Summary
Celltillväxttakten är en reglerad process och en primär faktor för cellfysiologi. Kontinuerlig odling använder kemostater möjliggör yttre kontroll av celltillväxthastigheten av näringsbegränsning underlättar studier av molekylära nätverk som styr celltillväxt och hur dessa nätverk utvecklas för att optimera celltillväxt.
Abstract
Celler reglera sin tillväxt som svar på signaler från den yttre världen. När cellen växer, måste olika cellulära processer samordnas inklusive makromolekylär syntes, metabolism och slutligen engagemang för celldelningscykeln. Den kemostat, en metod att experimentellt kontrollera celltillväxttakt, ger ett kraftfullt medel för att systematiskt studera hur tillväxttakten påverkar cellulära processer - inklusive genuttryck och ämnesomsättning - och de regulatoriska nätverk som styr graden av celltillväxt. När bibehållas för hundratals generationer kemostater kan användas för att studera adaptiv evolution av mikrober i miljöförhållanden som begränsar celltillväxt. Vi beskriver principen om kemostat kulturer, visa sin verksamhet och ger exempel på deras olika tillämpningar. Efter en period av glömska efter att de infördes i mitten av nittonhundratalet, sammansmältningen av genomet skala metoder med en förnyadesIntresset i regleringen av celltillväxt och den molekylära grunden för adaptiv evolution stimulerar en renässans i användningen av kemostater i biologisk forskning.
Introduction
Tillväxten av celler regleras av komplexa nätverk av samverkande genetiska faktorer och miljöfaktorer 1,2. Den multifaktoriella reglering av celltillväxt kräver ett synsätt på systemnivå för sin studie. Emellertid är noggrann studie av reglerad celltillväxt utmanas av svårigheten att experimentellt styra den hastighet med vilken celler växer. Dessutom, även i de enklaste experimenten cellulära villkor är ofta dynamiska och komplexa som celler förändrar kontinuerligt sin omgivning som de föröka sig. En lösning på dessa problem ges av kemostat: en metod för att odla celler som möjliggör experimentell kontroll av celltillväxttakten i definierade, invarianta och kontrollerade miljöer.
Metoden för kontinuerlig odling med hjälp av en kemostat blev självständigt beskrivits av Monod 3 och Novick & Szilard 4 1950. Som ursprungligen tänkt, celler odlas i en bestämd volym av media som är konnuerligt utspädd genom tillägg av nya medier och samtidigt avlägsnande av gamla medier och celler (Figur 1). Kopplade ordinära differentialekvationer (figur 2) beskriver ändringstakten i celldensitet (x) och den koncentration av ett tillväxtbegränsande näringsämne (n) i kemostat kärlet. Viktigt är detta ekvationssystem förutspår en enda (skilt från noll) stabila steady-state (Figur 3) med den märkliga konsekvensen att vid steady-state, är lika med den hastighet den specifika tillväxthastigheten av cellerna (dvs. den exponentiella tillväxten konstant) vid vilken kulturen späds (D). Genom att variera utspädningsförhållandet är det möjligt att etablera steady-state-populationer av celler vid olika tillväxthastigheter och under olika förhållanden av näringsbegränsning.
Den experimentella kontrollen av tillväxten med hjälp kemostater var avgörande för utvecklingen av en förståelse för hur cellfysiologi förändringarmed tillväxttakten 5,6. Men detta tidigare stöttepelare av mikrobiologiska metoder blev alltmer oklar under explosionen i molekylärbiologisk forskning under slutet av nittonhundratalet. Idag har förnyat intresse för tillväxtkontroll i både mikrober och flercelliga organismer och tillkomsten av genomet skala metoder för system-nivå analys förnyad motivation för användningen av kemostater. Här beskriver vi tre program som kapitalisera på den precisa kontrollen av celltillväxttakt och den yttre miljön som är unikt är möjligt med hjälp av kemostater. Först beskriver vi användandet av kemostater att undersöka hur det överflöd av tusentals biomolekyler - såsom betyg och metaboliter - är koordinerat regleras med tillväxt. För det andra beskrivs hur kemostater kan användas för att få exakta beräkningar av tillväxtdifferenser mellan olika genotyper i näringsbegränsade miljöer med hjälp av konkurrensexperiment. För det tredje, vi beskriva hur kemostater kananvändas för att studera adaptiv evolution av celler som växer i konstant näringsfattiga miljöer. Dessa exempel exemplifierar de sätt på vilka kemostater som möjliggör undersökningar system nivå av celltillväxtreglering, gen genom samspel med miljön och adaptiv evolution.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Principen om kontinuerlig odling med hjälp av en kemostat kan realiseras på flera olika implementationer. I alla kemostater är det viktigt att ha en) metoder för att upprätthålla sterilitet av alla komponenter, 2) en väl blandad kultur, 3) lämplig luftning av odlingskärlet och 4) en tillförlitlig medie tillägg och kultur borttagning. Här beskriver vi användningen av en Sixfors bioreaktor (Infors Inc) som en kemostat med användning av metoder som lätt kan anpassas till alternativa inställningar.
1. Montering av kemostaten Fartyg
- Slå på Sixfors med huvudströmbrytaren.
- Skölj kemostat kärlet, omrörare montering, och fäst slangen med avjoniserat (DI) vatten. Kontrollera alla slangar och o-ringar och byt slitna ser bitar.
- Se till drivaxeln stödbas är vänd uppåt i glaskärlet och att den övre delen av drivaxeln är snäppt in i dess hölje på omröraren montering. Ställ stirrer montering i glaskärlet säkerställa botten av drivaxeln är placerad i drivaxeln stöd. Använd klämman för att fästa omröraren monteringen i glaskärl.
- Fyll kärlet med cirka 300 ml avjoniserat vatten.
- Ta bort locken från ett löst syre (DO 2) sond och kontrollera vätskenivån genom att skruva loss bottenhöljet och se till att den undre höljet är fyllt till hälften med elektrolytlösning. Rescrew botten höljet och sätt in i porten på kemostat kärlet. Skruva till för hand.
- Ta en pH-sond och ta bort den från dess lagringsbuffert (3 M KCl). Ta av pH-sonden locket och fäst till fermentorn 1. Använda Sixfors kontrollskärmen navigerar du till jäsningsparametermenyn och välj "kalibrera pH". Placera pH-sond i en standard pH 7 buffert och spela läsning som hög Läs. Upprepa med pH 4 buffert och spela läsning som låg Läs. Lossa pH-sonden från fermentorn, tvätta med avjoniserat vatten och för in sonden into porten på kemostat kärlet. Skruva till för hand.
- Placera kemostat fartyget i racket. Notera på det fartyg som jäsnings (1-6) pH-sonden var ansluten till och kalibreras. Placera pH-sond locket på pH-proben. Med hjälp av folie tätt täcka upp i DO 2 sonden.
- Vik folien över ändarna på slangen fäst till kemostat kärlet.
- Upprepa steg 1,2-1,8 för alla fartyg.
- Sterilisera fartygen genom autoklavering dem i 15 min på en flytande cykel.
2. Förbereda media
- Upprätta den begränsande koncentrationsområde för ett näringsämne genom att växa satskulturer i olika näringshalter. Närings är begränsande i området där den slutliga celldensiteten är en linjär funktion av den initiala koncentrationen av näringsämnen (Figur 4). Välj en näringskoncentration väl inom den begränsande intervall. Exempel på standardmediesammansättning för studier med Saccharomyces cerevisiae är tillgängliga i 7-11.
- Autoklav en tom damejeanne som är täckt med en gummiplugg med ett luftintag och utlopp media efter att först se till att slutet av mediaslangen är täckt av folie.
- I ett separat kärl förbereda 10 L av medium.
- Fäst en 500 ml filterkoppen till en 100 ml medium flaska. Ta ut bomullsfiltret med pincett steriliserade i etanol och omedelbart fäster filtrerings porten på mediadamejeanne.
- Fäst media damejeanne till en vakuumkälla och filter sterilisera media genom att lägga till filterkoppen.
- När filtrering av media är klar, stäng av filtrerings hamn med en metallklämma.
3. Kalibrera DO 2 sonder och Installera kemostat
- Efter kemostat fartyg har autoklaveras och svalna plats fartyget i dess motsvarande värmejacka. Anslut temperatursonden, pH-sond, och DO 2 sond. Låtfartyg sitter med strömmen på i minst 6 timmar för att låta göra 2 givare att polarisera.
- Placera änden av varje utflödesröret in i en separat uppsamlingsbehållare. Anslut lufttillförseln via en autoklav filter och slå på luftflödet. Vattnet i varje kärl bör flöda ut ur utloppsrören, vilket indikerar att alla tätningar är korrekt bildade.
- Justera höjden av utloppet röret enligt den önskade arbetsvolym (t.ex. 300 ml). Vi använder en linjal som är märkt med rör placeringar kalibrerade för olika arbetsvolymer.
- Anslut mediadamejeanne till kemostat kärlet. Använd etanol i syfte att hålla rörändarna så steril som möjligt. Trä pumpslangen genom pumpen och öppna klämman. Tryck manuellt pumpen tills media börjar att strömma in i kemostat kärlet. Lossa slangen från pumpen, bör media flöda fritt in i kemostat kärl. När mediet når avloppsröret, sätt tillbaka slangen till pumpen och klämma.
- Börja running grundprogrammet med löphjul inställd på 400 varv per minut och temperaturen inställd på 30 ° C.
- För att kalibrera göra två prober, stäng av lufttillförseln och växla till kvävgas. Vänta i minst en timme och registrera mätvärde som "låg lästa". Byt tillbaka till lufttillförsel (dvs. innehåller omgivande syrehalt), vänta åtminstone ytterligare en timme och spela mätning som "hög läsning".
- Initiera dataregistrering med hjälp av Iris programvara.
4. Inokulering
- Använd 70% etanol för att sterilisera den övre delen av odlingskärlet.
- Ta bort skruven på fartyg topp och pipett 1 ml av en övernattskultur i kemostat kärlet. Dra åt skruven.
- Ange tiden för ympning i Iris.
- Vänta cirka 24 timmar för kulturer att nå tidig stationär fas. När kulturen växer, kommer löst syre och pH-värdet minskar. I fallet med glukos-begränsande media, kommer löst syre att återgå till ~ 100% i stationärt phase. För andra begränsningar närings löst syre kvar <100% i stationär fas.
5. Initiera Pumpar och uppnå Steady State
- Utspädningshastigheten beräknas genom att dividera den flödeshastighet (hur mycket media strömmar in i kärlet per timme) av odlingsvolymen. Till exempel, med användning av en volym av 300 ml en utspädningshastighet av 0,1 betyder att 30 ml medium tillsätts till odlings varje timme. Eftersom systemet är under positivt tryck med samma volym tas bort från kärlet säkerställa att kulturen kontinuerligt utspädd. En rad utspädningsgrader (D) kan användas som inte överstiger den maximala tillväxthastigheten (μ max) av cellerna, över vilka celler som ska tvättas ur kemostat.
- Välj pumpinställningar, som anger antalet sekunder pumpen är på och av, för att fastställa önskat flöde. Pumpen levererar media med en hastighet av ~ 0,11 ml / sek.
- Definiera ett program med Sixfors interface som anger pumpens timing, temperatur och rotorns varvtal. Starta programmet.
- Töm uppsamlingskärl för vätska och registrera tiden.
- Efter minst två timmar, använd en graderad cylinder för att mäta hur mycket du har tagit ut från fartyget. Detta kommer att vara lika med volymen som har lagts till i kemostat kärlet. Beräkna utspädningshastigheten (D = V utflöde / V kultur / tid). Justera pumpinställningar om beräknad utspädningshastigheten inte matchar önskad utspädningshastighet.
- Vid steady state, gör celltäthet i kemostat inte förändras över tiden. Detta kan mätas utan att störa den kultur genom provtagning av utflöde. Vi definierar operativt uppnå steady state som identiska mätningar celltäthet som är separerade med minst en befolknings fördubbling. Att nå steady state tar ungefär åtta kultur generationer efter initiering av kultur utspädning. Vid steady state, celler växer exponentiellt (i.e. konstant tillväxttakt över tiden) i näringsbegränsade förhållanden. Dubbleringstiden av befolkningen (generationstid) är ln (2) / D.
- Fortsätt att periodiskt mäta utflödesvolymen under hela experimentet för att säkerställa att en konstant utspädningshastighet upprätthålls.
6. Tillämpning 1: Att studera celler som växer i olika takt i stationära förhållanden
- Vid steady state i kemostat, är tillväxten av befolkningen av celler som motsvarar utspädningshastigheten. Genom att systematiskt förändra utspädningshastighet är det möjligt att odla celler med olika hastigheter. Detta möjliggör en systematisk studie av fysiologiska parametrar som varierar med tillväxten inklusive cellvolym, cellcykel scen och stresstålighet. Dessutom kan steady-state-profiler av globala mRNA, protein och metabolitnivåer analyseras i celler som växer i olika takt. Det finns två sätt att skaffa prover:
- Små prover kan vara passivt obupprätthållas genom att placera änden av utloppet röret i ett 1,5 ml eller 15 ml rör. Ett prov av 1 till 5 ml kan erhållas inom några minuter (beroende på flödeshastigheten). Många fysiologiska parametrar kan mätas från dessa prover.
- Genuttryck, eller metabolit analyser kräver större prov som måste erhållas så fort som möjligt. Placera änden av utloppet rör i ett 15 ml koniskt rör. Lossa skruven som håller metall änden av avloppsröret och tryck ner försiktigt. En ~ 10 ml prov kommer snabbt fylla din tub. Tänk på att volymen i kemostat fartyget har förändrats. Om många på varandra följande prover tas kan det vara nödvändigt att minska flödet för att bibehålla en konstant utspädningshastighet.
7. Applikation 2: Exakt Mätning av skillnader i tillväxttakt mellan olika genotyper i kontrollerade miljöer med hjälp av flödescytometri konkurrens Analyser
- Kemostater kan användas för att exakt kvantifiera effekten av koncentrationen av näringsämnenpå skillnader i tillväxttakt (dvs. fitness) mellan olika genetisk bakgrund. Genom co-odling stammar märkta med olika fluorescerande proteiner förändringstakten i relativt gott under exponentiell tillväxt bestäms. Att utföra denna analys vid olika utspädningsgrader (D) tillåter studier av effekterna av koncentrationen av näringsämnen (er) på fitness skillnader.
- Upprätta stationära kulturer av de två stammarna i separata kemostat fartyg med identiska utspädningshastigheter och en volym på 300 ml.
- Passivt prov 1 ml från varje kärl. Centrifugera ner cellerna återsuspendera i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och rum vid 4 ° C. Dessa prover innehåller homogena cellprover, vilka kontroller för den efterföljande flödescytometri analys.
- Placera utflödesröret från ett kärl till en autoklaverad mätcylinder. Lossa skruven som håller metall änden av avloppsröret och tryck försiktigt nedåt för att driva ut celler från kemostat. Närvolymen nått 150 ml, återlämna metallen änden av utloppet röret till dess ursprungliga position (300 ml). Upprepa med det andra kärlet, med användning av en annan graderad cylinder.
- Använd 70% etanol för att bibehålla sterilitet under avlägsnande skruv på den övre delen av kemostat kärlet. Placera tratten i öppningen och häll 150 ml från den andra kulturen i kemostat kärlet. Dra åt skruven. Upprepa med det andra fartyget, med hjälp av den andra tratten. Varje kemostat kärl innehåller nu en blandning av de två stammarna.
- Skaffa en 1 ml prov från varje fartyg som använder passiv provtagning var 2-6 tim. Centrifugera ner cellerna återsuspendera i PBS och lagra vid 4 ° C. Fortsätt att ta prover för 2-3 dagar noga registrera tid varje prov togs.
- Vid slutet av försöket, låt ligga och späd proverna till ~ 2 x 10 6 celler / ml. Med hjälp av flödescytometri, mäta andelen av de två stammarna i varje prov. När båda stammarna växer exponentiellt, skillnaden relativ tillväxthastighetbestäms genom linjär regression av ln (strain1/strain2) mot tiden (mätt i generationer). Lutningen på regression är den proportionella skillnaden i tillväxttakt (dvs. lämplighet fördel) av en stam i förhållande till den andra.
- Som den blandade kulturen kan ta lite tid för att uppnå en ny steady-state kan tidiga tidpunkter passar dåligt till regression. Detta problem löses bäst genom att låta 2-3 generationer förflyta innan de börjar provtagning eller ta bort tidiga punkter som är tydliga avvikare. Omvänt, när en stam har konkurreras de andra uppgifterna inte längre är användbara och dessa punkter bör uteslutas.
8. Applikation 3: Experimentell Evolution
- Experimentell utveckling utförs i kemostater väljer för mutanter som ökade i fitness i näringsbegränsade miljö. Urval är vanligen över hundratals generationer.
- Upprätta en steady-state kemostat kultur med hjälp av en stamav känd genotyp (och helst känd arvsmassa) och ett definierat näringsbegränsning.
- För att upprätthålla en "fossila fynd" av anpassning befolkningen passivt prov kemostat var 2-3 dagar och förvara provet i 15% glycerol vid -80 ° C.
- Övervaka mediebehållaren och fylla på med nya medier som nödvändiga.
- Behåll den exponentiellt växande kultur för flera hundra generationer.
- Efter fullbordan av urvalsplåten ett prov av celler på fasta agarplattor. Efter att cellerna har vuxit till kolonier, plocka ideal prov av kolonier med användning av tandpetare och inokulera kloner in i individuella brunnar i en 96-brunnsplatta innehållande 100 | il medium. Låt klonala prover för att växa över natten, tillsätt 100 ìl av 30% glycerol och förvara i -80 ° C.
- Karaktärisera kloner av hela genom sekvensering och utföra fenotypiska analyser inklusive bedömning av kondition, med hjälp av en gemensam fluorescerande referensstam, som beskrivs i Application 2. </ Li>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En stor fördel med kemostater är förmågan att kontrollera tillväxthastigheten hos celler experimentellt genom variation av utspädningshastigheten. I knoppande jäst, Saccharomyces cerevisiae, morfologin hos en cell är informativ av dess fas i celldelningscykeln. Populationer med högre tillväxttakt innehålla en högre andel av aktivt delande celler såsom bestämdes genom att mäta fraktionen av ej knoppande celler (Figur 5A). Analyser av global-mRNA-expression i kemostat kulturer har visat att uttrycket av många gener som är differentiellt uttryckta som en funktion av tillväxthastigheten (fig. 5B och figur 5C).
Den relativa lämplighet för olika genotyper kan bestämmas genom att utföra konkurrensanalyser i kemostater användning av fluorescensmärkta celler och flödescytometri-analys (fig. 6A). Figur 6B visar ett representativt resultat i vilka en mutant stam var com tävlade mot en fluorescerande taggade vildtyp stam. I detta exempel har den muterade stammen en 40% tillväxt fördel per generation. Som jämförelse, tävlade en omärkt vildtyp stam mot fluorescerande taggade vildtyp stam skiljer sig inte i sin tillväxttakt.
Kemostater ger ett sätt att utöva en definierad och kontinuerlig selektivt tryck på celler. Hela genomet sekvensanalys kan användas för att identifiera förvärvade mutationer i celler med ökad kondition. Adaptiva evolution experiment i jästceller i olika närings begränsade kemostater har identifierat antal kopior varianter som en frekvent och upprepad mekanism genom vilken adaptiva mutationer genereras. Till exempel, i oberoende adaptiv evolution experiment utförda i kvävebegränsad kemostater med användning av olika kvävekällor, flertal kopietal varianter (CNVs) som inkluderar gap1 genen identifierades 11 (figur 7).
t "> kemostater pose några unika utmaningar som inte på annat sätt förekommer i vanliga mikrobiologiska metoder. Möjliga problem och lösningar som är specifika för kemostat experiment återfinns i tabell 1.
Figur 1. Diagram av ett kemostat. Den kemostat består av en mediebehållare, pump, en kemostat kärl, en avloppsröret, och en uppsamlingsbehållare.
Figur 2. Matematisk modell av kemostat. Differential ekvation 1 beskriver förändringar i celldensitet (x) i den kemostat över tiden, vilket är ett resultat av celltillväxt och cell avlägsnande genom utspädning (celldöd antas vara försumbar). Monod föreslog 3 att celltillväxt (μ) är beroendes på koncentration extern näringsämne enligt en Michaelis-Menten-typ relation som inbegriper variablerna i maximal tillväxthastighet (μ max) och en halv-maximal tillväxt hastighetskonstant (K s). Utspädningshastigheten (D) bestäms av hastigheten för mediumtillsats och kultur borttagning. Differential ekvation 2 beskriver ändringshastigheten i det begränsande näringsämnet koncentration (er) i den kemostat kärlet. Förändringen av koncentrationen av det begränsande näringsämnet i kemostat kärlet är beroende av dess koncentration i det inströmmande mediet (R), dess utspädning av utflöde (D) och konsumtion av de celler, som är beroende av cellparametrarna μ max, K s och en sträck konstant, Y. För att förenkla, är Y antas vara konstant vid olika tillväxttakter. Variablerna och deras typiska enheter, i de kopplade ordinära differentialekvationer är x - cell hålorhet (celler / ml), s - begränsande näringsämne koncentration (pM), μ max - maximal tillväxthastighet (hr -1), K s - näringsämne koncentration vid vilken tillväxthastigheten är lika med μ max / 2 (^ M), Y - utbyte (celler / ml / xM), D - utspädningshastighet (h -1), R - koncentrationen av näringsämnen i medium reservoar (iM).
Figur 3. Förhållningssätt till steady-state som förutspåtts av den matematiska modellen. Närings koncentration (röd) och celltäthet (blå) uppnå icke-noll stadiga stater.
Figur 4. Etablera den begränsande utbud av ett näringsämne. Saccharomyces cerevisiae odlades vid olika koncentrationer av glukos och den slutliga densiteten bestämdes. Ett linjärt förhållande indikerar att koncentrationen av näringsämnen är i det begränsande intervall.
Tabell 1. Tabell över potentiella problem och lösningar. 
Figur 5. Cellfysiologi varierar med tillväxten. Den kemostat möjliggör kontrollerade studier av sambandet mellan tillväxt och A) celldelning som analyseras utifrån cellen morfologi (dvs den fraktion av ympade celler). Överflödet av ~ 25% av jäst mRNA beror på tillväxten: till exempel genen B) UTR2 ökningar i uttryck som ökar tillväxten i både glukos-(o) och kvävebegränsad (Δ) kemostater och genen C) ASM1 minskar i uttrycksnivå som ökar tillväxten i glukos-(o) och kvävebegränsad (Δ) kemostater 10. 
Figur 6. Sila konkurrensanalyser i kemostater. A) Två stammar som differentiellt märkta av konstitutivt uttryckta fluorescerande proteiner är co-odlade i en enda kemostat och förändringstakten i den relativa förekomsten av de två stammarna bestäms var 2-4 generationer med hjälp av flödescytometri. B) Den relativa fitness av en stam bestäms genom linjär regression av den naturliga logaritmen (ln) för ratio av de två stammarna mot tiden mätt i generationer. Klicka här för att visa en större bild . 
Figur 7. Långsiktig val i kemostater väljer effektivt för mutanter med ökad kondition. Genome-skala analys av mutanter har identifierat täta kromosomala omdisponeringar och antalet exemplar variation (CNV) i mutanter med ökad kondition. Oberoende adaptiv evolution experiment i olika kvävebegränsande förhållanden leder till val för olika CNV alleler vid gap1 locus (demarked av gråa streckade linjer), som kodar för den allmänna aminosyran permeas. Varje datapunkt är förhållandet mellan antalet DNA-kopior i den evolverade stammen jämfört med encestral stam mäts med hjälp av en DNA microarray som samtidigt analyserar varje gen (svart). Problem Lösning Lågt pH i odlingskärlet. pH kan övervakas i realtid och styras genom automatiserad tillsats av syra / bas. Alternativt kan buffrade medier användas. Flockningsmedel celler och biofilm i odlingskärl. Håll kulturen väl blandat genom att köra rotorn vid> 400 rpm. Tillväxten i media matningsledningar. Användningen av filter vid inloppet minskar risken för kolonisering av mediematningsledningar. Cell synkronisering och stabila DO 2 svängningar in kol begränsade kemostater. Dessa kan undvikas genom användning av högre utspädningshastigheter och undvikande av långvariga perioder av svält innan initiering av kulturen utspädning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kemostater möjliggör odling av mikrober i tillväxtreglerade stationära förhållanden. Cellerna växer kontinuerligt med en konstant hastighet som resulterar i en invariant yttre miljön. Detta står i kontrast till satskulturmetoder i vilka den yttre miljön förändras kontinuerligt och hastigheten för celltillväxt bestäms av det komplexa samspelet mellan miljön och genotyp. Således är en stor fördel att odla mikrober i kemostater över satskulturer förmågan att experimentellt styra tillväxthastigheten hos cellerna.
Den hastighet med vilken en cell växer är resultatet av interaktioner mellan otaliga cellulära processer, inklusive närings avkänning, signaltransduktion, makromolekylära syntes och metabolism. Använda kemostater i kombination med globala analysmetoder möjliggör undersökning av hur tillväxttakten effekter grundläggande processer i cellen och omvänt hur cellen reglerar och samordnar cellulär process meddess tillväxttakt. Studier i vildtyp-celler har visat att cellulära koncentrationer av RNA och protein är djupt påverkas av hastigheter av celltillväxt 6 och på senare tid har det visats att transkriptom 10,12,13 och metabolomen 8 dramatiskt påverkas av celltillväxttakter.
Studiet av mutant beteende i kemostater ger ett potentiellt kraftfullt medel för att studera de vägar som är viktiga för tillväxten reglering 14. Med hjälp av hög genomströmning sekvensering av molekylära streckkodade samlingar av tusentals mutanter 15 är det nu möjligt att multiplexa dessa analyser som möjliggör systematiska studier av de genetiska kraven för tillväxt i näringsbegränsade miljöer. Det bör dock noteras, att en av de begränsningar av kemostater är att de inte tar hänsyn till bakomliggande heterogenitet i enskilda celltillväxttakt som kan bedömas med hjälp av enkla cell mikroskopimetoder 16.
11,17-20 utlovas att förstå den funktionella grunden för adaptiv evolution.
Kemostater används alltmer inom nya forskningsområden, inklusive studier av transkriptions dynamik 21,22 och metabola svängningar 23-26. Deras ansökan i ekologi har visat sig användbar i studiet av predator-bytesdynamik 27. Ett förnyat intresse för däggdjurscelltillväxtreglering, och dess försämring i mänskliga sjukdomar, kan motivera en återgång till study av däggdjursceller in kemostater som använder celler som kan odlas i suspension 28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av start fonder från New York University. Vi tackar Maitreya Dunham och Matt Brauer som ursprungligen utvecklades användningen av Sixfors bioreaktorer som kemostater.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Infors-HT Sixfors Chemostat | Appropriate Technical Resources, Inc. | ||
| Glass Bottle 9.5 L | Fisher Scientific | 02-887-1 | For Media Vessel and Hosing |
| Pinchcock | Fisher Scientific | 05-867 | For Media Vessel and Hosing |
| Stopper, Size 12, Green Neoprene | Cole-Palmer | EW-62991-42 | For Media Vessel and Hosing |
| Straight Connector | Cole-Palmer | EW-30703-02 | For Media Vessel and Hosing |
| General purpose ties 4 in | Fisher Scientific | NC9557052 | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone Rubber | Small Parts | B000FMWTDE | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone, 3/8 in OD | Fisher Scientific | 02-587-1Q | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone, 7/32 in OD | Fisher Scientific | 02-587-1E | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Stainless Steel, 3/16 in OD | McMaster-Carr | 6100K164 | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Stainless Steel, 3/8 in OD | McMaster-Carr | 6100K161 | For Media Vessel and Hosing |
| Hook Connectors | Fisher Scientific | 14-66-18Q | For Media Vessel and Hosing |
| Ratchet Clamp | Cole-Palmer | EW-06403-11 | For Media Vessel and Hosing |
| Luer, Female | Cole-Palmer | EW-45512-34 | For Media Vessel and Hosing |
| Luer, Male | Cole-Palmer | EW-45513-04 | For Media Vessel and Hosing |
| Millipore Aervent MTGR05010 62 mm Filter, 0.2 μm | Fisher Scientific | MTGR05010 | For Media Vessel and Hosing |
| PTFE Acrodisc CR 13 mm filters, 0.2 μm | Fisher Scientific | NC9131037 | For Media Vessel and Hosing |
| Direct-Reading Flowtube for Air | Cole-Palmer | EW-32047-77 | For Nitrogen Gas Setup |
| Direct-Reading Flowtube for Nitrogen | Cole-Palmer | EW-32048-63 | For Nitrogen Gas Setup |
| Gas Proportioner Multitube Frames | Cole-Palmer | EW-03218-50 | For Nitrogen Gas Setup |
| Regulator, Two-Stage Analytical | Airgas | Y12-N145D580 | For Nitrogen Gas Setup |
| Hose Adaptor, Stainless Steel | Airgas | Y99-26450 | For Nitrogen Gas Setup |
| Hose Male Adaptor | Airgas | WES544 | For Nitrogen Gas Setup |
| Norprene Tubing | US Plastics | 57280 | For Nitrogen Gas Setup |
| Tripod Base | Cole-Palmer | EW-03218-58 | For Nitrogen Gas Setup |
| Valve Cartridges | Cole-Palmer | EW-03217-92 | For Nitrogen Gas Setup |
| Carboy 10 L | Fisher Scientific | 02-963-2A | For Media Preperation |
| Steritop Sterile Vacuum Bottle-Top Filters, 1,000 ml, PES membrane; for 45 mm neck size | Fisher Scientific | SCGP-T10-RE | For Media Preperation |
| Media Bottle 100 ml, 45 mm neck size | Fisher Scientific | FB-800-100 | For Media Preperation |
| calcium chloride·2H2O | Fisher Scientific | C79-500 | Media Reagents |
| sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | Media Reagents |
| magnesium sulfate·7H2O | Sigma Aldrich | 230391 | Media Reagents |
| potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | AC424205000 | Media Reagents |
| ammonium sulfate | Fisher Scientific | AC423400010 | Media Reagents |
| potassium chloride | Sigma Aldrich | P9541 | Media Reagents |
| boric acid | Sigma Aldrich | B6768 | Media Reagents |
| copper sulfate·5H2O | Sigma Aldrich | 209198 | Media Reagents |
| potassium iodide | Sigma Aldrich | 60400 | Media Reagents |
| ferric chloride·6H2O | Fisher Scientific | I88-100 | Media Reagents |
| manganese sulfate·H2O | Sigma Aldrich | 230391 | Media Reagents |
| sodium molybdate·2H2O | Sigma Aldrich | M7634 | Media Reagents |
| zinc sulfate·7H2O | Fisher Scientific | Z68-500 | Media Reagents |
| biotin | Fisher Scientific | BP232-1 | Media Reagents |
| calcium pantothenate | Fisher Scientific | AC24330-1000 | Media Reagents |
| folic acid | Sigma Aldrich | F7876 | Media Reagents |
| inositol (aka myo-inositol) | Fisher Scientific | AC12226-1000 | Media Reagents |
| niacin (aka nicotinic acid) | Sigma Aldrich | N4126 | Media Reagents |
| p-aminobenzoic acid | Fisher Scientific | AC14621-2500 | Media Reagents |
| pyridoxine HCl | Sigma Aldrich | P9755 | Media Reagents |
| riboflavin | Sigma Aldrich | R4500-25G | Media Reagents |
| thiamine HCl | Fisher Scientific | BP892-100 | Media Reagents |
| Leucine | Sigma Aldrich | L8000-100G | Media Reagents |
| Uracil | Sigma Aldrich | U0750 | Media Reagents |
| Dextrose | Fisher Scientific | DF0155-08-5 | Media Reagents |
References
- Ingraham, J. L., Maaloe, O., Neidhardt, F. C. Growth of the Bacterial Cell. , Sinauer Associates, Inc. (1983).
- Cell Growth: Control of Cell Size. Hall, M. N., Raff, M. C., Thomas, G. , CSHL Press. (2004).
- Monod, J. La technique de culture continue, theorie et applications. Ann. Inst. Pasteur. 79, 390-410 (1950).
- Novick, A., Szilard, L.
- Kjeldgaard, N. O., Maaloe, O., Schaechter, M. The transition between different physiological states during balanced growth of Salmonella typhimurium. J. Gen. Microbiol. 19, 607-616 (1958).
- Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. Control of macromolecular synthesis. , W.A. Benjamin. (1966).
- Saldanha, A. J., Brauer, M. J., Botstein, D. Nutritional Homeostasis in Batch and Steady-State. Culture of Yeast. Mol. Biol. Cell. 15, 4089-4104 (2004).
- Boer, V. M., Crutchfield, C. A., Bradley, P. H., Botstein, D., Rabinowitz, J. D. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Mol. Biol. Cell. 21, 198-211 (2010).
- Boer, V. M., de Winde, J. H., Pronk, J. T., Piper, M. D. The genome-wide transcriptional responses of Saccharomyces cerevisiae grown on glucose in aerobic chemostat cultures limited for carbon, nitrogen, phosphorus, or sulfur. J. Biol. Chem. 278, 3265-3274 (2003).
- Brauer, M. J., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Mol. Biol. Cell. 19, 352-367 (2008).
- Gresham, D., et al. Adaptation to diverse nitrogen-limited environments by deletion or extrachromosomal element formation of the GAP1 locus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 18551-18556 (2010).
- Regenberg, B., et al. Growth-rate regulated genes have profound impact on interpretation of transcriptome profiling in Saccharomyces cerevisiae. Genome Biol. 7, R107 (2006).
- Castrillo, J. I., et al. Growth control of the eukaryote cell: a systems biology study in yeast. J. Biol. 6, 4 (2007).
- Cipollina, C., et al. Revisiting the role of yeast Sfp1 in ribosome biogenesis and cell size control: a chemostat study. Microbiology. 154, 337-346 (2008).
- Gresham, D., et al. System-level analysis of genes and functions affecting survival during nutrient starvation in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 187, 299-317 (2011).
- Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant. PLoS Biol. 10, e1001325 (2012).
- Kao, K. C., Sherlock, G. Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae. Nat. Genet. 40, 1499-1504 (2008).
- Gresham, D., et al. The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoS Genet. 4, e1000303 (2008).
- Wenger, J. W., et al. Hunger Artists: Yeast Adapted to Carbon Limitation Show Trade-Offs under Carbon Sufficiency. PLoS Genet. 7, e1002202 (2011).
- Dunham, M. J., et al. Characteristic genome rearrangements in experimental evolution of Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16144-16149 (2002).
- Ronen, M., Botstein, D. Transcriptional response of steady-state yeast cultures to transient perturbations in carbon source. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 389-394 (2006).
- Kresnowati, M. T. A. P., et al. When transcriptome meets metabolome: fast cellular responses of yeast to sudden relief of glucose limitation. Mol. Sys. Biol. 2, 49 (2006).
- Tu, B. P., Kudlicki, A., Rowicka, M., McKnight, S. L. Logic of the yeast metabolic cycle: temporal compartmentalization of cellular processes. Science. 310, 1152-1158 (2005).
- Tzur, A., Kafri, R., LeBleu, V. S., Lahav, G., Kirschner, M. W. Cell Growth and Size Homeostasis in Proliferating Animal Cells. Science. 325, 167-171 (2009).
- Conlon, I., Raff, M.
- Conlon, I. J., Dunn, G. A., Mudge, A. W., Raff, M. C.
- Fussmann, G. F., Ellner, S. P., Shertzer, K. W., Hairston, N. G. Crossing the hopf bifurcation in a live predator-prey system. Science. 290, 1358-1360 (2000).
- Cohen, E. P., Eagle, H. A simplified chemostat for the growth of mammalian cells: characteristics of cell growth in continuous culture. J. Exp. Med. 113, 467-474 (1961).
