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Biology

माइक्रोबियल सिस्टम्स बायोलॉजी में Chemostats का प्रयोग करें

Published: October 14, 2013 doi: 10.3791/50168
Automatic Translation
1, 1, 1
1Center for Genomics and Systems Biology, Department of Biology, New York University

Summary

सेल के विकास दर एक विनियमित प्रक्रिया और सेल शरीर क्रिया विज्ञान के एक प्राथमिक निर्धारक है. Chemostats का उपयोग सतत संवर्धन सेल के विकास और कैसे उन नेटवर्क सेल के विकास का अनुकूलन के लिए तैयार है कि नियंत्रण आणविक नेटवर्क के अध्ययन की सुविधा पोषक तत्व सीमा से सेल के विकास दर के बाह्य नियंत्रण सक्षम बनाता है.

Abstract

कोशिकाओं बाहरी दुनिया से संकेतों के जवाब में वृद्धि की दर को विनियमित. सेल बढ़ती है, विविध सेलुलर प्रक्रियाओं macromolecular संश्लेषण, चयापचय और कोशिका विभाजन चक्र को अंततः, प्रतिबद्धता सहित समन्वय होना चाहिए. chemostat, प्रयोगात्मक सेल के विकास दर को नियंत्रित करने की एक विधि, व्यवस्थित अध्ययन का एक शक्तिशाली साधन प्रदान करता है कि कैसे विकास दर प्रभावों सेलुलर प्रक्रियाओं - और सेल के विकास की दर को नियंत्रित कि विनियामक नेटवर्क - जीन अभिव्यक्ति और चयापचय सहित. पीढ़ियों chemostats के सैकड़ों के लिए बनाए रखा जब सेल के विकास को सीमित कि पर्यावरण की स्थिति में रोगाणुओं के अनुकूली विकास का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम chemostat संस्कृतियों के सिद्धांत का वर्णन उनके संचालन का प्रदर्शन और उनके विभिन्न अनुप्रयोगों के उदाहरण देते हैं. बीसवीं सदी के मध्य में अपनी शुरुआत के बाद अप्रचार की अवधि के बाद, साथ जीनोम पैमाने के तरीके के अभिसरण एक में नए सिरे सेब्याज सेल के विकास और अनुकूली विकास के आणविक आधार के नियमन में जैविक अनुसंधान में chemostats के उपयोग में एक पुनर्जागरण उत्तेजक है.

Introduction

कोशिकाओं के विकास को आनुवांशिक और पर्यावरणीय कारकों 1,2 बातचीत के जटिल नेटवर्क के द्वारा नियंत्रित किया जाता है. सेल के विकास के multifactorial विनियमन अपने अध्ययन करने के लिए एक प्रणाली स्तर के दृष्टिकोण जरूरी है. हालांकि, विनियमित सेल के विकास के कठोर अध्ययन प्रयोगात्मक कोशिकाओं के विकास दर है जिस पर नियंत्रित करने की कठिनाई से चुनौती दी है. इसके अलावा, यहां तक ​​कि सरल प्रयोगों में कोशिकी शर्तों वे पैदा के रूप में कोशिकाओं को लगातार अपने वातावरण को बदल के रूप में अक्सर गतिशील और जटिल हैं. , परिभाषित अपरिवर्तनीय और नियंत्रित वातावरण में सेल विकास दर की प्रयोगात्मक नियंत्रण सक्षम बनाता है कि कोशिकाओं के संवर्धन की एक विधि: इन समस्याओं का समाधान chemostat द्वारा प्रदान की जाती है.

एक chemostat का उपयोग निरंतर संवर्धन की विधि स्वतंत्र रूप से 1950 में मोनोड 3 और Novick और Szilárd 4 द्वारा वर्णित किया गया था. मूल रूप से कल्पना की है, कोशिकाओं चोर है कि मीडिया का एक निश्चित मात्रा में बड़े हो रहे हैंtinually नई मीडिया और पुराने मीडिया और कोशिकाओं के एक साथ हटाने (चित्रा 1) के अलावा द्वारा पतला. युग्मित साधारण समीकरण अंतर (चित्रा 2) सेल घनत्व (एक्स) और chemostat पोत में वृद्धि को सीमित पोषक तत्व (ओं) की एकाग्रता में परिवर्तन की दर का वर्णन. महत्वपूर्ण बात है, समीकरणों की इस प्रणाली स्थिर राज्य में, कोशिकाओं (यानी घातीय वृद्धि दर स्थिर) के विशिष्ट विकास दर के बराबर है कि उल्लेखनीय निहितार्थ के साथ एक एकल (अशून्य) स्थिर स्थिर राज्य (चित्रा 3) की भविष्यवाणी जिस पर संस्कृति (डी) पतला है. कमजोर पड़ने की दर अलग करके इसे विभिन्न विकास दर में और पोषक तत्व सीमा के विभिन्न परिस्थितियों में कोशिकाओं की स्थिर राज्य की आबादी की स्थापना संभव है.

chemostats का उपयोग कर विकास दर की प्रयोगात्मक नियंत्रण कैसे सेल फिजियोलॉजी परिवर्तन की समझ के विकास के लिए महत्वपूर्ण थाविकास 5,6 की दरों के साथ. हालांकि, सूक्ष्मजीवविज्ञानी तरीकों के इस पूर्व मुख्य आधार बीसवीं सदी के दौरान आणविक जीव विज्ञान अनुसंधान में विस्फोट के दौरान तेजी से अस्पष्ट हो गया. आज, रोगाणुओं और बहुकोशिकीय जीव और प्रणालियों स्तर के विश्लेषण के लिए जीनोम पैमाने तरीकों के आगमन दोनों में वृद्धि पर नियंत्रण में नए सिरे से रुचि chemostats के उपयोग के लिए प्रेरणा का नवीकरण किया है. यहाँ, हम सेल विकास दर का सटीक नियंत्रण और chemostats का उपयोग अनोखे संभव है कि बाहरी वातावरण को भुनाने कि तीन आवेदनों का वर्णन. इस तरह के टेप और मेटाबोलाइट्स - जैसे - coordinately विकास दर के साथ विनियमित रहे हैं सबसे पहले, हम biomolecules के हजारों की बहुतायत जांच के लिए कैसे chemostats के उपयोग का वर्णन. दूसरा, हम chemostats प्रतियोगिता प्रयोगों का उपयोग पोषक तत्व सीमित वातावरण में अलग जीनोटाइप के बीच विकास दर मतभेद का सटीक अनुमान प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है वर्णन कैसे. तीसरा, हम वर्णन कैसे chemostats कर सकते हैंलगातार पोषक तत्व गरीब वातावरण में बढ़ कोशिकाओं की अनुकूली विकास का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. ये उदाहरण chemostats पर्यावरण बातचीत और अनुकूली विकास सेल के विकास विनियमन, जीन का सिस्टम स्तर की जांच सक्षम कर रहे हैं रास्ते में जो उदाहरण देना.

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Protocol

एक chemostat का उपयोग निरंतर संवर्धन के सिद्धांत कार्यान्वयन की एक किस्म में महसूस किया जा सकता है. सभी chemostats में यह सभी घटकों के बाँझपन बनाए रखने के लिए 1) तरीकों के लिए आवश्यक है, 2) एक अच्छी तरह से मिश्रित संस्कृति, संस्कृति पोत के 3) उपयुक्त वेंटिलेशन और मीडिया अलावा और संस्कृति को हटाने की 4) एक विश्वसनीय साधन. यहाँ, हम तत्काल वैकल्पिक setups के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि तरीकों का उपयोग कर एक chemostat के रूप में एक Sixfors बायोरिएक्टर (INFORS इंक) के उपयोग का वर्णन.

1. Chemostat वेसल्स कोडांतरण

  1. मुख्य स्विच का उपयोग Sixfors चालू करें.
  2. अच्छी तरह chemostat पोत, दोषी विधानसभा, और विआयनीकृत (डी) पानी के साथ संलग्न ट्यूबिंग कुल्ला. सभी ट्यूबिंग और O-अंगूठी की जाँच करें और किसी भी देख बाहर पहना टुकड़े जगह.
  3. ड्राइव शाफ्ट जनाधार कांच के बर्तन में और ड्राइव शाफ्ट के ऊपर दोषी विधानसभा पर अपने आवास में बिगड़ रहा है कि ऊपर की ओर का सामना करना पड़ रहा है सुनिश्चित करें. Stirre सेटड्राइव शाफ्ट के नीचे सुनिश्चित करने कांच के बर्तन में आर विधानसभा ड्राइव शाफ्ट समर्थन में बैठा है. कांच के बर्तन के लिए दोषी विधानसभा सुरक्षित करने के लिए दबाना प्रयोग करें.
  4. डि पानी के लगभग 300 मिलीलीटर के साथ पोत भरें.
  5. जांच (2) करते हैं और नीचे आवरण unscrewing और नीचे आवरण इलेक्ट्रोलाइट समाधान के साथ आधे रास्ते भर जाता है कि यकीन है कि बनाकर इलेक्ट्रोलाइट स्तर की जाँच एक भंग ऑक्सीजन से टोपियां निकाल दें. नीचे आवरण Rescrew और chemostat पोत पर पोर्ट में डालें. उंगली तंग जब तक भाड़ में.
  6. एक पीएच जांच ले और उसके भंडारण बफर (3 एम KCl) से हटा दें. पीएच जांच टोपी निकालें और FERMENTOR 1 के लिए देते हैं. Sixfors नियंत्रण स्क्रीन का प्रयोग, FERMENTOR पैरामीटर मेनू पर जाएँ और "पीएच जांचना" का चयन करें. एक मानक 7 पीएच बफर और उच्च पढ़ें के रूप में रिकॉर्ड पढ़ने में पीएच जांच जगह. 4 पीएच बफर और कम पढ़ा के रूप में रिकॉर्ड पढ़ने के साथ दोहराएँ. FERMENTOR से पीएच जांच को अलग करें, डि पानी से धो लें और जांच INT डालनेओ chemostat पोत पर बंदरगाह. उंगली तंग जब तक भाड़ में.
  7. रैक में chemostat पोत रखें. पीएच जांच से जुड़ा है और calibrated किया गया था जो FERMENTOR (1-6) पोत पर ध्यान दें. पीएच जांच पर पीएच जांच टोपी रखें. पन्नी का उपयोग कसकर 2 जांच के ऊपर कवर.
  8. Chemostat पोत से जुड़ी टयूबिंग के सिरों पर पन्नी मोड़ो.
  9. दोहराएँ सभी जहाजों के लिए 1.2-1.8 कदम.
  10. एक तरल चक्र पर 15 मिनट के लिए उन्हें autoclaving द्वारा जहाजों जीवाणुरहित.

2. मीडिया की तैयारी

  1. विभिन्न पोषक सांद्रता में बैच संस्कृतियों से बढ़ कर कोई पोषक तत्व के लिए सांद्रता के सीमित रेंज स्थापित करना. अंतिम सेल घनत्व प्रारंभिक पोषक एकाग्रता की एक रेखीय समारोह (चित्रा 4) है जहां पोषक तत्व सीमा में सीमित है. अच्छी तरह से सीमित रेंज के भीतर एक पोषक एकाग्रता का चयन करें. Saccharomyce साथ पढ़ाई के लिए मानक मीडिया रचना के उदाहरणएस cerevisiae 7-11 में उपलब्ध हैं.
  2. पहले मीडिया ट्यूबिंग के अंत पन्नी में कवर किया जाता है कि यह सुनिश्चित करने के बाद एक हवा प्रवेश और मीडिया आउटलेट युक्त एक रबर प्लग के साथ छाया हुआ है कि एक खाली काबोइ आटोक्लेव.
  3. एक अलग बर्तन में मीडिया के 10 एल तैयार करते हैं.
  4. एक 100 मिलीलीटर मीडिया बोतल के लिए एक 500 मिलीलीटर फिल्टर कप संलग्न करें. इथेनॉल में निष्फल संदंश के साथ कपास फिल्टर निकालें और तुरंत मीडिया काबोइ पर निस्पंदन बंदरगाह के लिए देते हैं.
  5. फिल्टर कप में जोड़कर मीडिया बाँझ एक वैक्यूम स्रोत और फिल्टर करने के लिए मीडिया काबोइ देते हैं.
  6. मीडिया की छानने का काम पूरा हो गया है, एक धातु क्लैंप के साथ निस्पंदन बंदरगाह बंद.

3. 2 जांच औजार और Chemostat स्थापना

  1. Chemostat वाहिकाओं autoclaved और अपनी इसी गर्मी जैकेट में जगह पोत नीचे शांत करने के लिए अनुमति दी गई है के बाद. तापमान जांच, पीएच जांच, और 2 जांच कनेक्ट करें. चलोपोत 2 जांच फूट डालना करने की अनुमति के लिए कम से कम 6 घंटे के लिए पर सत्ता के साथ बैठते हैं.
  2. एक अलग एकत्रित गोदाम में प्रत्येक प्रवाह ट्यूब के अंत रखें. एक autoclaved फिल्टर के माध्यम से हवा की आपूर्ति कनेक्ट और airflow पर बारी. प्रत्येक बर्तन में पानी सभी जवानों को ठीक से गठन कर रहे हैं कि जो इंगित करता है, प्रवाह ट्यूबों के बाहर प्रवाह चाहिए.
  3. वांछित काम कर रहे मात्रा (जैसे 300 मिलीग्राम) के अनुसार प्रवाह ट्यूब की ऊंचाई समायोजित करें. हम अलग अलग काम संस्करणों के लिए calibrated ट्यूब नियुक्तियों के साथ चिह्नित है कि एक शासक का उपयोग करें.
  4. Chemostat पोत के लिए मीडिया काबोइ कनेक्ट करें. ट्यूब रखने के लिए इथेनॉल का उपयोग संभव के रूप में बाँझ समाप्त होता है. पंप और खुले दबाना के माध्यम से पंप टयूबिंग धागा. मीडिया chemostat पोत में प्रवाह करने के लिए शुरू होता है जब तक मैन्युअल पंप दबाएँ. पंप से ट्यूबिंग छोड़ें, मीडिया chemostat पोत में स्वतंत्र रूप से प्रवाह चाहिए. मीडिया प्रवाह ट्यूब तक पहुँच जाता है, पंप और दबाना ट्यूबिंग पुनः अनुलग्न.
  5. RU प्रारंभउत्तेजित देनेवाला 400 rpm के लिए सेट और 30 डिग्री सेल्सियस पर सेट तापमान के साथ बुनियादी कार्यक्रम nning
  6. , 2 जांच जांचना हवा की आपूर्ति बंद कर देते हैं और नाइट्रोजन गैस के लिए स्विच करने के लिए आदेश में. "कम पढ़ा" के रूप में कम से कम एक घंटे और रिकॉर्ड उपाय मूल्य रुको. वापस (यानी परिवेश ऑक्सीजन एकाग्रता युक्त) हवा की आपूर्ति करने के लिए स्विच "उच्च पढ़ें 'के रूप में कम से कम एक अतिरिक्त घंटे और रिकॉर्ड माप इंतजार.
  7. आईरिस सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा रिकॉर्डिंग आरंभ करें.

4. टीका

  1. संस्कृति पोत के शीर्ष बाँझ 70% इथेनॉल का प्रयोग करें.
  2. Chemostat पोत में पोत शीर्ष और पिपेट एक रात में संस्कृति के 1 मिलीलीटर पर पेंच निकालें. पेंच retighten.
  3. आइरिस में टीका के समय संकेत मिलता है.
  4. संस्कृतियों जल्दी स्थिर चरण तक पहुंचने के लिए लगभग 24 घंटे तक प्रतीक्षा करें. संस्कृति बढ़ता है, भंग ऑक्सीजन और पीएच कम हो जाएगा. ग्लूकोज सीमित मीडिया के मामले में, भंग ऑक्सीजन स्थिर पीएचए में ~ 100% करने के लिए वापस आ जाएगीएसई. अन्य पोषक तत्व सीमा के कारण भंग ऑक्सीजन स्थिर चरण में <100% रहेगा.

5. पंप्स की शुरुआत और स्थिर अवस्था प्राप्त

  1. कमजोर पड़ने दर संस्कृति (आयतन में कितना मीडिया प्रति घंटे पोत में बहती है) प्रवाह दर को विभाजित करके गणना की है. उदाहरण के लिए, 300 मिलीलीटर 0.1 की एक कमजोर पड़ने दर की मात्रा का उपयोग करते हुए मीडिया की 30 मिलीलीटर संस्कृति को हर घंटे गयी है कि इसका मतलब है. सिस्टम ही मात्रा संस्कृति लगातार पतला सुनिश्चित करना है कि पोत से निकाल दिया जाता है सकारात्मक दबाव में है. कमजोर पड़ने की दर (डी) की एक सीमा कोशिकाओं chemostat के बाहर धोया जाएगा जो ऊपर कोशिकाओं का अधिकतम विकास दर (μ अधिकतम), से अधिक नहीं है कि इस्तेमाल किया जा सकता है.
  2. वांछित प्रवाह दर स्थापित करने के लिए, पंप पर और बंद है सेकंड की संख्या निर्दिष्ट जो पंप सेटिंग्स, चुनें. पंप ~ 0.11 मिलीग्राम / सेकंड की दर से मीडिया बचाता है.
  3. Sixfors INT का उपयोग कर एक कार्यक्रम निर्धारित करेंपंप समय, तापमान और impellor गति निर्दिष्ट करता है कि erface. कार्यक्रम की शुरुआत करें.
  4. तरल के एकत्रित पात्र खाली है और समय रिकॉर्ड है.
  5. कम से कम दो घंटे के बाद, पोत से हटा दिया गया है कितना मीडिया को मापने के लिए एक स्नातक सिलेंडर का उपयोग करें. इस chemostat पोत को जोड़ दिया गया है कि मात्रा के बराबर होगा. कमजोर पड़ने की दर (डी वी = प्रवाह / वी संस्कृति / समय) की गणना. गणना की कमजोर पड़ने दर वांछित कमजोर पड़ने की दर से मेल नहीं खाता, तो पंप सेटिंग समायोजित करें.
  6. स्थिर अवस्था में, chemostat में सेल घनत्व समय के साथ बदल नहीं है. इस बहिर्वाह नमूना द्वारा संस्कृति perturbing बिना मापा जा सकता है. हम सक्रिय कम से कम एक जनसंख्या दुगनी से अलग हो रहे हैं कि समान सेल घनत्व माप के रूप में स्थिर राज्य की प्राप्ति को परिभाषित. स्थिर अवस्था तक पहुंचना संस्कृति कमजोर पड़ने की दीक्षा के बाद लगभग आठ संस्कृति पीढ़ियों ले जाएगा. स्थिर अवस्था में, कोशिकाओं I. (तेजी से बढ़नेपोषक तत्वों से सीमित परिस्थितियों में समय के साथ ई. निरंतर वृद्धि दर). जनसंख्या (पीढ़ी समय) की दुगनी समय एलएन (2) / डी है.
  7. समय समय पर एक लगातार कमजोर पड़ने दर को बनाए रखा है यह सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग की अवधि के लिए प्रवाह संस्करणों को मापने के लिए जारी.

6. आवेदन 1: स्थिर राज्य शर्तों में अलग दरों पर बढ़ते अध्ययन प्रकोष्ठ

  1. Chemostat में स्थिर अवस्था में, कोशिकाओं की आबादी की वृद्धि दर कमजोर पड़ने की दर के बराबर है. योजनाबद्ध तरीके से कमजोर पड़ने दर फेरबदल करके यह अलग दरों पर कोशिकाओं को विकसित करने के लिए संभव है. इस सेल की मात्रा, सेल चक्र मंच और तनाव प्रतिरोध सहित वृद्धि दर के साथ बदलती हैं कि शारीरिक मापदंड का व्यवस्थित अध्ययन में सक्षम बनाता है. इसके अलावा, वैश्विक mRNA, प्रोटीन और metabolite स्तर के स्थिर राज्य प्रोफाइल अलग दरों पर बढ़ कोशिकाओं में assayed किया जा सकता है. नमूने प्राप्त करने के लिए दो तरीके हैं:
  2. छोटे नमूनों निष्क्रिय ओ हो सकता हैएक 1.5 मिलीलीटर या 15 मिलीलीटर ट्यूब में प्रवाह ट्यूब के अंत रखकर tained. 1-5 मिलीलीटर की एक नमूना (प्रवाह की दर के आधार पर) कुछ ही मिनटों में प्राप्त किया जा सकता है. कई शारीरिक मापदंड इन नमूनों से मापा जा सकता है.
  3. जीन अभिव्यक्ति, या metabolite विश्लेषण के रूप में जल्दी संभव के रूप में प्राप्त किया जाना चाहिए कि बड़े नमूनों की आवश्यकता होती है. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में प्रवाह ट्यूब के अंत रखें. प्रवाह ट्यूब की धातु छोर पकड़े पेंच जारी है और धीरे नीचे धक्का. एक ~ 10 मिलीलीटर नमूना तेजी से अपनी ट्यूब भरना होगा. Chemostat पोत में मात्रा बदल गया है कि मन में रखो. लगातार कई नमूने ले रहे हैं तो यह एक निरंतर कमजोर पड़ने की दर बनाए रखने के लिए प्रवाह को कम करने के लिए आवश्यक हो सकता है.

7. आवेदन 2: फ्लो आधारित प्रतियोगिता assays का उपयोग नियंत्रित वातावरण में जीनोटाइप के बीच विकास दर में अंतर की सटीक माप

  1. Chemostats सही पोषक एकाग्रता का प्रभाव यों इस्तेमाल किया जा सकता हैविभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि के बीच विकास दर (यानी फिटनेस) में मतभेद पर. विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल सह संवर्धन उपभेदों द्वारा घातीय वृद्धि के दौरान रिश्तेदार बहुतायत में परिवर्तन की दर निर्धारित की जाती है. अलग कमजोर पड़ने की दर (डी) में इस परख प्रदर्शन फिटनेस मतभेद पर पोषक एकाग्रता (एस) के प्रभाव के अध्ययन की अनुमति देता है.
  2. समान कमजोर पड़ने दरों और 300 मिलीलीटर की एक मात्रा के साथ अलग chemostat वाहिकाओं में दो उपभेदों की स्थिर अवस्था संस्कृतियों स्थापित करना.
  3. निष्क्रिय प्रत्येक पोत से 1 एमएल नमूना. कोशिकाओं स्पिन, फॉस्फेट में Resuspend 4 डिग्री सेल्सियस पर खारा (पीबीएस) और जगह बफर इन नमूनों बाद फ्लो विश्लेषण के लिए नियंत्रण कर रहे हैं जो समरूप सेल के नमूने होते हैं.
  4. एक autoclaved स्नातक सिलेंडर में से एक पोत से प्रवाह ट्यूब रखें. प्रवाह ट्यूब की धातु छोर पकड़े पेंच जारी है और धीरे chemostat से कोशिकाओं को निष्कासित करने के लिए नीचे धक्का. जबमात्रा अपनी मूल स्थिति (300 मिलीलीटर) को प्रवाह ट्यूब की धातु अंत लौटने, 150 मिलीलीटर तक पहुँचता है. एक अलग स्नातक सिलेंडर का उपयोग कर, दूसरे पोत से दोहराएँ.
  5. Chemostat पोत के शीर्ष पर पेंच निकालते समय बाँझपन बनाए रखने के लिए 70% इथेनॉल का प्रयोग करें. उद्घाटन में कीप प्लेस और chemostat पोत में अन्य संस्कृति से 150 मिलीलीटर डालना. पेंच retighten. दूसरी चिमनी का उपयोग कर, दूसरे पोत से दोहराएँ. प्रत्येक chemostat पोत अब दो उपभेदों का मिश्रण होता है.
  6. हर 2-6 घंटे निष्क्रिय नमूने का उपयोग कर प्रत्येक पोत से एक 1 एमएल नमूना प्राप्त करते हैं. कोशिकाओं स्पिन, resuspend 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में और स्टोर 2-3 दिनों के प्रत्येक नमूना लिया गया था समय की रिकॉर्डिंग के लिए नमूने लेने के लिए आगे बढ़ें.
  7. प्रयोग, sonicate के अंत में और नमूने ~ 2 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल पतला. प्रवाह cytometry का उपयोग, प्रत्येक नमूने में दो उपभेदों के अनुपात को मापने. दोनों उपभेदों तेजी से बढ़ रहे हैं, सापेक्ष विकास दर का अंतर हैसमय (पीढ़ियों में मापा) के खिलाफ एलएन की रेखीय प्रतिगमन (strain1/strain2) द्वारा निर्धारित की. प्रतिगमन की ढलान दूसरे के लिए एक तनाव रिश्तेदार के (फिटनेस लाभ आईई) की विकास दर में आनुपातिक अंतर है.
  8. मिश्रित संस्कृति एक नए स्थिर राज्य हासिल करने के लिए कुछ समय ले सकते हैं, जल्दी समय अंक प्रतिगमन को खराब फिट हो सकता है. यह समस्या सबसे अच्छा 2-3 पीढ़ियों के नमूने शुरू होने या स्पष्ट outliers हैं कि जल्दी अंक निकालने से पहले बीत करने की अनुमति देकर हल है. एक तनाव अन्य outcompeted जाने के बाद इसके विपरीत, डेटा अब उपयोगी नहीं हैं और इन बातों बाहर रखा जाना चाहिए.

8. आवेदन 3: प्रयोगात्मक विकास

  1. Chemostats में प्रदर्शन प्रयोगात्मक विकास पोषक तत्व सीमित वातावरण में फिटनेस में बढ़ रहे हैं कि म्यूटेंट के लिए चुनता है. चुनाव में आम तौर पर पीढ़ियों के सैकड़ों से अधिक किया जाता है.
  2. एक तनाव का उपयोग एक स्थिर राज्य chemostat संस्कृति की स्थापनाके नाम से जाना जाता जीनोटाइप (और बेहतर जाना जाता जीनोम अनुक्रम) और एक परिभाषित पोषक तत्व सीमा.
  3. आदत डाल जनसंख्या का एक "जीवाश्म रिकॉर्ड" बनाए रखने के लिए निष्क्रिय हर 2-3 दिनों chemostat नमूना और -80 डिग्री सेल्सियस पर 15% ग्लिसरॉल में नमूना की दुकान
  4. मीडिया जलाशय की निगरानी और आवश्यक के रूप में नए सिरे से मीडिया के साथ फिर से भरना.
  5. कई सौ पीढ़ियों के लिए तेजी से बढ़ रही संस्कृति को बनाए रखने.
  6. चयन थाली ठोस अगर प्लेटों पर कोशिकाओं का एक नमूना के पूरा होने के बाद. कोशिकाओं कालोनियों में हो गए हैं के बाद, toothpicks का उपयोग कालोनियों का एक निष्पक्ष नमूना लेने और मीडिया के 100 μl युक्त एक 96 अच्छी तरह से थाली के व्यक्तिगत कुओं में क्लोन टीका लगाना. क्लोनल नमूने, रातोंरात बढ़ने डिग्री सेल्सियस -80 में 30% ग्लिसरॉल और दुकान के 100 μl जोड़ने की अनुमति
  7. पूरे जीनोम अनुक्रमण और 2 आवेदन में वर्णित है,, फिटनेस के आकलन सहित प्ररूपी assays के प्रदर्शन एक आम fluorescently लेबल संदर्भ तनाव का उपयोग करके क्लोन विशेषताएँ. </ ली>

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Representative Results

Chemostats का एक बड़ा फायदा यह कमजोर पड़ने की दर अलग से प्रयोगात्मक कोशिकाओं के विकास की दर को नियंत्रित करने की क्षमता है. नवोदित खमीर में, Saccharomyces cerevisiae, एक सेल की आकृति विज्ञान कोशिका विभाजन चक्र में अपने पहले चरण का जानकारीपूर्ण है. उच्च विकास दर के साथ आबादी unbudded कोशिकाओं के अंश (चित्रा 5A) को मापने के द्वारा निर्धारित रूप में सक्रिय रूप से कोशिकाओं को विभाजित के एक उच्च अनुपात में होते हैं. Chemostat संस्कृतियों में वैश्विक mRNA अभिव्यक्ति का विश्लेषण कई जीनों की अभिव्यक्ति विभिन्न विकास दर (आंकड़े 5 ब और चित्रा 5C) के एक समारोह के रूप में व्यक्त कर रहे हैं कि दिखाया गया है.

अलग जीनोटाइप के सापेक्ष फिटनेस fluorescently लेबल कोशिकाओं का उपयोग chemostats में प्रतियोगिता assays के आयोजन द्वारा निर्धारित और cytometry विश्लेषण (चित्रा 6A) प्रवाह किया जा सकता है. चित्रा 6B एक उत्परिवर्ती तनाव एससी था जिसमें एक प्रतिनिधि परिणाम से पता चलता है एक fluorescently टैग किया wildtype तनाव के खिलाफ peted. इस उदाहरण में, उत्परिवर्ती तनाव पीढ़ी प्रति एक 40% वृद्धि दर फायदा है. तुलना करके, एक untagged wildtype तनाव विकास की दर में अलग नहीं है wildtype तनाव fluorescently टैग के खिलाफ प्रतिस्पर्धा.

Chemostats कोशिकाओं पर एक परिभाषित किया है और निरंतर चयनात्मक दबाव का एक साधन प्रदान करते हैं. पूरे जीनोम अनुक्रम विश्लेषण वृद्धि की फिटनेस के साथ कोशिकाओं में अधिग्रहण म्यूटेशन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. विभिन्न पोषक सीमित chemostats में खमीर कोशिकाओं में अनुकूली विकास प्रयोगों प्रतिलिपि संख्या अनुकूली उत्परिवर्तन उत्पन्न कर रहे हैं जिसके द्वारा एक लगातार और दोहराया तंत्र के रूप में वेरिएंट की पहचान की है. उदाहरण के लिए, विभिन्न नाइट्रोजन स्रोतों का उपयोग नाइट्रोजन सीमित chemostats में प्रदर्शन स्वतंत्र अनुकूली विकास प्रयोगों में, कई प्रतिलिपि संख्या GAP1 जीन 11 (चित्रा 7) की पहचान की गई है कि शामिल (CNVs) वेरिएंट.

टी "> Chemostats अन्यथा मानक सूक्ष्मजीवविज्ञानी तरीकों में सामना नहीं कर रहे हैं कि कुछ अद्वितीय चुनौतियों मुद्रा. संभावित समस्याओं और प्रयोगों chemostat के लिए विशिष्ट समाधान तालिका 1 में पाया जा सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. एक chemostat का आरेख. Chemostat एक मीडिया जलाशय, पंप, एक chemostat पोत, एक प्रवाह ट्यूब, और एक एकत्रित गोदाम शामिल हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2. Chemostat के गणितीय मॉडल. अंतर समीकरण 1 सेल के विकास और कमजोर पड़ने (कोशिका मृत्यु नगण्य माना जाता है) से सेल को हटाने का परिणाम है जो समय के साथ chemostat में सेल घनत्व में परिवर्तन (एक्स), वर्णन करता है. मोनोड सेल के विकास (μ) निर्भर है कि 3 प्रस्तावितअधिक से अधिक विकास दर (μ अधिकतम) और एक आधा अधिक से अधिक विकास दर लगातार (कश्मीर एस) के चर शामिल हैं एक Michaelis-Menten प्रकार के रिश्ते के अनुसार बाहरी पोषक एकाग्रता पर है. कमजोर पड़ने की दर (डी) मीडिया अलावा और संस्कृति को हटाने की दर से निर्धारित होता है. अंतर समीकरण 2 chemostat पोत में सीमित पोषक एकाग्रता (ओं) में परिवर्तन की दर का वर्णन करता है. chemostat पोत में सीमित पोषक तत्वों की एकाग्रता में परिवर्तन सेल मानकों μ अधिकतम पर निर्भर है जो कोशिकाओं द्वारा शाखा मीडिया में अपनी एकाग्रता (नि.), बहिर्वाह (डी) द्वारा इसके कमजोर पड़ने और खपत,, के एस पर निर्भर है और लगातार एक उपज, वाई. सरलीकरण के लिए, वाई विभिन्न विकास दर पर स्थिर माना जाता है. सेल भट - युग्मित अंतर साधारण समीकरण में चर, और उनके विशिष्ट इकाइयों, एक्स हैंअल्पसंख्यक (कोशिकाओं / एमएल), एस - पोषक एकाग्रता (माइक्रोन) को सीमित करने, μ मैक्स - अधिक से अधिक विकास दर (मानव संसाधन -1), के एस - विकास दर μ अधिकतम / 2 (माइक्रोन) के बराबर होती है, जिस पर पोषक एकाग्रता, वाई - उपज (कोशिकाओं / एमएल / माइक्रोन), डी - कमजोर पड़ने की दर (मानव संसाधन -1), आर - मीडिया जलाशय में पोषक एकाग्रता (माइक्रोन).

चित्रा 3
चित्रा 3. गणितीय मॉडल ने भविष्यवाणी की स्थिर राज्य के लिए दृष्टिकोण. पोषक एकाग्रता (लाल) और सेल घनत्व (नीला) गैर शून्य स्थिर राज्यों प्राप्त.

चित्रा 4
चित्रा 4. एक पोषक तत्व की सीमित रेंज की स्थापना. Saccharomyces cerevisiae की एक अगुणित तनाव ग्लूकोज और निर्धारित अंतिम घनत्व के विभिन्न सांद्रता में हो गया था. एक रैखिक संबंध पोषक एकाग्रता सीमित रेंज में इंगित करता है.

चित्रा 5
चित्रा 5. सेल फिजियोलॉजी विकास दर के साथ बदलता रहता है. Chemostat विकास दर और (अंकुरित कोशिकाओं के अंश यानी) सेल आकारिकी के आधार पर assayed के रूप में एक) कोशिका विभाजन के बीच संबंध का अध्ययन नियंत्रित सक्षम बनाता है. खमीर mRNAs का 25% ~ की बहुतायत विकास दर पर निर्भर करता है: ग्लूकोज (ओ दोनों में विकास दर बढ़ जाती है) और नाइट्रोजन सीमित (Δ) chemostats और जीन सी के रूप में अभिव्यक्ति में उदाहरण के लिए जीन बी) UTR2 बढ़ जाती है) ASM1 कम हो जाती है विकास दर ग्लूकोज (ओ) में बढ़ जाती है और नाइट्रोजन सीमित (Δ) के रूप में अभिव्यक्ति के स्तर में 10 chemostats.

चित्रा 6
चित्रा 6. Chemostats में तनाव प्रतियोगिता assays. ए) विभिन्न रचनात्मक रूप में व्यक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन द्वारा चिह्नित कर रहे हैं कि दो उपभेदों एक एकल chemostat में सह सुसंस्कृत हैं और दो ​​उपभेदों के रिश्तेदार बहुतायत में परिवर्तन की दर के सापेक्ष फिटनेस. बी प्रवाह cytometry का उपयोग हर 2-4 पीढ़ियों) निर्धारित किया जाता है एक तनाव की रति की प्राकृतिक प्रवेश (एल एन) के रेखीय प्रतिगमन द्वारा निर्धारित किया जाता हैपीढ़ियों में मापा समय के खिलाफ दो उपभेदों की ओ. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 7
चित्रा 7. Chemostats में लंबी अवधि के चयन कुशलता में वृद्धि हुई फिटनेस के साथ म्यूटेंट के लिए चुनता है. म्यूटेंट का जीनोम पैमाने पर विश्लेषण लगातार गुणसूत्र rearrangements की पहचान की और वृद्धि की फिटनेस के साथ म्यूटेंट में संख्या परिवर्तन (CNV) की नकल की है. सामान्य अमीनो एसिड permease encodes जो (ग्रे बिंदीदार रेखा से demarked) GAP1 ठिकाना, पर अलग CNV alleles के लिए चयन में विभिन्न नाइट्रोजन सीमित स्थितियों परिणामों में स्वतंत्र अनुकूली विकास प्रयोगों. प्रत्येक डेटा बिंदु एक के साथ तुलना में विकसित तनाव में डीएनए की नकल संख्या का अनुपात हैcestral तनाव एक साथ हर जीन (काला) का विश्लेषण करती है कि एक डीएनए माइक्रोएरे का उपयोग करके मापा.

तालिका 1. संभावित समस्या और समाधान के पटल.

समस्या समाधान
संस्कृति पोत में कम पीएच. पीएच वास्तविक समय में निगरानी और एसिड / आधार की स्वचालित इसके द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, बफर मीडिया का इस्तेमाल किया जा सकता है.
Flocculant कोशिकाओं और संस्कृति पोत में biofilms. अच्छी तरह से> 400 rpm पर impellor चलाकर मिश्रित संस्कृति रखें.
मीडिया फ़ीड लाइनों में वृद्धि. प्रवेश बंदरगाह पर फिल्टर का उपयोग मीडिया फ़ीड लाइनों के औपनिवेशीकरण के लिए क्षमता कम कर देता है.
सेल तुल्यकालन और स्थिर करना 2 दोलनों मैंn कार्बन सीमित chemostats. इन उच्च कमजोर पड़ने दरों का उपयोग और संस्कृति के कमजोर पड़ने की दीक्षा से पहले भुखमरी की लंबी अवधि से बचने के द्वारा बचा जा सकता है.

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Discussion

Chemostats वृद्धि नियंत्रित स्थिर राज्य की स्थिति में रोगाणुओं की खेती के लिए सक्षम. कोशिकाओं को एक अपरिवर्तनीय बाहरी वातावरण में जिसके परिणामस्वरूप एक स्थिर दर पर लगातार हो जाना. यह बाहरी वातावरण लगातार बदल रहा है और सेल के विकास की दर पर्यावरण और जीनोटाइप के जटिल बातचीत के द्वारा निर्धारित किया जाता है, जिसमें बैच संस्कृति तरीकों के विपरीत है. इस प्रकार, बैच संस्कृतियों से अधिक chemostats में रोगाणुओं संवर्धन का एक प्रमुख लाभ प्रयोगात्मक कोशिकाओं के विकास की दर को नियंत्रित करने की क्षमता है.

एक सेल बढ़ता दर जिस पर पोषक तत्व संवेदन, संकेत पारगमन, macromolecular संश्लेषण और चयापचय सहित असंख्य सेलुलर प्रक्रियाओं के बीच बातचीत का नतीजा है. वैश्विक विश्लेषणात्मक तरीकों के साथ संयोजन में chemostats का प्रयोग अनुमति देता है की जांच कैसे सेल को नियंत्रित करता है और साथ सेलुलर प्रक्रिया निर्देशांक कैसे विपरीत वृद्धि के प्रभावों की दर मौलिक सेल में प्रक्रियाओं औरविकास के अपने दर. Wildtype कोशिकाओं में अध्ययन आरएनए और प्रोटीन के सेलुलर सांद्रता गहराई से सेल के विकास 6 की दरों से प्रभावित कर रहे हैं और अभी हाल ही में यह transcriptome 10,12,13 और metabolome 8 नाटकीय रूप से सेल विकास दर से प्रभावित कर रहे हैं दिखाया गया है कि पता चला है.

chemostats में उत्परिवर्ती व्यवहार का अध्ययन विकास दर विनियमन 14 के लिए महत्वपूर्ण हैं कि रास्ते में अध्ययन का एक संभावित शक्तिशाली साधन प्रदान करता है. म्यूटेंट 15 के हजारों की आणविक बारकोड वाले संग्रह के उच्च throughput अनुक्रमण का उपयोग कर यह पोषक तत्वों से सीमित वातावरण में विकास के लिए आनुवंशिक आवश्यकताओं का व्यवस्थित अध्ययन को सक्षम करने के लिए इन assays मल्टीप्लेक्स अब संभव है. यह chemostats की सीमाओं की है कि वे एकल कक्ष माइक्रोस्कोपी तरीके 16 का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है कि व्यक्ति के सेल विकास दर में अंतर्निहित विविधता का पता नहीं है, तथापि, कि ध्यान दिया जाना चाहिए.

11,17-20 में उनके अनुकूली लाभ साबित अनुकूली विकास के कार्यात्मक आधार को समझने की वादा है.

Chemostats तेजी ट्रांसक्रिप्शनल गतिशीलता 21,22 और चयापचय दोलनों 23-26 का अध्ययन सहित अनुसंधान के नए क्षेत्रों में इस्तेमाल किया जा रहा है. पारिस्थितिकी में अपने आवेदन शिकारी शिकार गतिशीलता 27 के अध्ययन में उपयोगी साबित हुआ है. स्तनधारी सेल के विकास के विनियमन, और मानव रोग में इसकी हानि में एक नए सिरे से रुचि, छात्रों के लिए एक वापसी के लिए प्रेरित कर सकते हैंनिलंबन 28 में संवर्धित किया जा सकता है कि कोशिकाओं का उपयोग chemostats में स्तनधारी कोशिकाओं के डी वाई.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

इस काम के फंड न्यूयॉर्क विश्वविद्यालय के फार्म को शुरू द्वारा समर्थित किया गया. हम शुरू में chemostats रूप Sixfors बायोरिएक्टर के उपयोग को विकसित करने वाले मैत्रेय Dunham और मैट Brauer धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Infors-HT Sixfors Chemostat Appropriate Technical Resources, Inc.  
Glass Bottle 9.5 L Fisher Scientific 02-887-1 For Media Vessel and Hosing
Pinchcock Fisher Scientific 05-867 For Media Vessel and Hosing
Stopper, Size 12, Green Neoprene Cole-Palmer EW-62991-42 For Media Vessel and Hosing
Straight Connector Cole-Palmer EW-30703-02 For Media Vessel and Hosing
General purpose ties 4 in Fisher Scientific NC9557052 For Media Vessel and Hosing
Tubing, Silicone Rubber Small Parts B000FMWTDE For Media Vessel and Hosing
Tubing, Silicone, 3/8 in OD Fisher Scientific 02-587-1Q For Media Vessel and Hosing
Tubing, Silicone, 7/32 in OD Fisher Scientific 02-587-1E For Media Vessel and Hosing
Tubing, Stainless Steel, 3/16 in OD McMaster-Carr 6100K164 For Media Vessel and Hosing
Tubing, Stainless Steel, 3/8 in OD McMaster-Carr 6100K161 For Media Vessel and Hosing
Hook Connectors Fisher Scientific 14-66-18Q For Media Vessel and Hosing
Ratchet Clamp Cole-Palmer EW-06403-11 For Media Vessel and Hosing
Luer, Female Cole-Palmer EW-45512-34 For Media Vessel and Hosing
Luer, Male Cole-Palmer EW-45513-04 For Media Vessel and Hosing
Millipore Aervent MTGR05010 62 mm Filter, 0.2 μm Fisher Scientific MTGR05010 For Media Vessel and Hosing
PTFE Acrodisc CR 13 mm filters, 0.2 μm Fisher Scientific NC9131037 For Media Vessel and Hosing
Direct-Reading Flowtube for Air Cole-Palmer EW-32047-77 For Nitrogen Gas Setup
Direct-Reading Flowtube for Nitrogen Cole-Palmer EW-32048-63 For Nitrogen Gas Setup
Gas Proportioner Multitube Frames Cole-Palmer EW-03218-50 For Nitrogen Gas Setup
Regulator, Two-Stage Analytical Airgas Y12-N145D580 For Nitrogen Gas Setup
Hose Adaptor, Stainless Steel Airgas Y99-26450 For Nitrogen Gas Setup
Hose Male Adaptor Airgas WES544 For Nitrogen Gas Setup
Norprene Tubing US Plastics 57280 For Nitrogen Gas Setup
Tripod Base Cole-Palmer EW-03218-58 For Nitrogen Gas Setup
Valve Cartridges Cole-Palmer EW-03217-92 For Nitrogen Gas Setup
Carboy 10 L Fisher Scientific 02-963-2A For Media Preperation
Steritop Sterile Vacuum Bottle-Top Filters, 1,000 ml, PES membrane; for 45 mm neck size Fisher Scientific SCGP-T10-RE For Media Preperation
Media Bottle 100 ml, 45 mm neck size Fisher Scientific FB-800-100 For Media Preperation
calcium chloride·2H2O Fisher Scientific C79-500 Media Reagents
sodium chloride Fisher Scientific BP358-1 Media Reagents
magnesium sulfate·7H2O Sigma Aldrich 230391 Media Reagents
potassium phosphate monobasic Fisher Scientific AC424205000 Media Reagents
ammonium sulfate Fisher Scientific AC423400010 Media Reagents
potassium chloride Sigma Aldrich P9541 Media Reagents
boric acid Sigma Aldrich B6768 Media Reagents
copper sulfate·5H2O Sigma Aldrich 209198 Media Reagents
potassium iodide Sigma Aldrich 60400 Media Reagents
ferric chloride·6H2O Fisher Scientific I88-100 Media Reagents
manganese sulfate·H2O Sigma Aldrich 230391 Media Reagents
sodium molybdate·2H2O Sigma Aldrich M7634 Media Reagents
zinc sulfate·7H2O Fisher Scientific Z68-500 Media Reagents
biotin Fisher Scientific BP232-1 Media Reagents
calcium pantothenate Fisher Scientific AC24330-1000 Media Reagents
folic acid Sigma Aldrich F7876 Media Reagents
inositol (aka myo-inositol) Fisher Scientific AC12226-1000 Media Reagents
niacin (aka nicotinic acid) Sigma Aldrich N4126 Media Reagents
p-aminobenzoic acid Fisher Scientific AC14621-2500 Media Reagents
pyridoxine HCl Sigma Aldrich P9755 Media Reagents
riboflavin Sigma Aldrich R4500-25G Media Reagents
thiamine HCl Fisher Scientific BP892-100 Media Reagents
Leucine Sigma Aldrich L8000-100G Media Reagents
Uracil Sigma Aldrich U0750 Media Reagents
Dextrose Fisher Scientific DF0155-08-5 Media Reagents

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References

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Ziv, N., Brandt, N. J., Gresham, D. The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology. J. Vis. Exp. (80), e50168, doi:10.3791/50168 (2013).

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