Summary
Celgroei tarief is een gereguleerd proces en een primaire determinant van cel fysiologie. Continue kweken met chemostaten maakt extrinsieke controle cellen groei met nutriënten limitatie de studie van moleculaire netwerken die celgroei en hoe deze netwerken ontwikkelen om optimale celgroei regelen vergemakkelijken.
Abstract
Cellen reguleren hun groeitempo in reactie op signalen van de buitenwereld. Als de cel groeit, moeten diverse cellulaire processen worden gecoördineerd waaronder macromoleculaire synthese, metabolisme en uiteindelijk, betrokkenheid bij de celdeling cyclus. De chemostaat, een methode voor het regelen van experimenteel cel groei, biedt een krachtig middel systematisch bestuderen hoe groeipercentage gevolgen cellulaire processen - met inbegrip van genexpressie en stofwisseling - en de regulerende netwerken die het tempo van de celgroei. Wanneer gedurende honderden generaties chemostaten kan worden gebruikt om adaptieve evolutie van microben in milieuomstandigheden die de celgroei beperkt bestuderen. We beschrijven het principe van chemostaat culturen, tonen hun werking en geeft voorbeelden van de verschillende toepassingen. Na een periode van onbruik na hun introductie in het midden van de twintigste eeuw, de convergentie van genoom-schaal methodologieën met een vernieuwd inlangstelling in de regulatie van de celgroei en de moleculaire basis van adaptieve evolutie is het stimuleren van een renaissance in het gebruik van chemostaten in biologisch onderzoek.
Introduction
De groei van cellen wordt geregeld door complexe netwerken van op elkaar inwerkende genetische en omgevingsfactoren 1,2. De multifactoriële regulatie van celgroei vereist een systeem-level benadering van haar studie. Echter, de strenge studie van gereguleerde celgroei uitgedaagd door de moeilijkheid experimenteel regelen van de snelheid waarmee cellen groeien. Bovendien, zelfs in de meest eenvoudige experimenten extracellulaire voorwaarden zijn vaak dynamisch en complex als de cellen voortdurend veranderen hun omgeving als ze zich kunnen vermenigvuldigen. Een oplossing voor deze problemen is door de chemostaat: een werkwijze voor het kweken van cellen die experimentele controle cel groei kunnen in bepaalde, invariante en gecontroleerde omgevingen.
Werkwijze continu kweken met een chemostaat werd onafhankelijk beschreven door Monod 3 en Novick & Szilard 4 in 1950. Zoals oorspronkelijk bedacht worden cellen gekweekt in een vast volume van media die continu verdund door toevoeging van nieuwe media en gelijktijdige verwijdering van oude media en cellen (figuur 1). Gekoppelde gewone differentiaalvergelijkingen (figuur 2) beschrijven de mate van verandering in cel dichtheid (x) en de concentratie van een groei-beperkende nutriënt (en) in de chemostaat vat. Belangrijk is dat deze stelsel van vergelijkingen voorspelt een enkele (nul) stabiele steady-state (figuur 3) met de opmerkelijke implicatie dat bij steady-state, de specifieke groeisnelheid van de cellen (dwz de exponentiële groei constant) is gelijk aan het tarief waarbij de kweek wordt verdund (D). Door het variëren van de verdunning is het mogelijk om steady-state populaties van cellen vast te stellen op verschillende groeipercentages en onder verschillende omstandigheden van nutriënten limitatie.
De experimentele controle groei middels chemostaten was cruciaal voor de ontwikkeling van een begrip van hoe celfysiologie veranderingenmet groeipercentages 5,6. Echter, deze voormalige steunpilaar van microbiologische methoden werd steeds obscure tijdens de explosie in het moleculair biologisch onderzoek in de late twintigste eeuw. Vandaag, hernieuwde belangstelling voor de groei controle in zowel microben en meercellige organismen en de komst van genoom-schaal voor systemen-niveau analyse is de motivatie voor het gebruik van chemostaten vernieuwd. We beschrijven hier drie toepassingen die inspelen op de precieze controle van de cel groeicijfers en de externe omgeving die uniek zijn mogelijk met behulp van chemostaten. Eerst beschrijven we het gebruik van chemostaten om te onderzoeken hoe de overvloed van duizenden biomoleculen - zoals transcripten en metabolieten - gecoördineerd worden gereguleerd met de groeisnelheid. Ten tweede, beschrijven we hoe chemostaten kan worden gebruikt om nauwkeurige ramingen van de groei-rate verschillen tussen verschillende genotypen in-nutriënten beperkt omgevingen met behulp van competitie-experimenten verkrijgen. Ten derde, we beschrijven hoe chemostaten kanworden gebruikt om adaptieve evolutie van cellen groeien in constante voedselarme omgevingen te bestuderen. Deze voorbeelden illustreren de manier waarop chemostaten worden waardoor systemen-niveau onderzoeken van de celgroei regelgeving, gen door milieu interacties en adaptieve evolutie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het principe van continue kweken met een chemostaat kan worden gerealiseerd in verschillende implementaties. In alle chemostaten is het essentieel om 1) werkwijzen voor het handhaven van steriliteit alle onderdelen, 2) een goed gemengde cultuur 3) geschikte beluchting van het kweekvat en 4) een betrouwbare media toevoeging en verwijdering cultuur. Hier beschrijven we het gebruik van een Sixfors bioreactor (Infors Inc) als chemostaat gebruik van werkwijzen die gemakkelijk kunnen worden aangepast aan alternatieve opstellingen.
1. Montage van de chemostaat Schepen
- Schakel de Sixfors met de hoofdschakelaar.
- Spoel de chemostaat vaartuig, roerder assemblage, en aan te brengen slangen met gedeïoniseerd (DI) water. Controleer alle slangen en o-ringen en vervang versleten zoek stukken.
- Zorg ervoor dat de aandrijfas draagvlak is naar boven gericht in de glazen vat en dat de bovenkant van de aandrijfas wordt vastgeklikt op zijn plaats op de roerder montage. Stel de stirrer constructie in het glazen vat zodat de onderkant van de aandrijfas is geplaatst in de aandrijfas steun. Gebruik de klem om de roerder is bevestigd aan de glazen vat.
- Vul het vat met ongeveer 300 ml DI water.
- Verwijder de doppen van een opgeloste zuurstof (DO 2) probe en controleer het elektrolyt niveau door het losdraaien van de onderste behuizing en zorg ervoor dat de onderste behuizing is half gevuld met elektrolyt oplossing. Rescrew de onderste behuizing en invoegen in de haven op de chemostaat schip. Schroef tot handvast.
- Neem een pH-sonde en verwijder deze uit de opslag buffer (3 M KCl). Verwijder de pH-sonde dop en hechten aan fermentor 1. Met behulp van de Sixfors controle scherm, navigeer naar de fermentatie-parameter menu en selecteer "kalibreren pH". Plaats de pH-sonde in een standaard pH 7 buffer en opnemen lezen als High lezen. Herhaal dit met pH 4 buffer en opnemen lezen als Low lezen. Maak de pH-sonde van fermentatie, wassen met DI-water en plaats de sonde into de poort op de chemostaat schip. Schroef tot handvast.
- Plaats de chemostaat vaartuig in het rek. Let op het schip dat fermentor (1-6) de pH probe aangesloten en gekalibreerd. Plaats de pH-probe dop op de pH-probe. Met behulp van folie strak bedek de bovenkant van de Do 2 sonde.
- Vouw folie over de uiteinden van de slang aan de chemostaat vat.
- Herhaal de stappen 1,2-1,8 voor alle vaartuigen.
- De schepen Steriliseren in autoclaaf ze gedurende 15 min op een vloeibaar cyclus.
2. Voorbereiden van de Media
- Bepaal de beperkende reeks concentraties een voedingsstof door te groeien batch culturen in verschillende concentraties nutriënten. De voedingsstof beperkend het bereik waar de uiteindelijke celdichtheid is een lineaire functie van de aanvankelijke concentratie nutriënt (figuur 4). Selecteer een nutriëntenconcentratie ruim binnen de beperkende bereik. Voorbeelden van standaard media samenstelling voor studies met Saccharomyces cerevisiae zijn in 7-11.
- Autoclaaf lege mandfles, afgesloten met een rubber stop met een luchtinlaat en mediakanaal na eerst te garanderen dat het uiteinde van de media buis is bedekt met folie.
- In een afzonderlijk vat bereiden 10 L media.
- Bevestig een 500 ml filter beker in een 100 ml fles media. Verwijder de katoenen filter met een tang gesteriliseerd in ethanol en direct hechten aan de filtratie poort van de media mandfles.
- Bevestig de media mandfles een vacuüm bron en filter steriliseren media toe te voegen aan het filter beker.
- Wanneer filtratie van media is voltooid, sluit de filtratie-poort met een metalen klem.
3. Kalibreren dO 2 Probes en opzetten chemostaat
- Na de chemostaat schepen zijn geautoclaveerd en mogen in de bijbehorende warmte jas afkoelen plaats van het schip. Sluit de temperatuursensor, pH-sonde, en doe 2 sonde. Laat devaartuig zitten met de stroom gedurende minstens 6 uur om de dO 2 sondes polariseren.
- Het uiteinde van elk effluent buis in een afzonderlijke verzamel-houderdeel. Sluit de luchttoevoer via een autoclaaf filter en zet luchtstroom. Het water van elk schip moet stromen van het effluent buizen, die aangeeft dat alle afdichtingen correct worden gevormd.
- De hoogte van het effluent buis volgens de gewenste werkvolume (bijv. 300 ml). We maken gebruik van een liniaal die is gemarkeerd met buis plaatsingen gekalibreerd om verschillende werken volumes.
- Sluit de media mandfles om de chemostaat vat. Gebruik ethanol om buis te houden eindigt zo steriel mogelijk. Rijg de pomp slang door de pomp en open klem. Handmatig op de pomp totdat de media begint te stromen in de chemostaat vat. Laat slang van de pomp, dient de pers vrijelijk in chemostaat vat stromen. Als de media het effluent buis bereikt, sluit slang aan de pomp en klem.
- Start running het basisprogramma met waaier ingesteld op 400 rpm en het ingesteld op 30 ° C temperatuur
- Om te kalibreren dO 2 sondes, schakelt luchttoevoer en overschakelen naar stikstofgas. Wacht minstens een uur en opnemen meetwaarde als "laag gelezen". Ga terug naar de luchttoevoer (dwz met ambient zuurstofconcentratie), wacht minstens een extra uur en opnemen meting als "hoge lees".
- Initiëren gegevensregistratie met behulp van Iris software.
4. Enting
- Gebruik 70% ethanol tot de bovenkant van het kweekvat steriliseren.
- Verwijder de schroef op de bovenzijde van het vat en pipet 1 ml van een overnachting cultuur in de chemostaat vat. Draai de schroef weer.
- Geven het moment van inenting in Iris.
- Wacht ongeveer 24 uur voor culturen om vroeg stationaire fase te bereiken. Als de kweek groeit, zal opgeloste zuurstof en pH te verlagen. In het geval van glucose beperkend media, zal opgeloste zuurstof weer ~ 100% stationaire phase. Voor andere beperkingen voedingsstoffen zal opgeloste zuurstof in de stationaire fase blijven <100%.
5. Initiëren Pompen en bereiken van Steady State
- De verdunning wordt berekend door de stroomsnelheid te delen (hoeveelheid medium stroomt in het vat per uur) door het volume kweek. Bijvoorbeeld, met een volume van 300 ml een verdunning van 0,1 betekent dat 30 ml medium wordt toegevoegd aan de kweek per uur. Omdat het systeem onder positieve druk hetzelfde volume wordt verwijderd uit het vat zodat de cultuur voortdurend verdund. Een reeks verdunning (D) kan worden gebruikt die niet de maximale groeisnelheid (μ max) van de cellen, waarboven cellen uit de chemostaat wordt gewassen.
- Kies pompinstellingen, waarbij het aantal seconden dat de pomp aan en uit te geven, om de gewenste stroomsnelheid te stellen. De pomp levert media met een snelheid van ~ 0,11 ml / sec.
- Definieer een programma met de Sixfors interface dat de pomp timing, temperatuur en impellor snelheid aangeeft. Start het programma.
- Leeg het verzamelen van houders van vloeibare en noteer de tijd.
- Na ten minste twee uur, gebruik dan een cilinder te meten hoeveel media is verwijderd uit het schip. Hierdoor wordt het volume dat is toegevoegd aan de chemostaat vat gelijk. Bereken de verdunning (D = V effluent / V cultuur / tijd). Pas pomp instellingen indien berekend verdunning niet overeenkomt met de gewenste verdunning.
- Bij steady-state, heeft celdichtheid in de chemostaat niet veranderen in de tijd. Dit kan worden gemeten zonder verstoren de cultuur door bemonstering van de uitstroom. We operationeel bereiken van een steady state te definiëren als gelijke maten celdichtheid die worden gescheiden door ten minste een bevolking verdubbeling. Het bereiken van steady-state wordt ongeveer acht cultuur generaties na aanvang van de cultuur verdunning. Bij steady-state, cellen groeien exponentieel (i.e. constante groei in de tijd) in-nutriënten beperkte voorwaarden. De verdubbelingstijd van de bevolking (generatie tijd) is ln (2) / D.
- Blijf periodiek effluent volumes gemeten gedurende de duur van het experiment te verzekeren dat een constante verdunning wordt gehandhaafd.
6. Toepassing 1: Studeren groeiende cellen met verschillende snelheden in steady-state condities
- Bij steady-state in de chemostaat, de groei van de populatie van cellen is gelijk aan de verdunning. Door systematisch veranderen van de verdunning is het mogelijk om cellen groeien met verschillende snelheden. Dit maakt de systematische studie van fysiologische parameters die variëren met de groei inclusief celvolume, celcyclus podium en stressbestendigheid. Bovendien kan steady-state profielen globale mRNA, eiwit en metabolietniveaus worden getest in cellen die groeien met verschillende snelheden. Er zijn twee manieren om monsters te verwerven:
- Kleine monsters kunnen passief ob zijngehandhaafd door het plaatsen van het uiteinde van het effluent buis in een 1,5 ml of 15 ml buisje. Een monster van 1-5 ml kan worden verkregen in een paar minuten (afhankelijk van de stroomsnelheid). Vele fysiologische parameters worden gemeten uit deze monsters.
- Genexpressie of metaboliet analyses vereisen grotere monsters die zo snel mogelijk moet worden verkregen. Het uiteinde van het effluent buis in een 15 ml conische buis. Maak de schroef van het metalen uiteinde van het effluent buis en duw naar beneden. A ~ 10 ml monster zal snel vul je tube. Houd in gedachten dat het volume in de chemostaat schip is veranderd. Als er veel opeenvolgende monsters genomen kan het nodig zijn om stroming tot een constante verdunning te handhaven.
7. Toepassing 2: Nauwkeurige meting van groeiverschillen tussen genotypen in Controlled Environments Met behulp van flowcytometrie-gebaseerde competitietesten
- Chemostaten kan worden gebruikt om het effect van nutriëntenconcentratie kwantificerenover de verschillen in groei (dwz fitness) tussen verschillende genetische achtergronden. Door co-kweken van stammen gelabeld met verschillende fluorescente proteïnen de mate van verandering in relatieve abundantie in exponentiële groei wordt bepaald. Het uitvoeren van deze test met verschillende verdunning (D) kan de studie van effecten van nutriënten concentratie (s) op fitness verschillen.
- Vast steady state culturen van de twee stammen in afzonderlijke vaten chemostaat met identieke verdunning en een volume van 300 ml.
- Passief proeven 1 ml van elk vaartuig. Spin down cellen, resuspendeer in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en bij 4 ° C. Deze monsters bevatten homogene cel monsters, die controles voor de daaropvolgende flowcytometrie-analyse zijn.
- Plaats het effluent buis van het ene vat in een autoclaaf maatcilinder. Maak de schroef van het metalen uiteinde van het effluent buis en duw omlaag om cellen te verdrijven uit de chemostaat. Wanneerhet volume op 150 ml, terug het metalen uiteinde van het effluent buis naar zijn oorspronkelijke positie (300 ml). Herhaal dit met de tweede schip, met behulp van een andere maatcilinder.
- Gebruik 70% ethanol om de steriliteit te handhaven tijdens het verwijderen schroef bovenop de chemostaat vaartuig. Plaats de trechter in de opening en giet 150 ml van de andere cultuur in de chemostaat vat. Draai de schroef weer. Herhaal dit met de tweede schip, met behulp van de tweede trechter. Elke chemostaat vat bevat nu een mengsel van de twee stammen.
- Het verkrijgen van een 1 ml monster uit elk vat met passieve bemonstering elke 2-6 uur. Spin down cellen, resuspendeer in PBS en bewaar bij 4 ° C. Doorgaan met het nemen van monsters voor 2-3 dagen zorgvuldig opnemen van de tijd elk monster werd genomen.
- Na afloop van het experiment, ultrasone trillingen en verdun monsters ~ 2 x 10 6 cellen / ml. Met flowcytometrie, meet het percentage van de twee stammen in elk monster. Aangezien beide stammen exponentieel groeien, het relatieve groeipercentage verschil isbepaald door lineaire regressie van ln (strain1/strain2) tegen de tijd (gemeten in generaties). De helling van de regressielijn is de proportionele verschil in groeisnelheid (de fitness voordeel) van een stam ten opzichte van de andere.
- Zoals de mengcultuur wat tijd om een nieuwe steady-state bereiken kunnen nemen, kunnen vroege tijdstippen slecht passen bij de regressie. Dit kan het best worden opgelost doordat de 2-3 generaties te verstrijken alvorens met de monsterneming of het verwijderen van vroege punten die duidelijke uitschieters zijn. Omgekeerd, wanneer een stam de andere heeft weggeconcurreerd de gegevens niet langer bruikbaar zijn en deze punten moeten worden uitgesloten.
8. Toepassing 3: Experimentele Evolution
- Experimentele evolutie uitgevoerd in chemostaten selecteert voor mutanten die zijn toegenomen in fitness in de nutriënt beperkte omgeving. Selectie gebeurt meestal over honderden generaties.
- Opzetten van een steady-state chemostaat cultuur met behulp van een stamvan bekende genotype (en bij voorkeur bekend genoomsequentie) en een bepaald nutriënt-beperking.
- Om een "fossiele vondsten" van de aanpassing bevolking behouden passief bemonsteren chemostaat om de 2-3 dagen en bewaar het monster in 15% glycerol bij -80 ° C.
- Controleer de media reservoir en vullen met vers medium nodig.
- Handhaving van de exponentieel groeiende cultuur voor een paar honderd generaties.
- Na voltooiing van de selectieplaat een monster van cellen op vaste agarplaten. Nadat de cellen zijn gegroeid tot kolonies, kies een zuivere monster van kolonies met tandenstokers en beënt klonen in afzonderlijke putjes van een 96-wells plaat met 100 ul medium. Laat klonale monsters 's nachts groeien, voeg 100 ul van 30% glycerol en bewaar op -80 ° C.
- Karakteriseren klonen van whole genome sequencing en het uitvoeren van fenotypische tests waaronder de beoordeling van geschiktheid, met behulp van een gemeenschappelijke fluorescent gelabelde referentie-stam, zoals beschreven in Application 2. </ Li>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een groot voordeel van chemostaten is het vermogen om de groei van cellen experimenteel regelen door het variëren van de verdunning. In de gist Saccharomyces cerevisiae, de morfologie van de cel is informatief van de fase in de celdelingscyclus. Populaties met hogere groei bevatten een hoger percentage actief delende cellen zoals bepaald door de fractie unbudded cellen (figuur 5A). Analyses van globale mRNA expressie in chemostaat culturen is gebleken dat de expressie van vele genen differentieel tot expressie als een functie van groei (Figuren 5B en 5C).
De relatieve conditie van verschillende genotypen kunnen worden bepaald door het uitvoeren van concurrentie assays chemostaten met fluorescent gelabelde cellen en flowcytometrie analyse (Figuur 6A). Figuur 6B toont een representatief resultaat waarbij een mutante stam was com peted tegen een fluorescent gelabeld wildtype stam. In dit voorbeeld is de mutante stam een 40% groei voordeel per generatie. Ter vergelijking, een niet-gecodeerd wildtype stam streden tegen de fluorescent gelabeld wildtype stam verschilt niet in de snelheid van de groei.
Chemostaten een middel van het uitoefenen van een gedefinieerde en continue selectieve druk op cellen. Whole genome sequentie analyse kan worden verworven mutaties in cellen met verhoogde fitness identificeren. Aanpassingsevolutie experimenten in gist cellen in verschillende voedingsstof beperkte chemostaten geïdentificeerd kopienummer varianten een frequente en herhaalde mechanisme waarmee adaptieve mutaties gegenereerd. Bijvoorbeeld, onafhankelijke adaptieve evolutie experimenten uitgevoerd in stikstof beperkt chemostaten met verschillende stikstofbronnen, verschillende exemplaaraantal varianten (CNV) en dat onder de GAP1 gen werden geïdentificeerd 11 (figuur 7).
t "> chemostaten vormen een aantal unieke uitdagingen die anders niet worden aangetroffen in standaard microbiologische methoden. Mogelijke problemen en specifieke experimenten chemostaat oplossingen zijn te vinden in tabel 1.
Figuur 1. Schema van een chemostaat. De chemostaat bevat een media reservoir, pomp, een chemostaat schip, een effluent buis, en een opvangbak.
Figuur 2. Wiskundig model van de chemostaat. Differentiaalvergelijking 1 beschrijft de verandering in celdichtheid (x) in de chemostaat tijd, die het gevolg is van celgroei en verwijdering door verdunning (celdood wordt verwaarloosbaar verondersteld). Monod voorgestelde 3 dat celgroei (μ) afhankelijks op externe nutriëntenconcentratie volgens een Michaelis-Menten soort relatie die de variabelen van de maximale groeisnelheid (μ max) en een half-maximale groeisnelheid constant (K s) omvat. De verdunning (D) wordt bepaald door de snelheid van toevoeging media en cultuur verwijderen. Differentiaalvergelijking 2 beschrijft de mate van verandering in de beperkende concentratie nutriënt (en) in de chemostaat vat. De verandering in de concentratie van het beperkende nutriënt in de chemostaat vaartuig afhankelijk van de concentratie in het instromende medium (R), de verdunning van uitstroom (D) en verbruik van de cellen, die afhankelijk is van de cel parameters μ max, Ks en een constante opbrengst, Y. Ter vereenvoudiging wordt Y constant verondersteld bij verschillende groeipercentages. De variabelen en hun typische eenheden, in de gekoppelde gewone differentiaalvergelijkingen zijn x - cel holenteit (cellen / ml), s - het beperken van de concentratie nutriënten (uM), μ max - maximale groeisnelheid (hr -1), K s - nutriënten concentratie waarbij de groeisnelheid gelijk aan μ max / 2 (uM), Y - opbrengst (cellen / ml / uM), D - verdunning (hr -1), R - concentratie nutriënten in media reservoir (uM).
Figuur 3. Benadering van steady-state zoals voorspeld door het wiskundige model. Nutriëntenconcentratie (rood) en celdichtheid (blauw) bereiken niet nul stationaire toestanden.
Figuur 4. Tot oprichting van het beperken van het bereik van een voedingsstof. Saccharomyces cerevisiae werd gekweekt bij verschillende concentraties van glucose en de uiteindelijke dichtheid bepaald. Een lineaire relatie geeft aan dat de concentratie nutriënt in het bereik beperken.
Tabel 1. Tabel van mogelijke problemen en oplossingen. 
Figuur 5. Celfysiologie afhankelijk van de groeisnelheid. De chemostaat maakt gecontroleerde onderzoeken van de relatie tussen groeisnelheid en A) celdeling zoals getest op basis van celmorfologie (de fractie van geoculeerde cellen). De overvloed van ~ 25% gist mRNA afhankelijk groeisnelheid: bijvoorbeeld het gen B) UTR2 toename in expressie als beter groeien in zowel glucose-(o) en stikstof beperkt (Δ) chemostaten en gen C) daalt ASM1 in expressieniveau zo beter groeien in glucose-(o) en stikstof beperkt (Δ) chemostaten 10. 
Figuur 6. Strain concurrentie assays chemostaten. A) Twee stammen die differentieel gelabeld door constitutief tot expressie fluorescerende eiwitten samen gekweekt in een chemostaat en de mate van verandering in de relatieve hoeveelheden van de twee stammen wordt elke 2-4 generaties met flowcytometrie. B) De relatieve conditie van een stam wordt bepaald door lineaire regressie van de natuurlijke logaritme (ln) van de ratio van de twee stammen tegen de tijd gemeten in generaties. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken . 
Figuur 7. Keuze op lange termijn in chemostaten efficiënt kiest voor mutanten met verhoogde fitness. Genome-schaal analyse van mutanten heeft frequente chromosomale herschikkingen geïdentificeerd en copy number variation (CNV) in mutanten met verhoogde fitness. Onafhankelijke adaptieve evolutie experimenten verschillende stikstof-randvoorwaarden resultaten selecteren voor verschillende CNV allelen op de locus GAP1 (demarked door grijze gestippelde lijnen), die de algemene aminozuur permease codeert. Elk gegevenspunt is de verhouding van DNA-kopieaantal in het geëvolueerde stam vergeleken met eencestral stam gemeten met een DNA microarray die tegelijkertijd analyseert elk gen (zwart). Probleem Oplossing Lage pH in de cultuur vat. pH kan worden gecontroleerd in real time en gecontroleerd door geautomatiseerde toevoeging van zuur / base. Als alternatief kan gebufferde media worden gebruikt. Vlokmiddel cellen en biofilms in cultuur vat. Houd cultuur goed gemengd door het uitvoeren impellor bij> 400 rpm. De groei in media toevoerleidingen. Het gebruik van filters bij de inlaat poort reduceert de kans op kolonisatie van media toevoerleidingen. Cel synchronisatie en stabiele dO 2 oscillaties in carbon beperkte chemostaten. Deze kunnen worden voorkomen door het gebruik van hogere verdunning en het vermijden van langdurige periodes van hongersnood vóór aanvang van cultuur verdunning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Chemostaten staat de teelt van microben in-groei gecontroleerde steady-state condities. De cellen groeien continu met een constante snelheid waardoor een invariant externe omgeving. Dit in tegenstelling tot batch cultuur werkwijzen waarbij de externe omgeving verandert voortdurend en de groei wordt bepaald door een complexe interactie tussen omgeving en genotype. Aldus is een groot voordeel van het kweken van microben in chemostaten via batch cultuur is de mogelijkheid om experimenteel controle van de groei van cellen.
De snelheid waarmee een cel groeit het resultaat is van interacties tussen vele cellulaire processen waaronder nutriënt sensing, signaaltransductie, macromoleculaire synthese en metabolisme. Met chemostaten in combinatie met algemene analytische methoden kan onderzoeken hoe de groei effecten fundamentele processen in de cel en omgekeerd hoe de cel regelt en coördineert cellulaire procesde snelheid van de groei. Studies bij wildtype cellen hebben aangetoond dat cellulaire concentraties van RNA en eiwitten diepgaand worden beïnvloed door de tarieven van de celgroei 6 en meer recentelijk is aangetoond dat transcriptome 10,12,13 en metabolome 8 drastisch worden beïnvloed door celgroei tarieven.
De studie van mutant gedrag in chemostaten biedt een potentieel krachtig middel van het bestuderen van de wegen die belangrijk zijn voor groei voorschrift 14 zijn. Met sequenering van moleculaire barcodes verzamelingen duizenden mutanten 15 is nu mogelijk om deze assays multiplexen mogelijk systematisch onderzoek van de genetische vereisten voor groei in nutriënt beperkte omgevingen. Er zij opgemerkt dat een van de beperkingen van chemostaten is dat ze niet de onderliggende heterogeniteit in individuele celgroei tarieven die kunnen worden beoordeeld met behulp cel microscopie methoden 16 pakken.
11,17-20 houdt de belofte van het begrip van de functionele basis van adaptieve evolutie.
Chemostaten worden steeds vaker gebruikt in nieuwe gebieden van onderzoek met inbegrip van de studie van de transcriptie dynamiek 21,22 en metabole oscillaties 23-26. De toepassing ervan in de ecologie is nuttig voor de studie van predator-prooi dynamiek 27 bewezen. Een hernieuwde belangstelling voor zoogdieren celgroei regelgeving, en de verslechtering van de ziekte bij de mens, kan een terugkeer naar de studenten te motiverendy van zoogdiercellen in chemostaten middels cellen die kunnen worden gekweekt in suspensie 28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het opstarten van fondsen van de New York University. Wij danken Maitreya Dunham en Matt Brauer, die het gebruik van Sixfors bioreactoren als chemostaten eerste instantie ontwikkeld.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Infors-HT Sixfors Chemostat | Appropriate Technical Resources, Inc. | ||
| Glass Bottle 9.5 L | Fisher Scientific | 02-887-1 | For Media Vessel and Hosing |
| Pinchcock | Fisher Scientific | 05-867 | For Media Vessel and Hosing |
| Stopper, Size 12, Green Neoprene | Cole-Palmer | EW-62991-42 | For Media Vessel and Hosing |
| Straight Connector | Cole-Palmer | EW-30703-02 | For Media Vessel and Hosing |
| General purpose ties 4 in | Fisher Scientific | NC9557052 | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone Rubber | Small Parts | B000FMWTDE | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone, 3/8 in OD | Fisher Scientific | 02-587-1Q | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone, 7/32 in OD | Fisher Scientific | 02-587-1E | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Stainless Steel, 3/16 in OD | McMaster-Carr | 6100K164 | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Stainless Steel, 3/8 in OD | McMaster-Carr | 6100K161 | For Media Vessel and Hosing |
| Hook Connectors | Fisher Scientific | 14-66-18Q | For Media Vessel and Hosing |
| Ratchet Clamp | Cole-Palmer | EW-06403-11 | For Media Vessel and Hosing |
| Luer, Female | Cole-Palmer | EW-45512-34 | For Media Vessel and Hosing |
| Luer, Male | Cole-Palmer | EW-45513-04 | For Media Vessel and Hosing |
| Millipore Aervent MTGR05010 62 mm Filter, 0.2 μm | Fisher Scientific | MTGR05010 | For Media Vessel and Hosing |
| PTFE Acrodisc CR 13 mm filters, 0.2 μm | Fisher Scientific | NC9131037 | For Media Vessel and Hosing |
| Direct-Reading Flowtube for Air | Cole-Palmer | EW-32047-77 | For Nitrogen Gas Setup |
| Direct-Reading Flowtube for Nitrogen | Cole-Palmer | EW-32048-63 | For Nitrogen Gas Setup |
| Gas Proportioner Multitube Frames | Cole-Palmer | EW-03218-50 | For Nitrogen Gas Setup |
| Regulator, Two-Stage Analytical | Airgas | Y12-N145D580 | For Nitrogen Gas Setup |
| Hose Adaptor, Stainless Steel | Airgas | Y99-26450 | For Nitrogen Gas Setup |
| Hose Male Adaptor | Airgas | WES544 | For Nitrogen Gas Setup |
| Norprene Tubing | US Plastics | 57280 | For Nitrogen Gas Setup |
| Tripod Base | Cole-Palmer | EW-03218-58 | For Nitrogen Gas Setup |
| Valve Cartridges | Cole-Palmer | EW-03217-92 | For Nitrogen Gas Setup |
| Carboy 10 L | Fisher Scientific | 02-963-2A | For Media Preperation |
| Steritop Sterile Vacuum Bottle-Top Filters, 1,000 ml, PES membrane; for 45 mm neck size | Fisher Scientific | SCGP-T10-RE | For Media Preperation |
| Media Bottle 100 ml, 45 mm neck size | Fisher Scientific | FB-800-100 | For Media Preperation |
| calcium chloride·2H2O | Fisher Scientific | C79-500 | Media Reagents |
| sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | Media Reagents |
| magnesium sulfate·7H2O | Sigma Aldrich | 230391 | Media Reagents |
| potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | AC424205000 | Media Reagents |
| ammonium sulfate | Fisher Scientific | AC423400010 | Media Reagents |
| potassium chloride | Sigma Aldrich | P9541 | Media Reagents |
| boric acid | Sigma Aldrich | B6768 | Media Reagents |
| copper sulfate·5H2O | Sigma Aldrich | 209198 | Media Reagents |
| potassium iodide | Sigma Aldrich | 60400 | Media Reagents |
| ferric chloride·6H2O | Fisher Scientific | I88-100 | Media Reagents |
| manganese sulfate·H2O | Sigma Aldrich | 230391 | Media Reagents |
| sodium molybdate·2H2O | Sigma Aldrich | M7634 | Media Reagents |
| zinc sulfate·7H2O | Fisher Scientific | Z68-500 | Media Reagents |
| biotin | Fisher Scientific | BP232-1 | Media Reagents |
| calcium pantothenate | Fisher Scientific | AC24330-1000 | Media Reagents |
| folic acid | Sigma Aldrich | F7876 | Media Reagents |
| inositol (aka myo-inositol) | Fisher Scientific | AC12226-1000 | Media Reagents |
| niacin (aka nicotinic acid) | Sigma Aldrich | N4126 | Media Reagents |
| p-aminobenzoic acid | Fisher Scientific | AC14621-2500 | Media Reagents |
| pyridoxine HCl | Sigma Aldrich | P9755 | Media Reagents |
| riboflavin | Sigma Aldrich | R4500-25G | Media Reagents |
| thiamine HCl | Fisher Scientific | BP892-100 | Media Reagents |
| Leucine | Sigma Aldrich | L8000-100G | Media Reagents |
| Uracil | Sigma Aldrich | U0750 | Media Reagents |
| Dextrose | Fisher Scientific | DF0155-08-5 | Media Reagents |
References
- Ingraham, J. L., Maaloe, O., Neidhardt, F. C. Growth of the Bacterial Cell. , Sinauer Associates, Inc. (1983).
- Cell Growth: Control of Cell Size. Hall, M. N., Raff, M. C., Thomas, G. , CSHL Press. (2004).
- Monod, J. La technique de culture continue, theorie et applications. Ann. Inst. Pasteur. 79, 390-410 (1950).
- Novick, A., Szilard, L.
- Kjeldgaard, N. O., Maaloe, O., Schaechter, M. The transition between different physiological states during balanced growth of Salmonella typhimurium. J. Gen. Microbiol. 19, 607-616 (1958).
- Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. Control of macromolecular synthesis. , W.A. Benjamin. (1966).
- Saldanha, A. J., Brauer, M. J., Botstein, D. Nutritional Homeostasis in Batch and Steady-State. Culture of Yeast. Mol. Biol. Cell. 15, 4089-4104 (2004).
- Boer, V. M., Crutchfield, C. A., Bradley, P. H., Botstein, D., Rabinowitz, J. D. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Mol. Biol. Cell. 21, 198-211 (2010).
- Boer, V. M., de Winde, J. H., Pronk, J. T., Piper, M. D. The genome-wide transcriptional responses of Saccharomyces cerevisiae grown on glucose in aerobic chemostat cultures limited for carbon, nitrogen, phosphorus, or sulfur. J. Biol. Chem. 278, 3265-3274 (2003).
- Brauer, M. J., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Mol. Biol. Cell. 19, 352-367 (2008).
- Gresham, D., et al. Adaptation to diverse nitrogen-limited environments by deletion or extrachromosomal element formation of the GAP1 locus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 18551-18556 (2010).
- Regenberg, B., et al. Growth-rate regulated genes have profound impact on interpretation of transcriptome profiling in Saccharomyces cerevisiae. Genome Biol. 7, R107 (2006).
- Castrillo, J. I., et al. Growth control of the eukaryote cell: a systems biology study in yeast. J. Biol. 6, 4 (2007).
- Cipollina, C., et al. Revisiting the role of yeast Sfp1 in ribosome biogenesis and cell size control: a chemostat study. Microbiology. 154, 337-346 (2008).
- Gresham, D., et al. System-level analysis of genes and functions affecting survival during nutrient starvation in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 187, 299-317 (2011).
- Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant. PLoS Biol. 10, e1001325 (2012).
- Kao, K. C., Sherlock, G. Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae. Nat. Genet. 40, 1499-1504 (2008).
- Gresham, D., et al. The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoS Genet. 4, e1000303 (2008).
- Wenger, J. W., et al. Hunger Artists: Yeast Adapted to Carbon Limitation Show Trade-Offs under Carbon Sufficiency. PLoS Genet. 7, e1002202 (2011).
- Dunham, M. J., et al. Characteristic genome rearrangements in experimental evolution of Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16144-16149 (2002).
- Ronen, M., Botstein, D. Transcriptional response of steady-state yeast cultures to transient perturbations in carbon source. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 389-394 (2006).
- Kresnowati, M. T. A. P., et al. When transcriptome meets metabolome: fast cellular responses of yeast to sudden relief of glucose limitation. Mol. Sys. Biol. 2, 49 (2006).
- Tu, B. P., Kudlicki, A., Rowicka, M., McKnight, S. L. Logic of the yeast metabolic cycle: temporal compartmentalization of cellular processes. Science. 310, 1152-1158 (2005).
- Tzur, A., Kafri, R., LeBleu, V. S., Lahav, G., Kirschner, M. W. Cell Growth and Size Homeostasis in Proliferating Animal Cells. Science. 325, 167-171 (2009).
- Conlon, I., Raff, M.
- Conlon, I. J., Dunn, G. A., Mudge, A. W., Raff, M. C.
- Fussmann, G. F., Ellner, S. P., Shertzer, K. W., Hairston, N. G. Crossing the hopf bifurcation in a live predator-prey system. Science. 290, 1358-1360 (2000).
- Cohen, E. P., Eagle, H. A simplified chemostat for the growth of mammalian cells: characteristics of cell growth in continuous culture. J. Exp. Med. 113, 467-474 (1961).
