğrulanmış Bağış, alıcıları ve Donör-Alıcı füzyonlarını Mağaza veya -80 ° C Arşiv plasmids ve daha sonra kullanım için dikkatli dizileri (Microsoft Excel, Filemaker, diğerleri).
2. Kompozit multigen Baculovirus Üretimi, Amplifikasyon ve Depolama
- Viral genom ve Tn7 aktarılması için gerekli işlevleri barındıran DH10 hücrelere dönüştürerek multigen transferi vektörleri MultiBac bakuloviral genom entegre edin. Multibac bakuloviral genom Tn7 entegrasyon önceki vivo Cre reaksiyon bir tarafından kendi LoxP sitesinde ilgi belirli genler (YFP işaretleyici, chaperones, vb) (Tn7 eki siteye distal genomuna mühendislik) ile önceden yüklenmiş olabilir unutmayın. 13 Tn7 aktarılması sonra, ilgi genleri içeren kompozit bakülovirüs ile hücre beyaz / mavi tarama (β-galaktosidaz α-tamamlama kaybı başarılı Tn7 aktarılması sonuçları seçilir, bu nedenle, doğru Tn7 aktarılması ile koloniler seçici bir beyaz kalırgar X-gal içeren plakalar) ve genom alkalin lisizi ve etanol / izopropanol çökeltme ile hazırlanır. 5,6
- Transfeksiyon ve ilk virüs üretimi. Steril bir başlık içine yerleştirin 6-çukurlu bir doku kültür plakası. Geçmiş faz, Sf21 böcek hücre kültüründen, tarif edildiği gibi kültür ortamı içinde karıştırıldı saflaştırılmış baküloviral genomu ve bir transfeksiyon reaktifi ekleyerek kuyular ve transfekte hücrelerin alikotları üzerinden tohumu. Ortam kaldırarak 48-60 saat sonra hasat 6 ilk virüsü ( yüksek kalite, düşük titre virüs V 0, iyi başına tipik olarak 3 ml). Ilave 2-3 gün sonra, protein üretimi için taze ortam ve test (ve bir YFP işaretleyici mevcut ise, flüoresan) için ek. 6,7
- Virüs Amplifikasyon, düşük İçişleri Bakanlığı rejimi. Küçük (100-250 mL) çalkalama Erlenmeyer şişeleri içinde ajite log fazında hücrelerin 25-50 ml (mi başına hücre yoğunluğu <1x10 6 hücre) enfekte etmek için virüs V 0 kullanınyörünge platform shakers üzerinde (Şekil 3). Hücre sayımı ve hücreler (çoğalması tutuklama) iki katına durana kadar her 24 saat ayrıldı. Bir (hücre başına virüs parçacıkları enfeksiyonu yani sayısı çokluğu) İçişleri Bakanlığı düşük rejimi takip edin: Hücreler bir kez (İçişleri Bakanlığı <1), aksi V 0 daha küçük bir hacmi ile deneyi tekrar (en az) iki katına gerekir ekledi. Normal olarak, V, 0, 3 ml 0.5x10 6 hücre / ml 'lik bir yoğunlukta, Sf21 böcek hücreleri, 25 ml hastalık bulaştırmak için kullanılmıştır. Bu zararlı önlemek için şarttır ilgi heterolog genlerin kaybına neden olabilir virüs aşırı büyütmesi ve otomatik silme. Hücreleri peletleme ve virüs içeren medya kaldırarak 48-60 saat sonra hasat V 1 virüsü (25-50 ml). 6, 1x10 6 hücre her 12 veya 24 saat çıkarmadan peletleme ve protein üretimi ve işaretleyici protein (YFP) sinyali doğrulayarak. Tarafından YFP ve protein üretimi için taze medya ve test ile Ek, (virüs AmplifyV 2) daha büyük ifade hacimleri yukarıdaki düşük İçişleri Bakanlığı rejimi (hücreleri V 1 ile enfeksiyon sonrası en az bir kez çift gerekir) saygı V 1 virüsü ile 2 L Shaker şişeler 400 ml hücrelere kadar nüfuz ederek yöneliktir eğer. Sıkı artık ilgi genleri içeren kusurlu virüslerin birikmesini önlemek için amplifikasyon sırasında protein üretimi ve işaretleyici protein sinyal test edin. Her amplifikasyonlar de biriken 5-7 Kullanım hücre pelet ilgi ifade protein kompleksi için arıtma protokolü kurulması için zaten adım.
- Üretim virüs BIIC depolama. Önemle kullanılarak üretim virüsü gibi V 2 virüs saklamak için tavsiye BIIC (B aculovirus-i C arşın nsect nfected) rekombinant virüs değişiklikler (ilgilenilen genin örneğin kayıp) önlemek ve yüksek ifade korumak için, yöntem seviyes çoğalması tutuklanmasının ardından 24 saat gözlenmektedir 16 Pelet enfekte hücreleri -. onlar medya içine (tomurcuklanma ile) serbest olacağını hemen önce bu aşamada hücre tam viral parçacıkların içerir. Sıvı nitrojen içinde ortam ve hücre taneciklerine dondurularak bölüntülerin ve süresiz saklayın. 7,16
3. Protein Üretimi ve Aşağı İşleme
- Büyük (r) kültür ve izleme YFP enfekte. Üretim süreçleri (2 L şişeler içinde tipik olarak 400 ml) daha büyük hücre kültürleri bulaştırmak için V, 1, 2 veya dondurulmuş BIIC alikotları kullanın. Düşük İçişleri Bakanlığı rejimi (öyle ki enfekte kültürü en az bir kez iki katına enfeksiyon için kullanılan virüs ses seviyesini ayarlamak) uyun. Şişe sayısı çarpılarak gerekirse enfekte kültür hacimleri Büyüt. YFP işaretleyici protein varsa, belirli aralıklarla 1x10 6 hücre geri pelet ve hücreler lyse ve bir plato ind ulaşılana kadar YFP sinyal evrimi izlemekmaksimum yeniden birleştirici protein üretimi icating. YFP seviyeleri floresan sinyalleri (örneğin, Tecan SPECTRAFluor) kayıt kapasitesine sahip standart bir 96 çukurlu tabla okuyucusu ölçülebilir. Bu aşamada hücreler hasat. -20 ° C (kısa süreli) veya -80 mağaza hücre pelet ° C (uzun vadeli).
- Hücre parçalama ve ayrıştırma. Protein gereksinimlerini (donma-çözülme, sonikasyon, Fransız basını, diğerleri) uygun seçtiğiniz favori yöntemi, hücreleri lyse. 5-7 damıtmak sitozol ve ilgi proteinlerin varlığı için çekirdek ve test. Protein saflaştırma basitleştirmek için sonuçlarına göre arıtma protokolü geliştirin. Sizin protein nükleus yerleşimli ise yüksek KCl koşullar altında nükleer fraksiyonu adresinin protein ayıklamak için nemlendirici yöntemler uygulanarak düşünün. 7,18
- Protein saflaştırma (mikro ölçekli, büyük ölçekli). Hücre kültürü genellikle küçük miktarlarda (10 ya da 25 mL) ile su olduğuna dikkatnedeniyle bakulovirüs / böcek hücre sistemleri (L kültür ve daha başına protein genellikle 10-100 mg), heterolog proteinlerin tipik olarak yüksek veya çok yüksek üretim seviyelerine ilgi proteinlerin önemli miktarda saflaştırılması için hücre pelletleri elde etmek için fficient. Mikro saflaştırma (yuvalı plakalarda, mikro tip yöntemler, GE Healthcare ÄKTAmicro sistemi, diğerleri) ile bağlantılı olarak bu biyokimyasal ve aktivitesi ile ilgili veriler ve genellikle de nanolitre ölçekli, yüksek verim kristalleştirme için istenilen proteinlerin ve kompleksleri yeterli miktarda (HTX elde etmek mümkündür .) Küçük iyon değişimi ve boyut dışlama kromatografisi ile bağlantılı olarak, saflaştırma kolaylaştırmak için kompleks, protein alt birimlerinin maruz metal afinite saflaştırma (Clonetech Takara Talon Qiagen NiNTA Metal kelat yapıcı reçineleri) ve bir oligo-histidin (6-10 kalıntıları) etiketi kullanılarak göz önünde Örneğin ÄKTAmicro veya benzer bir küçük hacimli arıtma makinesi (Şekil 4 ile hacimleri
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MultiBac sistemiyle elde heterolog proteinlerin güçlü ortak ifade Şekil 1d (süspansiyonuna hücre kültürü bulaşmasını 48 saat sonra alınan probları) 'de gösterilmiştir. Aşırı ekspresyona uğramış protein bantları tüm hücre ekstresi (SNP) ve temizlenir lizat (SN) açıkça görülebilir. Üretilen protein malzeme kalitesi ve miktarı genellikle Şekil 1e gösterilen bu mitotik kontrol noktası karmaşık MM gibi protein kompleksleri, yapısı tespitine imkan vermek yeterlidir. 17
Şekil 2 robot yardımlı tandem Recombineering (TR) tarafından bir gen montaj deney iş akışını gösterir. Sağlam DNA montaj protokolleri multigen ifade yapıları paralelleştirilmiş montajı için robotik rutinleri içine komut dosyası vardı. Bireysel robot adımları enstantaneler (- IV Şekil 2c, I) gösterilmiştir. Monte edilecek DNA parçaları PCR ile üretilen ve kalite kontrol edilirE-jeller (Şekil 2d, sol); monte multigen yapıları aynı şekilde astar özel olarak tasarlanmış setleri (Şekil 2d, sağ) ile PCR ile doğrulanır 14,15.
Rekombinant bakülovirüs üretimi ve yükseltme standart çalışma prosedürleri (şematik olarak Şekil 3a görüntülenir) izler. Bir tek tabaka içinde kültüre edilmiş hücreler, anlık görüntülerini bir MultiBac virüsü ile (Şekil 3B, I. ve II.) Şu enfeksiyon gösterilmiştir.
Rekombinant protein kompleksleri sonraki işlem grubu gibi iş akışı küçük ölçekli sistemler içine entegre ederek komplekslerinin boyut dışlama kromatografisi (SEC) ile takip afinite saflaştırma için çok kuyulu bir levha ya da mikro tip tabanlı kromatografisi ile küçültülmüş olabilir ÄKTAmicro (Şekil 4a). Bir ~ 700 kDa insan transkripsiyon faktörü karmaşık bir temsilcisi SEC profil gösterilir. Örnek kullanılarak saflaştırılmıştırKüçük ölçekli ÄKTAmicro elektron mikroskobu (Şekil 4b) de dahil olmak üzere, biyokimyasal ve biyofiziksel ile karakterizasyonu için genellikle yeterlidir.
Şekil 1. Multiprotein karmaşık üretim için MultiBac platform teknolojisi. (A) Çevrede bulunan genler mavi / beyaz tarama ile birlikte Tn7 aktarılması kullanarak Multibac bakuloviral genomuna entegre edilmiştir. Virüs omurgasında bir LoxP sitesi, bir floresan işaretleyici protein olarak daha fazla işlevleri yanı sıra virüs performans ve heterolog protein üretimini izlemenizi sağlar. (B) bakülovirüs bir uzun sopa şeklini benimser ve karşılamak için güçlendirir esnek bir zarf ile karakterizedir büyük (> 130 kb) dairesel çift zincirli DNA genom. Genomunda büyük heterolog gen yapışma b tolere edilirY zarf uzatma. (c) orbital çalkalayıcı platformlarda Standart Erlenmeyer şişelerine heterologues protein üretimi için büyük ölçekli bir böcek hücresi kültürleri yetiştirmek için kullanılabilir. (d) MultiBac sistemi etkin bir şekilde zaten genellikle açıkça görebilir rekombinant proteinler üretir tam hücre ekstresi (SNP). (e) mitotik kontrol noktası karmaşık yapısı MultiBac sistemi. 17 ile üretilen örnek büyüdü kristalleri X-ışını kırınımı ile belirlendi büyük rakam görmek için tıklayınız .
Şekil 2. (Otomatik) Tandem Recombineering (TR). (A) Tandem Recombineering mult montaj için Vericiler ve alıcılar sentetik plazmid DNA moleküllerinin küçük dizileri denilen kullanırigene ekspresyon yapıları, tercihe göre robot yardımıyla modunda bir sıvı işleme iş-istasyonu (sağ) kullanılarak. (b) 'TR akışı gösterilmiştir. Dilim sırası ve ligasyon bağımsız klonlama anlamına gelir, Cre ilgi genler dilim tarafından yerleştirilmiş olan içine Cre-LoxP füzyon birleştirerek Vericiler ve alıcılar anlamına gelir. Multigen ifade daha sonra MultiBac bakülovirüs genomuna entegre ve rekombinant virüs tarafından enfekte böcek hücre kültürlerinde küçük ve büyük ölçekli ifade için kullanılır tandem dilim ve Cre kullanarak bu Recombineering işlemi tarafından oluşturulan yapıları,. Robot yardımlı TR (c) Fotoğraflar süreci (çoklu kuyucuğu alkali lizis bakteriyel kültür yetiştirilen yapıları, şablon DNA ve primer (I) 'in, yuvalı plakalarda (II), PCR ile DNA (III) amplifikasyonu ve multigen hazırlanmasında PCR reaksiyonlarının hazırlanması sağlanması dahil gösterilmektedir IV). (d) TR için kullanılan PCR ürünleri bize tarafından görüntülenmiştirE-jel sistemi (solda) ing. Tamamlanan multigen yapıları bir e-jel (sağ) yüklü analitik PCR reaksiyonları ile doğrulanır. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 3,. MultiBac virüs üretimi, yükseltme, depolama. (A) EMBL Grenoble MultiBac platformun Standart çalışma prosedürü (SOP), şematik bir görünümü gösterilir. Rekombinant virüs MultiBac Mavi-Beyaz taraması ile tanımlanan ve bakteriyel kültürlerden hazırlanır. Başlangıç transfeksiyon böcek hücrelerinin tek katmanlarını (Sf21, Sf9, Hi5 diğerleri) ile tohumlandı 6 oyuklu plakalar üzerinde yer alır. Virüs Erlenmeyer Shakers güçlendirilmiş ve hedef protein üretilir. Virüs bulaşmış böcek hücrelerinin dondurma alikotları (BIIC) ile saklanır. Floresans analitik bir araç gibi kaydedilirYFP (veya başka bir floresan protein) MultiBac bakuloviral genomu, loxP sitede mevcut içine, örneğin bir işaretleme proteini olarak entegre edilmiştir. (B) 'MultiBac bakülovirüs aşılanmış böcek hücreleri Anlık gösterilmiştir. Hücreler çoğalan durdurmak, boyutu (I.) artış. Hücre füzyon (II) 'görülmektedir. Ortama enfekte hücrelerini aşılı Virüs toplanan ve protein karmaşık üretim (III, IV) için büyük bir hücre kültürleri bulaştırmak için kullanılır. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 4. Protein karmaşık üretim ve aşağı akım işleme. Protein karmaşık örnek zaten uygun gibi çok katlı ya da minyatür saflaştırma yöntemleri kullanarak küçük ölçekli ilk hücre kültürleri arındırılmalıdır olabilir mikrotip-isteğe bağlı olarak küçük hacimli kromatografi sistemleri (solda) ile birlikte tabanlı arıtma,. Genellikle zaten bu "analitik" saflaştırma çalışır (orta) verimi elektron mikroskobu (sağda) da dahil olmak üzere araçlarının çeşitli saflaştırılmış kompleksinin yapısı ve fonksiyonu analiz için yeterlidir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Şekiller 2 ve 3'te ek video görüntüleri çoklu gen ifade cDNA'dan robot yardımıyla kuşaktan tüm süreci gösteren protein üretimi için bir böcek hücresi kültürlerinin enfeksiyon tüm yol oluşturur. Yeni reaktifler (plazmid ve virüs) ve sağlam protokolleri SOPler dayanarak bir boru hattı sağlamak için geliştirilmiştir. Tüm boru hattı Grenoble EMBL bir platform teknolojisi olarak uygulamaya konmuştur. MultiBac platformu multiprotein araştırma yapan akademik ve sanayi birçok bilim adamı tarafından erişilmiş. Eğitim erişim Avrupa Komisyonu (P-CUBE, BioSTRUCT-X) tarafından finanse edilen özel erişim programları tarafından desteklenir.
MultiBac sistemi kullanarak protein kompleksi ifade yürütmek için SOP durumu uzman olmayan kullanıcıların da kolayca mükellef bu teknolojiyi hale getirdi. Robot destekli operasyon seçe içinde multiprotein karmaşık üretim hızlandırırküler zaman kompleksleri yeterli sayıda ilgi, bir numunenin bir örnek türevleri ve mutantlar için, paralel olarak oluşturulmuş olması gerekir. SOP durumu gelen Ancak, düşük-orta çıktı de manuel çalışma da büyük ölçüde yararlanır. Yeterince sağlam protokolleri bir robot kullanarak uyumlu olduğunu elde edilene kadar deneyimlerimiz, robotik rutinleri içine başarıyla komut dosyası olabilir süreçleri önemli bir çaba ile ilk rafine gerekiyordu. Bu protokoller bizim SOP temelini oluşturan. 5,6,14,15 Gerçekten de, robot için bu sağlam protokollerin uygulanması laboratuvarımızda da manuel operasyonların çok önemli bir verimlilik artışı yol açar.
Birçok protein ve protein kompleksleri olan ve üretilmektedir Geliştirdiğimiz bu MultiBac sistemi kullanılarak, ve dünya çapında 500'e yakın laboratuvar reaktifleri elde edilmiştir. MultiBac yapısal biyoloji değil, aynı zamanda birçok oth değil sadece araştırma katalizör görevini üstlenmişaraştırmak veya büyük meclislerde proteinler arasındaki etkileşimleri istismar yaşam bilimleri er alanlar. MultiBac da daha yakın zamanda 4, MultiBac de memeli hücreleri ve hücre kültürü gen teslim etmek için kullanılmıştır. Yararlı aşı adayları olabilir virüs benzeri partiküller dahil olmak üzere önemli farmakolojik ilgi çekici protein hedeflerini üretmek için kullanılabilir, ya da hatta tüm organizmalar edilmiştir gen tedavisi. 4 Biz bu katkı gösterildiği gibi yaklaşımlar multiprotein meclisleri ve sağlık ve hastalık hücresel süreçlerin temelini oluşturan biyolojik makromoleküllerin karmaşık etkileşimi kapsayan araştırmaların birçok alanda yararlı olacağına tahmin ediyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
IB, burada açıklanan teknoloji parçaları ayrıntılı patent ve patent uygulamaları mucit.
Acknowledgments
Biz Christoph Bieniossek, Simon Trowitzsch, Daniel Fitzgerald, Yuichiro Takagi, Christiane Schaffitzel, Yvonne Hunziker, Timothy Richmond ve yardım ve tavsiye için Berger laboratuar tüm geçmiş ve mevcut üyelerine teşekkür. MultiBac platformu ve gelişimi olmuştur ve cömertçe İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (SNSF), Agence National de Recherche (ANR) ve Centre National de Recherche Scientifique (CNRS) ve Avrupa Komisyonu (AK) dahil olmak üzere finansman kurumları tarafından desteklenmektedir Çerçeve programlarına (FP) 6 ve 7. Uluslararası erişim desteği AB FP7 projeleri P-CUBE (tarafından sağlanan www.p-cube.eu ) ve BioStruct-X ( www.biostruct-x.eu ). Bilim Fransız Bakanlığı özellikle Investissement d'Avenir projesi FRISBI yoluyla EMBL de MultiBac platformu desteklemek için kabul edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bluo-Gal | Invitrogen | 15519-028 (1 g) | |
| Tetracycline | Euromedex | UT2965-B (25 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| Kanamycine | Euromedex | EU0420 (25 g) | 1,000X at 50 mg/ml |
| Gentamycine | SIGMA | G3632 (5 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| IPTG | Euromedex | EU0008-B (5 g) | 1,000X at 1M |
| Cre-recombinase | New England BioLabs | M0298 | |
| X-Treme GENE HP transfection reagent | Roche | 06 366 236 001 | |
| Hyclone SFM4 Insect | Thermo Scientific | SH 30913.02 | |
| 6-well plate Falcon | Dominique Dutscher | 353046 | |
| 2 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357507 | |
| 5 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357543 | |
| 10 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357551 | |
| 25 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357535 | |
| 50 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357550 | |
| 50 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352070 | |
| 15 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352096 | |
| 1.8 ml cryotube Nunc | Dominique Dutscher | 55005 | |
| 100 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211917 | |
| 250 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211918 | |
| 500 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211919 | |
| 2 L shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211921 | |
| Certomat Orbital Shaker + plateau | Sartorius | 4445110, 4445233 | |
| Liquid nitrogen tank dewar 35 L | Fisher Scientific | M76801 | |
| Biological Safety Cabinet Faster | Sodipro | FASV20000606 | |
| Optical Microscope | Zeiss | 451207 | |
| Sf21 Insect cells | |||
| Hi5 Insect cells | Invitrogen | B855-02 | |
| Tecan freedom EVO running Evoware plus | TECAN | ||
| 10 μl conductive tips (black), | TECAN | 10 612 516 | |
| 200 μl conductive tips (black) | TECAN | 10 612 510 | |
| disposable trough for reagents, 100 ml | TECAN | 10 613 049 | |
| twin.tec PCR plate 96, skirted | Eppendorf | 0030 128.648 | |
| 96 well V bottom, non sterile | BD falcon | 353263 | |
| 96 deepwell plate color natural, PP) | Fisher | M3752M | |
| PS microplate, 96 well flat bottom | Greiner | 655101 | |
| 96 deepwell plate | Thermo scientific | AB-0932 | |
| 24 well blocks RB | Qiagen | 19583 | |
| DpnI restriction enzyme | NEB | R0176L | 20 U/uL |
| NEBuffer 4 10X | NEB | B7004S | |
| 2X phusion mastermix HF | Finnzyme | ref F-531L | |
| 2X phusion mastermix GC | Finnzyme | ref F-532L | |
| DGLB 1.5X | homemade | 7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF | |
| High DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10496-016 | |
| Low DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10068-013 | |
| E-gel 48 1% agarose GP | Life Technologies | G8008-01 | |
| Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit | Macherey Nagel | 740 708.24 | |
| PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract | Macherey Nagel | 740 707.2 | |
| Gotaq green master mix | Promega | M7113 | |
| T4 DNA polymerase, LIC-qualified | Novagen | 70099-3 | |
| DTT 100 mM | homemade | ||
| Urea 2 M | homemade | ||
| EDTA 500 mM pH 8.0 | Homemade | ||
| LB broth (Miller) 500 g | Athena ES | 103 |
References
- Nie, Y., Viola, C., Bieniossek, C., Trowitzsch, S., Vijay-Achandran, L. S., Chaillet, M., Garzoni, F., Berger, I. Getting a Grip on Complexes. Curr. Genomics. 10 (8), 558-572 (2009).
- Robinson, C. V., Sali, A., Baumeister, W. The molecular sociology of the cell. Nature. 450 (7172), 973-982 (2007).
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).
- Bieniossek, C., Imasaki, T., Takagi, Y., Berger, I. MultiBac: expanding the research toolbox for multiprotein complexes. Trends Biochem. Sci. 37 (2), 49-57 (2012).
- Fitzgerald, D. J., Berger, P., Schaffitzel, C., Yamada, K., Richmond, T. J., Berger, I. Protein complex expression by using multigene baculoviral vectors. Nat. Methods. 3 (12), 1021-1032 (2006).
- Bieniossek, C., Richmond, T. J., Berger, I. MultiBac: multigene baculovirus-based eukaryotic protein complex production. Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 5, Unit 5.20 (2008).
- Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Nie, Y., Garzoni, F., Berger, I. New baculovirus expression tools for recombinant protein complex production. J. Struct. Biol. 172 (1), 45-54 (2010).
- Vijayachandran, L. S., Viola, C., Garzoni, F., Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Chaillet, M., Schaffitzel, C., Busso, D., Romier, C., Poterszman, A., Richmond, T. J., Berger, I. Robots, pipelines, polyproteins: enabling multiprotein expression in prokaryotic and eukaryotic cells. J. Struct. Biol. 175 (2), 198-208 (2011).
- Thomas, M. C., Chiang, C. M. The general transcription machinery and general cofactors. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 105-178 (2006).
- Klinge, S., Voigts-Hoffmann, F., Leibundgut, M., Ban, N. Atomic structures of the eukaryotic ribosome. Trends Biochem. Sci. 37 (5), 189-198 (2012).
- Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. One core, two shells: bacterial and eukaryotic ribosomes. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (6), 560-567 (2012).
- Cramer, P., Bushnell, D. A., Fu, J., Gnatt, A. L., Maier-Davis, B., Thompson, N. E., Burgess, R. R., Edwards, A. M., David, P. R., Kornberg, R. D. Architecture of RNA polymerase II and implications for the transcription mechanism. Science. 288 (5466), 640-649 (2000).
- Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nat. Biotechnol. 22 (12), 1583-1587 (2004).
- Bieniossek, C., Nie, Y., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Collinson, I., Romier, C., Berger, P., Richmond, T. J., Steinmetz, M. O., Berger, I. Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production. Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).
- Nie, Y., Bieniossek, C., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Steinmetz, M. O., Berger, I. ACEMBLing multigene expression constructs by recombineering. Nat. Protocols. , (2009).
- Wasilko, D. J., Lee, S. E., Stutzman-Engwall, K. J., Reitz, B. A., Emmons, T. L., Mathis, K. J., Bienkowski, M. J., Tomasselli, A. G., Fischer, H.D. titerless infected-cells preservation and scale-up (TIPS) method for large-scale production of NO-sensitive human soluble guanylate cyclase (sGC) from insect cells infected with recombinant baculovirus. Protein Expr. Purif. 65 (2), 122-132 (2009).
- Chao, W. C., Kulkarni, K., Zhang, Z., Kong, E. H., Barford, Structure of the mitotic checkpoint complex. Nature. 484 (7393), 208-213 (2012).
- Yamada, K., Frouws, T. D., Angst, B., Fitzgerald, D. J., DeLuca, C., Schimmele, K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Structure and mechanism of the chromatin remodelling factor ISW1a. Nature. 472 (7344), 448-453 (2011).
