Summary
Cell vækstrate er en reguleret proces, og en primær faktor for celle fysiologi. Kontinuerlig dyrkning ved hjælp kemostater muliggør ydre kontrol af cellevækst sats ved næringssaltbegrænsning lette studiet af molekylære netværk, der styrer cellevækst og hvordan disse net udvikler sig til at optimere cellevækst.
Abstract
Celler regulere deres vækst som reaktion på signaler fra den ydre verden. Som cellen vokser, skal forskellige cellulære processer koordineres herunder makromolekylær syntese, metabolisme og i sidste ende engagement celledelingscyklussen. Kemostaten, en metode til eksperimentelt kontrollerende celle vækst, giver et stærkt middel til systematisk at studere, hvordan vækstrate påvirker cellulære processer - herunder genekspression og stofskifte - og de regulerende netværk, der styrer hastigheden af cellevækst. Når opretholdes for hundreder af generationer kemostater kan bruges til at studere adaptive evolution af mikrober i miljøforhold, der begrænser cellevækst. Vi beskriver princippet om kemostat kulturer demonstrere deres drift og give eksempler på deres forskellige applikationer. Efter en stilstandsperiode efter deres indførelse i midten af det tyvende århundrede, konvergensen af genomet-skala metoder med en fornyet irente i reguleringen af cellevækst og det molekylære grundlag for adaptiv evolution er stimulerende en renæssance i brugen af kemostater i biologisk forskning.
Introduction
Væksten af celler er reguleret af komplekse netværk af interagerende genetiske og miljømæssige faktorer 1,2. Den multifaktoriel regulering af cellevækst nødvendiggør en strategi system-niveau til sin undersøgelse. Men den nøje undersøgelse af regulerede cellevækst udfordret af vanskeligheden ved eksperimentelt at styre den hastighed, hvormed cellerne vokser. Endvidere i selv de simpleste forsøg ekstracellulære betingelser er ofte dynamisk og kompleks som celler kontinuerligt ændre deres omgivelser, som de formere sig. En løsning på disse problemer er leveret af kemostaten: en metode til dyrkning af celler, der muliggør eksperimentel kontrol af celle vækstrater i definerede, invariante og kontrollerede miljøer.
Metoden til kontinuerlig dyrkning ved hjælp af en kemostat blev selvstændigt beskrevet af Monod 3 og Novick & Szilard 4 i 1950. Som oprindeligt udtænkt dyrkes celler i en fast mængde medier, der er conbestandigt fortyndet ved tilsætning af nye medier og samtidig fjernelse af gamle medier og celler (figur 1). Koblede ordinære differentialligninger (figur 2) beskriver ændringen i celle densitet (x), og koncentrationen af en vækst-begrænsende næringsstof (fer) i kemostat fartøjet. Vigtigere er det, dette system af ligninger forudsiger en enkelt (ikke nul) stabil steady-state (Figur 3) med den bemærkelsesværdige konsekvenser, at ved steady-state, den specifikke væksthastighed af cellerne (dvs. den eksponentielle vækst konstant) er lig med den sats hvor kulturen fortyndet (D). Ved at variere fortyndingsforholdet er det muligt at etablere steady state populationer af celler ved forskellige vækstrater og under forskellige betingelser for næringssaltbegrænsning.
Den eksperimentelle styring af væksten ved hjælp kemostater var afgørende for udviklingen af en forståelse af, hvordan celle fysiologi ændringermed vækstrater 5,6. Men denne tidligere grundpille i mikrobiologiske metoder blev stadig mere uklar under eksplosionen i molekylærbiologisk forskning i slutningen af det tyvende århundrede. I dag har fornyet interesse i vækstkontrol i både mikrober og flercellede organismer og fremkomsten af genom-skala for systemer niveau analyse fornyet motivation for anvendelse af kemostater. Her beskriver vi tre ansøgninger, der udnytter den præcise styring af celle vækstrater, og det eksterne miljø, som er unikt muligt ved hjælp kemostater. Først, vi beskrive brugen af kemostater at undersøge, hvordan den overflod af tusindvis af biomolekyler - såsom udskrifter og metabolitter - er sideordnet reguleres med vækstrate. For det andet, vi beskriver, hvordan kemostater kan bruges til at indhente præcise estimater af vækst-rate forskelle mellem forskellige genotyper i næringsfattige begrænsede miljøer ved hjælp af konkurrence-eksperimenter. For det tredje, beskriver vi, hvordan kemostater kananvendes til at studere adaptive evolution af celler, der vokser i faste næringsfattige miljøer. Disse eksempler eksemplificerer de måder, hvorpå kemostater der muliggør undersøgelser af cellevækst regulering, gen af miljø interaktioner og adaptive evolution systemer niveau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Princippet om kontinuerlig dyrkning under anvendelse af en kemostat kan realiseres i en række forskellige implementeringer. I alle kemostater er det vigtigt at have 1) metoder til opretholdelse af sterilitet af alle komponenter, 2) et godt blandet kultur, 3) passende luftning af kultur fartøj og 4) en pålidelig hjælp af medier tilføjelse og fjernelse kultur. Her beskriver vi anvendelse af en Sixfors bioreaktor (Infors Inc) som en kemostat under anvendelse af fremgangsmåder, som let kan tilpasses til alternative opstillinger.
1.. Montering kemostaten Fartøjer
- Tænd Sixfors på hovedafbryderen.
- Skyl kemostat fartøj, omrører forsamling, og fastgjort slange med deioniseret (DI) vand. Kontroller alle slanger og O-ringe og udskift eventuelle slidte søger stykker.
- Sørg for, at drivakslen bagland vender opad i glasbeholder, og at den øverste del af drivakslen er klikket ind i sit hus på røreværktøjet forsamling. Indstil stirrer samling i glasbeholderen sikre bunden af drivakslen er lejret i drivakslen støtte. Brug klemmen for at fastgøre omrøreren fast på glasbeholder.
- Fylde karret med omkring 300 ml DI-vand.
- Fjern dækslerne fra et opløst ilt (DO 2) sonde og kontrollere elektrolyt niveau ved at skrue bunden huset og sørge for, at bunden huset er fyldt halvt op med elektrolyt-opløsning. Skru udtømningshætten bunden huset og indsætte i porten på kemostat fartøjet. Skru indtil fingrene.
- Tag en pH-sonde og fjerne det fra dets oplagring buffer (3 M KCL). Fjern pH-sonden hætte og tillægger fermentoren 1. Brug af Sixfors kontrol Naviger til fermentoren parameter menuen og vælg "kalibrere pH". Placer pH-sonden i en standard pH 7 buffer og optage læsning som High Read. Gentag med pH 4 buffer og optage læsning som Low Læs. Frigør pH-sonde fra fermenteringstanken, vask med DI vand og sæt sonden into porten på kemostat fartøjet. Skru indtil fingrene.
- Placer kemostat fartøj i racket. Bemærkning om det fartøj, som gaeringstanken (1-6) pH-sonden var tilsluttet og kalibreret. Placer pH-sonden hætten på pH-sonden. Brug folie stramt dække toppen af DO 2 sonden.
- Fold folien over enderne af røret er fastgjort til chemostaten fartøj.
- Gentag trin 1,2-1,8 for alle fartøjer.
- Sterilisere fartøjer ved autoklavering dem i 15 min på en flydende cyklus.
2. Forberedelse Medier
- Etablere den begrænsende koncentrationsområde for et næringsstof ved at dyrke batchkulturer i forskellige koncentrationer af næringsstoffer. Næringsstoffet er begrænsende i det område, hvor den endelige celledensitet er en lineær funktion af den initiale koncentration af næringsstoffer (figur 4). Vælg koncentrationen et næringsstof godt inden for den begrænsende rækkevidde. Eksempler på standard medier sammensætning til undersøgelser med Saccharomyces cerevisiae findes i 7-11.
- Autoklave en tom ballon, der er lukket med en gummiprop, der indeholder et luftindtag og medie efter først at sikre, at enden af medierne slangen er dækket med folie.
- I en separat beholder forberede 10 L medier.
- Vedhæft en 500 ml filter kop til en 100 ml media flaske. Fjern bomuld filter med en pincet steriliseret i ethanol og straks lægger på filtrering porten på medierne syreballon.
- Fastgør medierne ballon til en vakuumkilde og filter sterilisere medier ved at tilføje det til filteret kop.
- Når filtrering af medier er færdig, lukke filtrering port med en metalbøjle.
3. Kalibrering gøre 2 Probes og Opsætning kemostat
- Efter kemostaten fartøjer er blevet autoklaveres og afkøles ned sted skibet i dens tilsvarende varme jakke. Slut temperaturføler, pH-sonde, og gøre 2 sonde. Ladfartøj sidde med strøm på i mindst 6 timer at lade gøre 2 sonder til at polarisere.
- Anbring enden af hver spildevand rør i en separat indsamling beholder. Forbind lufttilførslen via en autoklaveret filter og tænd luftstrøm. Vandet i hvert fartøj skal flyde ud af spildevand rør, der angiver, at alle pakninger er korrekt dannet.
- Juster højden af udløbet rør ifølge den ønskede arbejdsvolumen (fx 300 ml). Vi bruger en lineal, der er markeret med rør placeringer kalibreret til forskellige arbejds mængder.
- Tilslut Media ballon til chemostaten fartøj. Brug ethanol for at holde røret ender sterilt som muligt. Før pumpen slange gennem pumpen og åbne klemme. Manuelt tryk på pumpen, indtil mediet begynder at strømme ind i kemostat fartøjet. Slip slangen fra pumpen, bør medier flyde frit ind chemostat fartøj. Når mediet når spildevand rør, vedhæfte slangen til pumpe og klemme.
- Start ruLønning det grundlæggende program med løbehjul sæt til 400 rpm, og temperaturen indstilles til 30 ° C.
- For at kalibrere gøre 2 sonder, slukke lufttilførsel, og skifte til nitrogengas. Vent mindst en time og optage foranstaltning værdi som "lav læst". Skift tilbage til luftforsyning (dvs. indeholdende omgivende iltkoncentration), vente mindst en yderligere time og optage målingen som "high læst".
- Igangsætte dataregistrering ved hjælp af Iris-software.
4.. Podning
- Brug 70% ethanol for at sterilisere toppen af dyrkningsbeholderen.
- Fjern skruen på skib top og pipette 1 ml af en kultur natten over i kemostat fartøjet. Spænd skruen.
- Angiv podningstidspunktet i Iris.
- Vent cirka 24 timer for kulturer til at nå tidlig stationær fase. Da kulturen vokser, vil opløst oxygen og pH falde. I tilfælde af glucose-begrænsende medier, vil opløst oxygen tilbage til ~ 100% i stationær phase. For andre begrænsninger næringsstoffer vil opløst ilt være <100% i stationær fase.
5.. Iværksættelse Pumper og nå Steady State
- Den fortynding beregnes ved at dividere strømningshastigheden (hvor meget medier flyder ind i fartøjet i timen) efter volumen kulturen. For eksempel ved anvendelse af et volumen på 300 ml en fortynding på 0,1 betyder, at 30 ml af mediet tilsættes til kulturen hver time. Da systemet er under positivt tryk samme volumen fjernes fra beholderen at sikre, at kulturen kontinuerligt fortyndes. En række udvanding satser (D) kan anvendes som ikke overstiger den maksimale vækstrate (μ max) af cellerne, over hvilken celler vil blive vasket ud af kemostaten.
- Vælg pumpeindstillinger, der angiver antallet af sekunder, pumpen er tændt og slukket, for at etablere den ønskede flow. Pumpen leverer medier med en hastighed på ~ 0,11 ml / sek.
- Definer et program ved hjælp af Sixfors interface der angiver pumpens timing, temperatur og impellor hastighed. Starte programmet.
- Tøm indsamler beholdere med væske og registrere tiden.
- Efter mindst to timer anvende en gradueret cylinder til at måle, hvor meget medier er blevet fjernet fra beholderen. Dette vil svare til den mængde, der er blevet føjet til kemostat fartøj. Beregn fortynding sats (D = V spildevand / V kultur / tid). Juster pumpeindstillinger hvis beregnede fortynding rate ikke passer ønskede fortynding sats.
- Ved steady state ikke celledensitet i chemostaten ikke ændre sig over tid. Dette kan måles uden at forskubbe kulturen ved prøveudtagning udstrømningen. Vi definerer driftsmæssigt steady state som identiske celle tæthed målinger, der er adskilt af mindst én befolkning fordobling. Nå steady state vil tage cirka otte kultur generationer efter initiering af kultur fortynding. Ved steady state celler vokser eksponentielt (i.e. konstant vækstrate over tid) i næringsstof-begrænsede betingelser. Fordoblingstiden af befolkningen (generation tid) er ln (2) / D.
- Fortsæt til periodisk at måle spildevand mængder for varigheden af forsøget på at sikre, at en konstant fortynding hastighed fastholdes.
6.. Anvendelse 1: At studere celler, der vokser i samme tempo i Steady-state betingelser
- Ved steady state i kemostaten, vækstraten i befolkningen af celler er lig med fortynding sats. Ved systematisk at ændre fortyndingshastighed er det muligt at dyrke celler ved forskellige hastigheder. Dette gør det muligt systematisk undersøgelse af fysiologiske parametre, der varierer med vækstraten herunder celle volumen, cellecyklus scenen og stress modstand. Desuden kan steady-state-profiler af global mRNA, protein og metabolit niveauer analyseres i celler, der vokser ved forskellige hastigheder. Der er to måder at erhverve prøver:
- Små prøver kan være passivt obopretholdes ved at placere enden af spildevand rør ind i en 1,5 ml eller 15 ml rør. En prøve af 1-5 ml kan opnås i et par minutter (afhængigt af vandgennemstrømning). Kan måles mange fysiologiske parametre fra disse prøver.
- Genekspression eller metabolit analyser kræver større prøver, der skal opnås så hurtigt som muligt. Placere enden af udløbet rør i en 15 ml konisk rør. Slip skruen, der holder metal enden af spildevand rør og skub forsigtigt ned. A ~ 10 ml prøve vil hurtigt fylde din tube. Husk på, at volumen i kemostat fartøjet har skiftet. Hvis der tages mange på hinanden følgende prøver kan det være nødvendigt at reducere strøm for at opretholde et konstant fortyndingsforhold.
7.. Anvendelse 2: præcis måling af forskelle i vækstrater mellem Genotyper i Controlled Environments anvendelse af flowcytometri-baserede Konkurrence Analyser
- Kemostater kan bruges til præcist at kvantificere virkningen af koncentrationen af næringsstofferpå forskelle i vækstrater (dvs. fitness) mellem forskellige genetiske baggrunde. Ved co-dyrkning stammer mærket med forskellige fluorescerende proteiner graden af ændring i relativ overflod under eksponentiel vækst bestemmes. Udførelse denne analyse ved forskellige fortyndingshastigheder (D) giver undersøgelsen af virkningerne af næringsstofkoncentrationen (r) på fitness forskelle.
- Etablere steady state kulturer af de to stammer i separate kemostat fartøjer med identiske udvanding satser og et volumen på 300 ml.
- Passivt prøve 1 ml fra hvert fartøj. Spin ned celler resuspenderes i phosphatbufret saltvand (PBS) og anbringes ved 4 ° C. Disse prøver indeholder homogene celleprøver, der er kontroller for den efterfølgende flowcytometri analyse.
- Placer spildevand rør fra et fartøj til et autoklaveret måleglas. Slip skruen, der holder metal enden af spildevand rør og skub forsigtigt ned for at bortvise celler fra kemostaten. Hvornårvolumen når 150 ml returnere metalende spildevandet røret til sin oprindelige position (300 ml). Gentag med den anden beholder ved hjælp af en anden måleglas.
- Brug 70% ethanol for at opretholde steriliteten samtidig fjerne skruen på toppen af chemostaten fartøjet. Placér tragten i åbningen og hæld 150 ml fra den anden kultur i kemostat fartøjet. Spænd skruen. Gentag med den anden beholder, ved hjælp af den anden tragt. Hver kemostat fartøj indeholder nu en blanding af de to stammer.
- Anskaf en 1 ml prøve fra hver beholder ved hjælp af passiv prøvetagning hver 2-6 time. Spin ned celler resuspenderes i PBS og opbevares ved 4 ° C. Fortsæt med at tage prøver til 2-3 dage nøje registrering af tid hver prøve blev taget.
- Ved afslutningen af forsøget soniker og fortyndes prøver til ~ 2 x 10 6 celler / ml. Ved hjælp af flowcytometri måle andelen af de to stammer i hver prøve. Da begge stammer vokser eksponentielt, den relative vækst forskel erbestemt ved lineær regression af ln (strain1/strain2) mod tiden (målt i generationer). Hældningen af regressionen er proportional forskel i væksthastighed (dvs. fitness fordel) af en stamme i forhold til den anden.
- Som den blandede kultur kan tage lidt tid til at nå en ny steady state, kan tidlig tidspunkter passer dårligt til regression. Dette problem løses bedst ved at lade 2-3 generationer at gå, før de påbegynder prøveudtagning eller fjerne tidlige punkter, som er tydelige outliers. Omvendt når en stamme har udkonkurreret de andre data ikke længere er nyttige, og disse punkter bør udelukkes.
8.. Applikation 3: Eksperimentel Evolution
- Eksperimentel udvikling udført i kemostater udvælger mutanter, der er steget i fitness i næringsstof-begrænset miljø. Selection er generelt udføres over hundreder af generationer.
- Etablere et steady state kemostatkultur hjælp af en stammeaf kendt genotype (og helst kendt genom sekvens) og en defineret næringsstof-begrænsning.
- At opretholde en "fossile record" af tilpasning befolkningen passivt prøve kemostat hver 2-3 dage, og prøven opbevares i 15% glycerol ved -80 ° C.
- Overvåg mediernes reservoir og genopbygge med friske medier som nødvendige.
- Fastholde den eksponentielt voksende kultur gennem flere hundrede generationer.
- Efter afslutning af udvælgelsen plade en prøve af celler på faste agarplader. Efter cellerne er dyrket i kolonier, vælge en neutral prøve af kolonier ved hjælp af tandstikkere podes kloner i individuelle brønde i en 96-brønds plade indeholdende 100 ul media. Tillad klonede prøver at vokse natten over, tilsættes 100 ul 30% glycerol og opbevares i -80 ° C.
- Karakterisere kloner af hele genomet sekventering og udføre fænotypiske analyser, herunder vurdering af egnethed, ved hjælp af en fælles fluorescensmærket henvisning stamme, som beskrevet i Anvendelse 2. </ Li>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En stor fordel ved kemostater er evnen til at kontrollere væksten af celler eksperimentelt ved at variere fortyndingsforholdet. I spirende gær, Saccharomyces cerevisiae, morfologien af en celle er informativ for fase celledelingscyklussen. Populationer med højere vækstrater indeholder en højere andel af aktivt delende celler som bestemt ved måling af fraktionen af knopskudte celler (figur 5A). Analyser af den globale mRNA-ekspression i kemostat kulturer har vist, at ekspressionen af mange gener differentielt udtrykt som en funktion af væksten (figur 5B og 5C).
Den relative egnethed forskellige genotyper kan bestemmes ved at udføre kompetitive assays i kemostater hjælp fluorescensmærkede celler og flowcytometri-analyse (figur 6A). Figur 6B viser et repræsentativt resultat, hvori en mutantstamme var com peted mod en fluorescens-mærkede vildtype-stamme. I dette eksempel mutantstammen har en 40% vækst fordel per generation. Til sammenligning et ukodet vildtype stamme konkurrerede mod fluorescens mærkede vildtype stammen adskiller sig ikke i sin vækstrate.
Kemostater er et middel til at udøve en veldefineret og konstant selektivt pres på celler. Hele genomet sekvens analyse kan anvendes til at identificere erhvervede mutationer i celler med øget fitness. Adaptive evolution eksperimenter i gærceller i forskellige næringsstoffer begrænsede kemostater har identificeret kopi nummer varianter som en hyppig og gentagen mekanisme, som adaptive mutationer er genereret. For eksempel i uafhængige adaptive evolution eksperimenter udført i nitrogen-begrænset kemostater hjælp af forskellige nitrogenkilder, flere kopital varianter (CNVs), som omfatter GAP1 genet blev identificeret 11 (figur 7).
t "> kemostater udgøre nogle unikke udfordringer, der ellers ikke forekommer i faste mikrobiologiske metoder. Potentielle problemer og løsninger, der er specifikke for kemostat eksperimenter kan findes i tabel 1.
Figur 1. Diagram over en kemostat. Kemostaten omfatter et medie reservoir, pumpe, en chemostat fartøj, en spildevand rør, og en opsamling beholder.
Figur 2. Matematisk model af chemostaten. Differential ligning 1 beskriver ændringen i celletæthed (x) i chemostaten over tid, hvilket er et resultat af cellevækst og cellefjernelse ved fortynding (celledød antages at være ubetydelige). Monod foreslog 3, at cellevækst (μ) afhængers på koncentrationen ekstern næringsstof ifølge en Michaelis-Menten typen relation, der indeholder variablerne maksimale vækstrate (μ max) og en halv-maksimal vækst hastighedskonstant (K s). Den fortynding rate (D) er bestemt af hastigheden af mediernes tilføjelse og fjernelse kultur. Differential ligning 2 beskriver ændringen i koncentrationen begrænsende næringsstof (fer) i kemostat fartøjet. Ændringen i koncentrationen af det begrænsende næringsstof i chemostaten fartøjet er afhængig af dens koncentration i den indstrømmende medier (R), dets fortynding af udstrømning (D) og forbrug af cellerne, som er afhængig af celleparametrene μ max, K s og et udbytte konstant, Y. For forenkling, er Y antages at være konstant på forskellige vækstrater. De variabler, og deres typiske enheder, i de koblede ordinære differentialligninger er x - celle hulerity (celler / ml), s - begrænsende næringsstofkoncentrationen (uM), μ max - maksimal vækst (t -1) K, s - næringsstofkoncentrationen ved hvilken væksten lig μ max / 2 (uM), Y - udbytte (celler / ml / uM), D - udvanding (HR -1), R - næringsstofkoncentration i medierne reservoir (uM).
Figur 3. Tilgang til steady state som forudsagt af den matematiske model. Nutrient koncentration (rød) og celletæthed (blå) nå ikke-nul stationære tilstande.
Figur 4.. Etablering af begrænsende rækkevidde af et næringsstof. Saccharomyces cerevisiae blev dyrket ved forskellige koncentrationer af glucose og den endelige tæthed bestemmes. En lineær sammenhæng viser, at koncentrationen af næringsstoffer i den begrænsende område.
Tabel 1. Tabel over potentielle problem og løsninger. 
Figur 5. Cellefysiologi varierer med vækstrate. Chemostaten muliggør kontrollerede undersøgelser af forholdet mellem vækstrate og A) celledeling som analyseret på basis af cellemorfologi (dvs. den fraktion af knopskudte celler). Den overflod af ~ 25% af gær mRNAs afhænger vækstraten: for eksempel genet B) UTR2 stigninger i udtryk som stiger væksten i både glucose (O) og kvælstof-begrænset (Δ) kemostater og genet C) ASM1 falder i udtryk niveau som væksten stiger i glukose-(O) og kvælstof-begrænset (Δ) kemostater 10. 
Figur 6. Strain konkurrence assays i kemostater. A) To stammer, der er forskelligt mærket af konstitutivt udtrykte fluorescerende proteiner er co-dyrket i et enkelt chemostat og hastigheden af ændringen i den relative forekomst af de to stammer bestemmes hver 2-4 generationer ved anvendelse af flowcytometri. B) Den relative egnethed af en stamme er bestemt ved lineær regression af naturlig log (ln) af ratificereto af de to stammer mod tiden målt i generationer. Klik her for at se større figur . 
Figur 7. Langsigtet udvælgelse i kemostater effektivt udvælger mutanter med øget fitness. Genom-skala analyse af mutanter har identificeret hyppige kromosomale omlejringer og kopiere nummer variation (CNV) i mutanter med øget fitness. Uafhængige adaptive evolution eksperimenter i forskellige nitrogen-begrænsende betingelser resulterer i udvælgelsen af forskellige CNV alleler på GAP1 locus (demarked af grå stiplede linjer), som koder for det generelle aminosyre permease. Hvert datapunkt er forholdet mellem DNA-kopital i den udviklede stamme sammenlignet med encestral stamme målt ved anvendelse af et DNA-mikroarray, der samtidig analyserer hvert gen (sort). Problem Opløsning Lav pH-værdi i dyrkningsbeholderen. pH kan overvåges i realtid og styres ved automatiseret tilsætning af syre / base. Alternativt kan pufrede medier anvendes. Flokkuleringsmiddel celler og biofilm i dyrkningsbeholderen. Hold kultur blandet godt ved at køre omrører ved> 400 rpm. Væksten i medierne foder linjer. Brugen af filtre på indgangsporten reducerer risikoen for kolonisering af medier foder linjer. Cellesynkronisering og stabile gøre 2 svingninger in carbon begrænsede kemostater. Disse kan undgås ved anvendelse af højere fortyndingshastigheder og undgå lange perioder med sult før initiering af kultur fortynding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kemostater muliggøre dyrkning af mikrober i vækst-kontrollerede steady-state betingelser. Cellerne vokser kontinuerligt ved en konstant hastighed resulterer i en invariant eksterne miljø. Dette er i modsætning til batch kultur metoder, hvor det eksterne miljø der konstant ændrer og hastigheden af cellevækst bestemmes af det komplekse samspil mellem miljø og genotype. Således er en stor fordel ved dyrkning af mikrober i kemostater flere batchkulturer er evnen til eksperimentelt at kontrollere væksten af celler.
Den hastighed, hvormed en celle vokser er et resultat af samspillet mellem myriader af cellulære processer, herunder næringsstoffer sensing, signaltransduktion, makromolekylære syntese og metabolisme. Brug kemostater i kombination med globale analysemetoder muliggør undersøgelse af, hvordan Vækstraten påvirkninger fundamentale processer i cellen og omvendt, hvordan cellen regulerer og koordinerer cellulær proces meddens vækstrate. Undersøgelser i vildtypeceller har vist, at cellulære koncentrationer af RNA og protein dybt er påvirket af satserne for cellevækst 6, og det er blevet vist for nylig, at transkriptom 10,12,13 og metabolomet 8 dramatisk påvirkes af celle vækstrater.
Studiet af mutant adfærd i kemostater giver et potentielt magtfuldt middel til at studere de veje, som er vigtige for væksten regulering 14. Ved hjælp af high throughput sekventering af molekylære stregkodede samlinger af tusindvis af mutanter 15 er det nu muligt at multiplex disse analyser muliggør systematiske undersøgelser af de genetiske krav til vækst i næringsstof-begrænsede miljøer. Det skal dog bemærkes, at en af de begrænsninger af kemostater er, at de ikke henvender sig til underliggende heterogenitet i individuelle cellevækst priser, der kan vurderes ved hjælp encellede mikroskopimetoder 16.
11,17-20 giver løfte om at forstå den funktionelle grundlag af adaptive evolution.
Kemostater i stigende grad bruges i nye forskningsområder, herunder studiet af transkriptionale dynamik 21,22 og metaboliske svingninger 23-26. Deres anvendelse i økologi har vist sig nyttig i studiet af rovdyr-byttedyr dynamik 27. En fornyet interesse for pattedyr cellevækst regulering, og dens forringelse i sygdomme hos mennesker, kan motivere en tilbagevenden til study af mammale celler i kemostater anvendelse af celler, der kan dyrkes i suspension 28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af opstart midler fra New York University. Vi takker Maitreya Dunham og Matt Brauer, der oprindeligt blev udviklet brugen af Sixfors bioreaktorer som kemostater.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Infors-HT Sixfors Chemostat | Appropriate Technical Resources, Inc. | ||
| Glass Bottle 9.5 L | Fisher Scientific | 02-887-1 | For Media Vessel and Hosing |
| Pinchcock | Fisher Scientific | 05-867 | For Media Vessel and Hosing |
| Stopper, Size 12, Green Neoprene | Cole-Palmer | EW-62991-42 | For Media Vessel and Hosing |
| Straight Connector | Cole-Palmer | EW-30703-02 | For Media Vessel and Hosing |
| General purpose ties 4 in | Fisher Scientific | NC9557052 | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone Rubber | Small Parts | B000FMWTDE | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone, 3/8 in OD | Fisher Scientific | 02-587-1Q | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone, 7/32 in OD | Fisher Scientific | 02-587-1E | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Stainless Steel, 3/16 in OD | McMaster-Carr | 6100K164 | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Stainless Steel, 3/8 in OD | McMaster-Carr | 6100K161 | For Media Vessel and Hosing |
| Hook Connectors | Fisher Scientific | 14-66-18Q | For Media Vessel and Hosing |
| Ratchet Clamp | Cole-Palmer | EW-06403-11 | For Media Vessel and Hosing |
| Luer, Female | Cole-Palmer | EW-45512-34 | For Media Vessel and Hosing |
| Luer, Male | Cole-Palmer | EW-45513-04 | For Media Vessel and Hosing |
| Millipore Aervent MTGR05010 62 mm Filter, 0.2 μm | Fisher Scientific | MTGR05010 | For Media Vessel and Hosing |
| PTFE Acrodisc CR 13 mm filters, 0.2 μm | Fisher Scientific | NC9131037 | For Media Vessel and Hosing |
| Direct-Reading Flowtube for Air | Cole-Palmer | EW-32047-77 | For Nitrogen Gas Setup |
| Direct-Reading Flowtube for Nitrogen | Cole-Palmer | EW-32048-63 | For Nitrogen Gas Setup |
| Gas Proportioner Multitube Frames | Cole-Palmer | EW-03218-50 | For Nitrogen Gas Setup |
| Regulator, Two-Stage Analytical | Airgas | Y12-N145D580 | For Nitrogen Gas Setup |
| Hose Adaptor, Stainless Steel | Airgas | Y99-26450 | For Nitrogen Gas Setup |
| Hose Male Adaptor | Airgas | WES544 | For Nitrogen Gas Setup |
| Norprene Tubing | US Plastics | 57280 | For Nitrogen Gas Setup |
| Tripod Base | Cole-Palmer | EW-03218-58 | For Nitrogen Gas Setup |
| Valve Cartridges | Cole-Palmer | EW-03217-92 | For Nitrogen Gas Setup |
| Carboy 10 L | Fisher Scientific | 02-963-2A | For Media Preperation |
| Steritop Sterile Vacuum Bottle-Top Filters, 1,000 ml, PES membrane; for 45 mm neck size | Fisher Scientific | SCGP-T10-RE | For Media Preperation |
| Media Bottle 100 ml, 45 mm neck size | Fisher Scientific | FB-800-100 | For Media Preperation |
| calcium chloride·2H2O | Fisher Scientific | C79-500 | Media Reagents |
| sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | Media Reagents |
| magnesium sulfate·7H2O | Sigma Aldrich | 230391 | Media Reagents |
| potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | AC424205000 | Media Reagents |
| ammonium sulfate | Fisher Scientific | AC423400010 | Media Reagents |
| potassium chloride | Sigma Aldrich | P9541 | Media Reagents |
| boric acid | Sigma Aldrich | B6768 | Media Reagents |
| copper sulfate·5H2O | Sigma Aldrich | 209198 | Media Reagents |
| potassium iodide | Sigma Aldrich | 60400 | Media Reagents |
| ferric chloride·6H2O | Fisher Scientific | I88-100 | Media Reagents |
| manganese sulfate·H2O | Sigma Aldrich | 230391 | Media Reagents |
| sodium molybdate·2H2O | Sigma Aldrich | M7634 | Media Reagents |
| zinc sulfate·7H2O | Fisher Scientific | Z68-500 | Media Reagents |
| biotin | Fisher Scientific | BP232-1 | Media Reagents |
| calcium pantothenate | Fisher Scientific | AC24330-1000 | Media Reagents |
| folic acid | Sigma Aldrich | F7876 | Media Reagents |
| inositol (aka myo-inositol) | Fisher Scientific | AC12226-1000 | Media Reagents |
| niacin (aka nicotinic acid) | Sigma Aldrich | N4126 | Media Reagents |
| p-aminobenzoic acid | Fisher Scientific | AC14621-2500 | Media Reagents |
| pyridoxine HCl | Sigma Aldrich | P9755 | Media Reagents |
| riboflavin | Sigma Aldrich | R4500-25G | Media Reagents |
| thiamine HCl | Fisher Scientific | BP892-100 | Media Reagents |
| Leucine | Sigma Aldrich | L8000-100G | Media Reagents |
| Uracil | Sigma Aldrich | U0750 | Media Reagents |
| Dextrose | Fisher Scientific | DF0155-08-5 | Media Reagents |
References
- Ingraham, J. L., Maaloe, O., Neidhardt, F. C. Growth of the Bacterial Cell. , Sinauer Associates, Inc. (1983).
- Cell Growth: Control of Cell Size. Hall, M. N., Raff, M. C., Thomas, G. , CSHL Press. (2004).
- Monod, J. La technique de culture continue, theorie et applications. Ann. Inst. Pasteur. 79, 390-410 (1950).
- Novick, A., Szilard, L.
- Kjeldgaard, N. O., Maaloe, O., Schaechter, M. The transition between different physiological states during balanced growth of Salmonella typhimurium. J. Gen. Microbiol. 19, 607-616 (1958).
- Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. Control of macromolecular synthesis. , W.A. Benjamin. (1966).
- Saldanha, A. J., Brauer, M. J., Botstein, D. Nutritional Homeostasis in Batch and Steady-State. Culture of Yeast. Mol. Biol. Cell. 15, 4089-4104 (2004).
- Boer, V. M., Crutchfield, C. A., Bradley, P. H., Botstein, D., Rabinowitz, J. D. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Mol. Biol. Cell. 21, 198-211 (2010).
- Boer, V. M., de Winde, J. H., Pronk, J. T., Piper, M. D. The genome-wide transcriptional responses of Saccharomyces cerevisiae grown on glucose in aerobic chemostat cultures limited for carbon, nitrogen, phosphorus, or sulfur. J. Biol. Chem. 278, 3265-3274 (2003).
- Brauer, M. J., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Mol. Biol. Cell. 19, 352-367 (2008).
- Gresham, D., et al. Adaptation to diverse nitrogen-limited environments by deletion or extrachromosomal element formation of the GAP1 locus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 18551-18556 (2010).
- Regenberg, B., et al. Growth-rate regulated genes have profound impact on interpretation of transcriptome profiling in Saccharomyces cerevisiae. Genome Biol. 7, R107 (2006).
- Castrillo, J. I., et al. Growth control of the eukaryote cell: a systems biology study in yeast. J. Biol. 6, 4 (2007).
- Cipollina, C., et al. Revisiting the role of yeast Sfp1 in ribosome biogenesis and cell size control: a chemostat study. Microbiology. 154, 337-346 (2008).
- Gresham, D., et al. System-level analysis of genes and functions affecting survival during nutrient starvation in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 187, 299-317 (2011).
- Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant. PLoS Biol. 10, e1001325 (2012).
- Kao, K. C., Sherlock, G. Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae. Nat. Genet. 40, 1499-1504 (2008).
- Gresham, D., et al. The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoS Genet. 4, e1000303 (2008).
- Wenger, J. W., et al. Hunger Artists: Yeast Adapted to Carbon Limitation Show Trade-Offs under Carbon Sufficiency. PLoS Genet. 7, e1002202 (2011).
- Dunham, M. J., et al. Characteristic genome rearrangements in experimental evolution of Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16144-16149 (2002).
- Ronen, M., Botstein, D. Transcriptional response of steady-state yeast cultures to transient perturbations in carbon source. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 389-394 (2006).
- Kresnowati, M. T. A. P., et al. When transcriptome meets metabolome: fast cellular responses of yeast to sudden relief of glucose limitation. Mol. Sys. Biol. 2, 49 (2006).
- Tu, B. P., Kudlicki, A., Rowicka, M., McKnight, S. L. Logic of the yeast metabolic cycle: temporal compartmentalization of cellular processes. Science. 310, 1152-1158 (2005).
- Tzur, A., Kafri, R., LeBleu, V. S., Lahav, G., Kirschner, M. W. Cell Growth and Size Homeostasis in Proliferating Animal Cells. Science. 325, 167-171 (2009).
- Conlon, I., Raff, M.
- Conlon, I. J., Dunn, G. A., Mudge, A. W., Raff, M. C.
- Fussmann, G. F., Ellner, S. P., Shertzer, K. W., Hairston, N. G. Crossing the hopf bifurcation in a live predator-prey system. Science. 290, 1358-1360 (2000).
- Cohen, E. P., Eagle, H. A simplified chemostat for the growth of mammalian cells: characteristics of cell growth in continuous culture. J. Exp. Med. 113, 467-474 (1961).
