Summary
taux de croissance cellulaire est un processus réglementé et un facteur déterminant de la physiologie cellulaire. Culture en continu en utilisant chémostats permet un contrôle extrinsèque du taux de croissance des cellules par limitation des nutriments faciliter l'étude des réseaux moléculaires qui contrôlent la croissance cellulaire et la façon dont ces réseaux évoluent pour optimiser la croissance des cellules.
Abstract
Les cellules régulent leur taux de croissance en réponse à des signaux provenant du monde extérieur. Comme la cellule se développe, divers processus cellulaires doivent être coordonnés y compris la synthèse macromoléculaire, le métabolisme et, finalement, de l'engagement avec le cycle de la division cellulaire. Le chemostat, une méthode de contrôle expérimentalement le taux de croissance de la cellule, fournit un puissant moyen d'étudier systématiquement la façon dont les impacts des taux de croissance les processus cellulaires - y compris l'expression des gènes et le métabolisme - et les réseaux de régulation qui contrôlent le taux de croissance des cellules. Lorsque maintenue pendant des centaines de générations chémostats peut être utilisé pour étudier l'évolution adaptative des microbes dans des conditions environnementales qui limitent la croissance des cellules. Nous décrivons le principe des cultures chémostat, démontrer leur fonctionnement et de fournir des exemples de leurs diverses applications. Après une période de désuétude après leur introduction dans le milieu du XXe siècle, la convergence des méthodologies échelle du génome d'un renouvellement enintérêt dans la régulation de la croissance cellulaire et la base moléculaire de l'évolution adaptative est de stimuler une renaissance de l'utilisation des chémostats dans la recherche biologique.
Introduction
La croissance des cellules est régulée par des réseaux complexes d'interaction des facteurs génétiques et environnementaux 1,2. Le règlement multifactorielle de la croissance cellulaire nécessite une approche au niveau du système à son étude. Cependant, l'étude rigoureuse de la croissance cellulaire régulée est contestée par la difficulté de contrôler expérimentalement la vitesse à laquelle les cellules se développent. En outre, même dans les expériences les plus simples conditions extracellulaires sont souvent dynamique et complexe que les cellules modifient en permanence leur environnement comme ils prolifèrent. Une solution à ces problèmes est proposée par le chemostat: un procédé de culture de cellules qui permet un contrôle expérimental des taux de croissance de cellules dans des milieux définis, invariantes et contrôlées.
La méthode de culture en continu en utilisant un chemostat a été décrite de façon indépendante par Monod 3 et Novick et Szilard 4 en 1950. Conçu à l'origine, les cellules sont cultivées dans un volume fixe de médias qui est concontinuellement dilué par ajout de nouveaux médias et l'élimination simultanée des médias traditionnels et des cellules (Figure 1). Équations différentielles ordinaires couplées (figure 2) décrivent la vitesse de variation de la densité de cellules (x) et la concentration d'un nutriment (s) limitant la croissance dans le récipient chimiostatique. Surtout, ce système d'équations prédit un seul (non nul) stable à l'état d'équilibre (figure 3) avec l'implication remarquable à l'état d'équilibre, le taux de croissance spécifique des cellules (c'est à dire la constante de taux de croissance exponentiel) est égal au taux au cours de laquelle la culture est diluée (D). En faisant varier le taux de dilution, il est possible d'établir des populations à l'état stable de cellules à différents taux de croissance et dans différentes conditions de limitation en nutriments.
Le contrôle expérimental des taux de croissance à l'aide chémostats était essentielle pour le développement d'une compréhension de la façon dont les changements de la physiologie cellulaireavec des taux de croissance de 5,6. Cependant, cet ancien pilier de méthodes microbiologiques est devenu de plus en plus obscure lors de l'explosion dans la recherche en biologie moléculaire au cours de la fin du XXe siècle. Aujourd'hui, un regain d'intérêt dans le contrôle de la croissance dans les deux microbes et les organismes multicellulaires et l'avènement de méthodes échelle du génome pour l'analyse au niveau des systèmes a renouvelé motivation pour l'utilisation de chémostats. Ici, nous décrivons trois applications qui tirent sur le contrôle précis des taux de croissance de cellules et l'environnement extérieur qui sont uniquement possible en utilisant chémostats. Tout d'abord, nous décrivons l'utilisation de chémostats d'étudier comment l'abondance de milliers de biomolécules - tels que les transcriptions et des métabolites - sont réglementés de manière coordonnée avec les taux de croissance. Deuxièmement, nous décrivons comment chémostats peuvent être utilisées pour obtenir des estimations précises des écarts de taux de croissance entre les différents génotypes dans des environnements peu fertiles en utilisant des expériences de compétition. Troisièmement, nous décrivons comment peut chémostatsêtre utilisé pour étudier l'évolution adaptative des cellules en croissance dans des environnements pauvres en éléments nutritifs constants. Ces exemples illustrent la façon dont les chémostats activez enquêtes au niveau des systèmes de régulation de la croissance cellulaire, génique par des interactions de l'environnement et l'évolution adaptative.
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Protocol
Le principe de la culture en continu en utilisant un chemostat peut être réalisée dans une variété de mises en œuvre. Dans tous les chémostats il est essentiel d'avoir une) méthodes pour maintenir la stérilité de tous les composants, 2) une culture bien mélangé, 3) l'aération appropriée du récipient de culture et 4) un moyen fiable de plus de médias et l'élimination de la culture. Ici, nous décrivons l'utilisation d'un bioréacteur Sixfors (Infors Inc) en chemostat en utilisant des procédés qui peuvent être facilement adaptés à d'autres configurations.
Une. Assemblage des navires Chemostat
- Allumez les Sixfors l'aide de l'interrupteur principal.
- Bien rincer le récipient chimiostatique, Ensemble agitateur, et le tube attaché avec (DI) de l'eau déminéralisée. Vérifiez tous les tuyaux et les joints toriques et remplacer les pièces usées à la recherche.
- Assurez-vous que la base de support d'arbre d'entraînement est tourné vers le haut dans le récipient en verre et que la partie supérieure de l'arbre d'entraînement est remis dans son logement sur l'ensemble de l'agitateur. Réglez le stirrer ensemble dans le récipient de verre assurant le bas de l'arbre d'entraînement est logé dans le support d'arbre d'entraînement. Utiliser la pince pour fixer l'ensemble de l'agitateur dans la cuve de verre.
- Remplissez le réservoir avec environ 300 ml d'eau déminéralisée.
- Retirez les bouchons d'un oxygène dissous (DO 2) sonde et vérifier le niveau d'électrolyte en dévissant le boîtier en bas et en veillant à ce que le boîtier de fond est à moitié rempli avec une solution d'électrolyte. Replacer le boîtier en bas et l'insérer dans le port sur le récipient chimiostatique. Visser et serrer.
- Prenez une sonde de pH et la retirer de son tampon de stockage (3 M de KCl). Retirez le capuchon de la sonde de pH et le joindre à fermenteur 1. Utilisation de l'écran de contrôle Sixfors, accédez au menu des paramètres de fermentation et sélectionnez "calibrer pH". Placer la sonde de pH dans un tampon à pH 7 standard et fiche de lecture en tant que Haut Lire. Répéter l'opération avec tampon à pH 4 et enregistrer la lecture en bas Lire. Détacher la sonde de pH de fermentation, laver avec de l'eau DI et insérer la sonde into le port sur le récipient chimiostatique. Visser et serrer.
- Placer le récipient chimiostatique dans le rack. Remarque sur le navire qui fermenteur (1-6) de la sonde de pH a été connecté et calibré. Placez la sonde de pH bouchon sur la sonde de pH. Utilisant une feuille couvre bien le haut de la sonde à oxygène 2.
- Plier la feuille sur les extrémités de la tubulure attachée au récipient chimiostatique.
- Répétez les étapes 1.2 à 1.8 pour tous les navires.
- Stériliser les navires en leur autoclavage pendant 15 min sur un cycle liquide.
2. Préparation des supports
- Établir la gamme de limitation des concentrations de nutriments par la croissance des cultures en lots de différentes concentrations d'éléments nutritifs. Le nutriment est limitant dans la plage où la densité cellulaire finale est une fonction linéaire de la concentration des éléments nutritifs initiale (figure 4). Sélectionnez une concentration des éléments nutritifs dans la fourchette de limitation. Des exemples de composition de médias standard pour les études avec Saccharomyces cerevisiae sont disponibles en 11.7.
- Autoclave une bonbonne vide qui est coiffé d'un bouchon de caoutchouc contenant une entrée d'air et une sortie de média après la première assurant que l'extrémité du tube de support est recouvert d'une feuille.
- Dans un récipient séparé préparer 10 litres de médias.
- Fixer un filtre de 500 ml tasse à une bouteille de 100 ml de médias. Retirez le filtre de coton avec des pinces stérilisées dans de l'éthanol et joindre immédiatement au port de filtration sur la bonbonne de médias.
- Fixez la bonbonne de médias à une source de vide et filtre stériliser les médias en l'ajoutant à la coupe du filtre.
- Lorsque la filtration des médias est terminée, fermer le port de filtration avec une pince métallique.
3. Calibrage faire 2 sondes et Configuration Chemostat
- Après les vaisseaux chémostat ont été autoclave et laisser refroidir endroit du navire dans son enveloppe de chaleur correspondant. Connectez la sonde de température, sonde de pH et DO 2 sonde. Laissez lenavire s'asseoir avec le pouvoir pendant au moins 6 heures pour permettre aux DO 2 sondes à polariser.
- Placez l'extrémité de chaque tube effluents dans un récipient de collecte séparée. Connectez l'alimentation en air via un filtre autoclave et tourner sur la circulation d'air. L'eau dans chaque récipient doit s'écouler des tubes des effluents, ce qui indique que tous les joints sont correctement formés.
- Ajuster la hauteur du tube d'effluent en fonction du volume de travail désirée (par exemple, 300 ml). Nous utilisons une règle qui est marqué avec des stages de tubes calibrés pour différents volumes de travail.
- Connectez la bonbonne de médias dans le récipient de chemostat. Utiliser de l'éthanol afin de maintenir les extrémités des tubes aussi stérile que possible. Enfiler le tuyau de la pompe à travers la pompe et la pince ouverte. Appuyer manuellement sur la pompe jusqu'à ce que les médias commencent à s'écouler dans le récipient chimiostatique. Relâchez tube de la pompe, les médias doivent circuler librement dans le récipient chemostat. Lorsque le support atteint le tube effluent, rattacher tube à la pompe et serrer.
- Lancer running le programme de base avec roue ensemble à 400 tours par minute et la température réglée à 30 ° C.
- Pour calibrer faire 2 sondes, couper l'arrivée d'air et passer au gaz d'azote. Attendez au moins une heure et enregistrer la valeur de mesure comme «faible en lecture". Revenez à alimentation d'air (c'est à dire contenant la concentration en oxygène ambiante), attendez au moins une heure supplémentaire et la mesure d'enregistrement comme "une grande lecture».
- Lancer l'enregistrement de données en utilisant le logiciel Iris.
4. Inoculation
- Utiliser 70% d'éthanol pour stériliser la partie supérieure de la cuve de culture.
- Retirez la vis sur le dessus de la cuve et pipette 1 ml d'une culture de la nuit dans le récipient chimiostatique. Resserrer la vis.
- Indiquer le moment de l'inoculation dans Iris.
- Attendez environ 24 h pour les cultures d'atteindre la phase stationnaire précoce. Comme la culture se développe, l'oxygène dissous et le pH diminue. Dans le cas des milieux de glucose limitatif, l'oxygène dissous va revenir à ~ 100% en pha stationnairese. Pour les autres restrictions de nutriments oxygène dissous restera <100% en phase stationnaire.
5. Lancement de pompes et d'atteindre l'état d'équilibre
- Le taux de dilution est calculé en divisant le débit (la quantité de support s'écoule dans la cuve par heure) par le volume de la culture. Par exemple, en utilisant un volume de 300 ml, un taux de dilution de 0,1 signifie que 30 ml de milieu est ajouté à la culture par heure. Parce que le système est sous pression positive le même volume est retirée de la cuve en sorte que la culture est diluée de manière continue. Une gamme de taux de dilution (D) peut être utilisé qui ne dépasse pas la vitesse maximale de croissance (μ max) des cellules, les cellules ci-dessus, qui seront éliminés par lavage du chemostat.
- Choisissez réglages de la pompe, qui précisent le nombre de secondes, la pompe est sur et en dehors, pour établir le débit souhaité. La pompe délivre médias à un taux d'environ 0,11 ml / sec.
- Définir un programme utilisant l'int Sixforserface qui spécifie le calage de la pompe, la température et la vitesse de la turbine. Démarrez le programme.
- Videz les récipients collecteurs de liquide et enregistrer le temps.
- Après au moins deux heures, utiliser un cylindre gradué pour mesurer combien les médias a été retiré de la cuve. Ce sera égal au volume qui a été ajoutée au récipient de chemostat. Calculer le taux (D = V effluents / V culture / heure) dilution. Réglez les paramètres de la pompe si le taux de dilution calculé ne correspond pas à taux de dilution désiré.
- A l'état d'équilibre, la densité des cellules dans le chemostat ne change pas au fil du temps. Ceci peut être mesuré sans perturber la culture en échantillonnant la sortie. Nous définissons opérationnel atteindre l'état d'équilibre que les mesures de densité de cellules identiques qui sont séparés par au moins un doublement de la population. Atteindre l'état d'équilibre prendra environ huit générations de la culture après le début de la culture dilution. A l'état d'équilibre, les cellules se développent de façon exponentielle (i.e. taux de croissance constant au cours du temps) dans des conditions nutritives limitée. Le temps de doublement de la population (temps de génération) est ln (2) / D.
- Continuer à mesurer périodiquement le volume des effluents pour la durée de l'expérience pour s'assurer que le taux de dilution constant est maintenu.
6. Application 1: étude des cellules en croissance à des taux différents dans l'état d'équilibre
- A l'état d'équilibre dans le chemostat, le taux de la population de cellules de croissance est égal au taux de dilution. En modifiant systématiquement le taux de dilution, il est possible de cultiver des cellules à des vitesses différentes. Ceci permet l'étude systématique des paramètres physiologiques qui varient avec le taux de croissance y compris le volume des cellules, l'étape du cycle cellulaire et de la résistance au stress. En outre, les profils état d'équilibre de l'ARNm mondiale, les protéines et les niveaux de métabolites peuvent être testés dans des cellules en croissance à des taux différents. Il ya deux façons d'acquérir des échantillons:
- Petits échantillons peuvent être passivement obmaintenue en plaçant l'extrémité du tube d'effluent dans un tube de 1,5 ml ou de 15 ml. Un échantillon de 5.1 ml peuvent être obtenus en quelques minutes (en fonction de la vitesse d'écoulement). De nombreux paramètres physiologiques peuvent être mesurées à partir de ces échantillons.
- expression des gènes, ou de métabolites analyses nécessitent des échantillons plus larges qui doivent être obtenus le plus rapidement possible. Placer l'extrémité du tube d'effluent dans un tube conique de 15 ml. Relâchez la vis retenant le couvercle métallique du tube effluents et pousser doucement. A ~ 10 ml d'échantillon remplira rapidement votre tube. Garder à l'esprit que le volume dans le récipient chimiostatique a changé. Si plusieurs échantillons consécutifs sont prises, il peut être nécessaire de réduire le débit pour maintenir un taux de dilution constant.
7. Application 2: la mesure précise des différences de taux de croissance entre les génotypes dans des environnements contrôlés en utilisant des analyses de la concurrence fondée sur cytométrie de flux
- Chémostats peuvent être utilisés pour quantifier avec précision l'effet de la concentration en éléments nutritifssur les différences de taux de croissance (c'est à dire de remise en forme) entre différents fonds génétiques. Par des souches de co-culture marquées avec différentes protéines fluorescentes de la vitesse de variation de l'abondance relative pendant la croissance exponentielle est déterminée. Réalisation de ce test à différents taux de dilution (D) permet l'étude des effets de la concentration (s) nutriment sur les différences de remise en forme.
- Établir les cultures des deux souches dans les vaisseaux chémostat séparées avec des taux de dilution identiques et un volume de 300 ml état d'équilibre.
- Passivement échantillon de 1 ml de chaque navire. Spin bas cellules, remettre en suspension dans un tampon phosphate salin (PBS) et le lieu à 4 ° C. Ces échantillons contiennent des échantillons de cellules homogènes, qui sont des commandes pour l'analyse de cytométrie de flux subséquente.
- Placer le tube effluent d'un navire dans une éprouvette graduée autoclave. Relâchez la vis retenant le couvercle métallique du tube effluents et pousser doucement vers le bas pour expulser les cellules du chemostat. Quandle volume atteint 150 ml, retourner l'extrémité métallique du tube effluent à sa position initiale (300 ml). Répéter l'opération avec le second navire, en utilisant une éprouvette graduée différente.
- Utilisation éthanol à 70% pour maintenir la stérilité tout en enlevant les vis sur la partie supérieure du récipient chimiostatique. Placez l'entonnoir dans l'ouverture et versez 150 ml de l'autre culture dans le récipient chimiostatique. Resserrer la vis. Répéter l'opération avec le second navire, en utilisant le second entonnoir. Chaque récipient chimiostatique contient maintenant un mélange des deux souches.
- Obtenir un échantillon de 1 ml de chaque navire par échantillonnage passif chaque 2-6 h. Isoler les cellules, remettre en suspension dans du PBS et conserver à 4 ° C. Continuez à prendre des échantillons pour l'enregistrement 2-3 jours soigneusement le temps de chaque échantillon a été prélevé.
- A la fin de l'expérience, traitement par ultrasons et diluer les échantillons à ~ 2 x 10 6 cellules / ml. En utilisant la cytométrie en flux, de mesurer la proportion des deux souches dans chaque échantillon. Comme les deux souches sont en croissance exponentielle, la différence de taux de croissance relative estdéterminé par régression linéaire de ln (strain1/strain2) en fonction du temps (mesuré dans les générations). La pente de la régression est proportionnelle à la différence dans le taux de croissance (c'est à dire l'avantage de gym) d'une souche par rapport à l'autre.
- Comme la culture mixte peut prendre un certain temps pour atteindre un nouvel état d'équilibre, des points de temps au début peuvent s'adapter mal à la régression. Ce problème est résolu meilleur en permettant 2-3 générations s'écouler avant le début de l'échantillonnage ou de retirer début points qui sont aberrantes claires. Inversement, une fois une souche a surpassés l'autre, les données ne sont plus utiles et ces points doivent être exclus.
8. Application 3: Evolution expérimentale
- Évolution expérimentale effectuée dans chémostats sélectionne des mutants qui augmentent dans la forme physique dans l'environnement des éléments nutritifs limités. La sélection est généralement effectuée sur des centaines de générations.
- Établir une culture chimiostatique l'état d'équilibre en utilisant une souchegénotype connu (et la séquence du génome de préférence connu) et un nutriment limitation définie.
- Pour maintenir un «fossiles» de la population d'adaptation passive échantillon chemostat tous les 2-3 jours et stocker l'échantillon dans 15% de glycérol à -80 ° C.
- Surveiller le réservoir de médias et de reconstituer des milieux frais comme nécessaires.
- Maintenir la culture en croissance exponentielle pour plusieurs centaines de générations.
- Après l'achèvement de la plaque de sélection d'un échantillon de cellules sur des plaques de gélose solide. Après que les cellules ont grandi dans les colonies, choisir un échantillon biaisé de colonies à l'aide de cure-dents et inoculer clones dans les puits individuels d'une plaque de 96 puits contenant 100 pi de milieu. Permettre aux échantillons de clones de croître pendant la nuit, ajouter 100 ul de 30% de glycérol et en magasin -80 ° C.
- Caractériser clones par séquençage du génome entier et effectuer des dosages phénotypiques y compris l'évaluation de la condition physique, en utilisant une souche de référence marqué par fluorescence commun, tel que décrit dans la demande 2. </ Li>
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Representative Results
Un avantage majeur de chémostats est la capacité de contrôler le taux de croissance des cellules expérimentalement en faisant varier le taux de dilution. Chez la levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae, la morphologie d'une cellule est informative de la phase dans le cycle de la division cellulaire. Populations avec des taux de croissance plus élevés contiennent une proportion plus élevée de division active des cellules tel que déterminé par la mesure de la fraction de cellules unbudded (figure 5A). Des analyses de l'expression d'ARNm dans les cultures chémostat globale a montré que l'expression de nombreux gènes sont exprimés de façon différentielle en fonction du débit (figures 5B et la figure 5C) la croissance.
L'aptitude relative des différents génotypes peut être déterminée en effectuant des essais de compétition en utilisant chémostats cellules marquées par fluorescence et analyse par cytométrie de flux (Figure 6A). Figure 6B montre un résultat représentatif, dans lequel une souche mutante était com peted contre une souche de type sauvage étiqueté par fluorescence. Dans cet exemple, la souche mutante présente un avantage de taux de croissance de 40% par génération. Par comparaison, une souche de type sauvage non marqué en compétition avec la fluorescence marqués souche de type sauvage ne diffère pas de son taux de croissance.
Chémostats fournissent un moyen d'exercer une pression sélective définie et continue sur les cellules. Ensemble de l'analyse de séquence du génome peut être utilisé pour identifier des mutations acquises dans des cellules avec une augmentation fitness. Expériences de l'évolution adaptative des cellules de levure dans différents nutriments chémostats limitées ont identifié copy number variants comme un mécanisme fréquent et répété par lequel les mutations adaptatives sont générés. Par exemple, dans des expériences d'évolution adaptative indépendantes réalisées en chémostats limités en azote, en utilisant différentes sources d'azote, le nombre de copies multiples variantes (CNV) qui comprennent le gène de la GAP1 ont été identifiés 11 (figure 7).
t "> chémostats pose des défis uniques qui ne sont pas rencontrées autrement dans les méthodes microbiologiques standard. problèmes et solutions spécifiques à Chemostat expériences potentiels peuvent être trouvés dans le tableau 1.
Figure 1. Schéma d'un chemostat. L'chemostat comprend un réservoir à fluide, une pompe, une cuve chémostat, un tube d'effluent, et un récipient de collecte.
Figure 2. Modèle mathématique du chemostat. Équation différentielle 1 décrit la variation de la densité de cellules (x) dans le chemostat au fil du temps, ce qui est le résultat de la croissance cellulaire et l'élimination des cellules par dilution (mort cellulaire est supposé être négligeable). Monod proposé 3 que la croissance des cellules (μ) dépendents de la concentration des éléments nutritifs externe conformément à une relation de type Michaelis-Menten qui inclut les variables de vitesse maximale de croissance (μ max) et une constante de vitesse de croissance semi-maximale (K s). Le taux de dilution (D) est déterminée par la vitesse d'addition et le retrait de supports de culture. Equation 2 décrit le taux de variation de la concentration en élément nutritif limitant (s) dans le récipient chimiostatique. La variation de la concentration de l'élément nutritif limitant dans le récipient chimiostatique dépend de sa concentration dans le milieu entrant (R), sa dilution par écoulement (D) et de la consommation par les cellules, ce qui dépend des paramètres de maille μ max, K s et un rendement constant, Y. Par souci de simplification, Y est supposé être constant à différents taux de croissance. Les variables et leurs unités typiques, dans les équations différentielles ordinaires couplées sont x - maisons de celluleslité (cellules / ml), s - concentration limite en éléments nutritifs (uM), μ max - taux de croissance maximal (h -1), de K - concentration des éléments nutritifs au cours de laquelle le taux de croissance est égal à μ max / 2 (M), Y - rendement (cellules / ml / M), D - taux de dilution (h -1), R - concentration des éléments nutritifs dans le réservoir de médias (M).
Figure 3. Approche à l'état d'équilibre tel que prédit par le modèle mathématique. Concentration des éléments nutritifs (rouge) et la densité cellulaire (bleu) atteignent non nulles états stables.
Figure 4. Instituant la gamme de limitation d'un nutriment. Saccharomyces cerevisiae a été cultivé à différentes concentrations de glucose et de la densité finale déterminée. Une relation linéaire indique que la concentration en élément nutritif est dans la plage de limitation.
Tableau 1. Tableau de potentiel problème et les solutions. 
Figure 5. Physiologie cellulaire varie avec le taux de croissance. Chémostat permet des études contrôlées de la relation entre le taux de croissance et A) la division cellulaire telle que déterminée sur la base de la morphologie cellulaire (c'est à dire la fraction de cellules greffés). L'abondance de ~ 25% des ARNm de levure dépend du taux de croissance: augmente par exemple le gène B) UTR2 dans l'expression que l'augmentation du taux de croissance à la fois du glucose (o) et (Δ) chémostats limités en azote, et le gène C) ASM1 diminue dans le niveau d'expression augmente le taux de croissance de la glycémie (o) et de l'azote limitée (Δ) chémostats 10. 
Figure 6. analyses de la concurrence de la souche dans chémostats. A) Deux souches qui sont marqués de façon différentielle par les protéines fluorescentes constitutivement exprimées sont co-cultivées dans un seul chemostat et le taux de variation de l'abondance relative des deux souches sont déterminés tous les 2-4 générations par cytométrie en flux. B) La remise en forme par rapport d'une souche est déterminée par régression linéaire du logarithme naturel (ln) de la ratio des deux souches contre le temps mesuré en générations. Cliquez ici pour agrandir la figure . 
Figure 7. Sélection à long terme dans chémostats sélectionne efficacement des mutants avec une meilleure condition physique. Analyse du génome échelle de mutants a identifié réarrangements chromosomiques fréquentes et le nombre de copies variation (CNV) dans des mutants avec une meilleure condition physique. Des expériences d'évolution adaptative indépendants à différentes conditions de résultats de limitation de l'azote dans la sélection pour les différents allèles du locus CNV de GAP1 (démarquée par des lignes en pointillés gris), qui code pour la perméase d'acides aminés en général. Chaque point de donnée est le rapport du nombre de copies de l'ADN dans la souche évoluée un par rapport à l'souche cestral mesurée en utilisant une puce à ADN qui analyse simultanément chaque gène (noir). Problème Solution Faible pH dans le récipient de culture. Le pH peut être suivie en temps réel et commandé par addition automatique d'acide / base. En variante, des milieux tamponnés peuvent être utilisés. cellules de floculant et de biofilms dans la cuve de culture. Gardez culture bien mélangé en exécutant turbine à> 400 rpm. La croissance des lignes d'alimentation des médias. L'utilisation de filtres à l'orifice d'entrée réduit le potentiel de colonisation des conduites d'amenée de médias. synchronisation cellulaire et stables ne 2 oscillations in carbone chémostats limitées. Ceux-ci peuvent être évités en utilisant des taux de dilution plus élevés et d'éviter de longues périodes de famine avant le début de la culture dilution.
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Discussion
Chémostats permettent la culture de microbes dans des conditions stables de croissance contrôlée. Les cellules se développent en continu à un débit constant résulte en un environnement externe invariant. Ceci est en contraste aux méthodes de culture du lot dans lequel l'environnement extérieur est en constante évolution et le taux de croissance des cellules est déterminé par l'interaction complexe de l'environnement et le génotype. Ainsi, un avantage majeur de la mise en culture des microbes dans chémostats plus de cultures discontinues est la capacité de contrôler expérimentalement le taux de croissance des cellules.
La vitesse à laquelle une cellule se développe est le résultat d'interactions entre les processus cellulaires, y compris une myriade de détection des substances nutritives, la transduction du signal, de la synthèse macromoléculaire et le métabolisme. Utilisation chémostats en combinaison avec des méthodes d'analyse mondiaux permet l'étude de la façon dont le taux de croissance des impacts des processus fondamentaux de la cellule et inversement comment la cellule réglemente et coordonne processus cellulaire avecson taux de croissance. Les études dans les cellules de type sauvage ont montré que les concentrations cellulaires d'ARN et de protéines sont profondément affectés par des taux de croissance de la cellule 6 et plus récemment, il a été montré que transcriptome 10,12,13 et métabolome 8 sont considérablement influencés par les taux de croissance des cellules.
L'étude du comportement mutant dans chémostats fournit un moyen potentiellement puissant d'étudier les voies qui sont importants pour la régulation du taux de croissance de 14. Utilisation de séquençage à haut débit de code-barres moléculaires collections de milliers de mutants 15 il est maintenant possible de multiplexer ces tests permettant des études systématiques des exigences génétiques pour la croissance dans des environnements peu fertiles. Il convient de noter, toutefois, que l'une des limites de chémostats, c'est qu'ils ne tiennent pas compte de l'hétérogénéité sous-jacente des taux individuels de croissance des cellules qui peuvent être évalués en utilisant des méthodes de microscopie de cellules individuelles 16.
11,17-20 tient la promesse de la compréhension de la base fonctionnelle de l'évolution adaptative.
Chémostats sont de plus en plus utilisés dans les nouveaux domaines de recherche, y compris l'étude de la dynamique de la transcription 21,22 et oscillations métaboliques 23-26. Leur application en écologie s'est avérée utile dans l'étude de la dynamique prédateur-proie 27. Un regain d'intérêt dans la régulation de la croissance de cellules de mammifères, et son insuffisance dans la maladie humaine, peut motiver un retour à l'étudy de cellules de mammifères en utilisant chémostats cellules qui peuvent être cultivées en suspension 28.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les fonds de démarrage forment la New York University. Nous remercions Maitreya Dunham et Matt Brauer qui a initialement développé l'utilisation de bioréacteurs Sixfors comme chémostats.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Infors-HT Sixfors Chemostat | Appropriate Technical Resources, Inc. | ||
| Glass Bottle 9.5 L | Fisher Scientific | 02-887-1 | For Media Vessel and Hosing |
| Pinchcock | Fisher Scientific | 05-867 | For Media Vessel and Hosing |
| Stopper, Size 12, Green Neoprene | Cole-Palmer | EW-62991-42 | For Media Vessel and Hosing |
| Straight Connector | Cole-Palmer | EW-30703-02 | For Media Vessel and Hosing |
| General purpose ties 4 in | Fisher Scientific | NC9557052 | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone Rubber | Small Parts | B000FMWTDE | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone, 3/8 in OD | Fisher Scientific | 02-587-1Q | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone, 7/32 in OD | Fisher Scientific | 02-587-1E | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Stainless Steel, 3/16 in OD | McMaster-Carr | 6100K164 | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Stainless Steel, 3/8 in OD | McMaster-Carr | 6100K161 | For Media Vessel and Hosing |
| Hook Connectors | Fisher Scientific | 14-66-18Q | For Media Vessel and Hosing |
| Ratchet Clamp | Cole-Palmer | EW-06403-11 | For Media Vessel and Hosing |
| Luer, Female | Cole-Palmer | EW-45512-34 | For Media Vessel and Hosing |
| Luer, Male | Cole-Palmer | EW-45513-04 | For Media Vessel and Hosing |
| Millipore Aervent MTGR05010 62 mm Filter, 0.2 μm | Fisher Scientific | MTGR05010 | For Media Vessel and Hosing |
| PTFE Acrodisc CR 13 mm filters, 0.2 μm | Fisher Scientific | NC9131037 | For Media Vessel and Hosing |
| Direct-Reading Flowtube for Air | Cole-Palmer | EW-32047-77 | For Nitrogen Gas Setup |
| Direct-Reading Flowtube for Nitrogen | Cole-Palmer | EW-32048-63 | For Nitrogen Gas Setup |
| Gas Proportioner Multitube Frames | Cole-Palmer | EW-03218-50 | For Nitrogen Gas Setup |
| Regulator, Two-Stage Analytical | Airgas | Y12-N145D580 | For Nitrogen Gas Setup |
| Hose Adaptor, Stainless Steel | Airgas | Y99-26450 | For Nitrogen Gas Setup |
| Hose Male Adaptor | Airgas | WES544 | For Nitrogen Gas Setup |
| Norprene Tubing | US Plastics | 57280 | For Nitrogen Gas Setup |
| Tripod Base | Cole-Palmer | EW-03218-58 | For Nitrogen Gas Setup |
| Valve Cartridges | Cole-Palmer | EW-03217-92 | For Nitrogen Gas Setup |
| Carboy 10 L | Fisher Scientific | 02-963-2A | For Media Preperation |
| Steritop Sterile Vacuum Bottle-Top Filters, 1,000 ml, PES membrane; for 45 mm neck size | Fisher Scientific | SCGP-T10-RE | For Media Preperation |
| Media Bottle 100 ml, 45 mm neck size | Fisher Scientific | FB-800-100 | For Media Preperation |
| calcium chloride·2H2O | Fisher Scientific | C79-500 | Media Reagents |
| sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | Media Reagents |
| magnesium sulfate·7H2O | Sigma Aldrich | 230391 | Media Reagents |
| potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | AC424205000 | Media Reagents |
| ammonium sulfate | Fisher Scientific | AC423400010 | Media Reagents |
| potassium chloride | Sigma Aldrich | P9541 | Media Reagents |
| boric acid | Sigma Aldrich | B6768 | Media Reagents |
| copper sulfate·5H2O | Sigma Aldrich | 209198 | Media Reagents |
| potassium iodide | Sigma Aldrich | 60400 | Media Reagents |
| ferric chloride·6H2O | Fisher Scientific | I88-100 | Media Reagents |
| manganese sulfate·H2O | Sigma Aldrich | 230391 | Media Reagents |
| sodium molybdate·2H2O | Sigma Aldrich | M7634 | Media Reagents |
| zinc sulfate·7H2O | Fisher Scientific | Z68-500 | Media Reagents |
| biotin | Fisher Scientific | BP232-1 | Media Reagents |
| calcium pantothenate | Fisher Scientific | AC24330-1000 | Media Reagents |
| folic acid | Sigma Aldrich | F7876 | Media Reagents |
| inositol (aka myo-inositol) | Fisher Scientific | AC12226-1000 | Media Reagents |
| niacin (aka nicotinic acid) | Sigma Aldrich | N4126 | Media Reagents |
| p-aminobenzoic acid | Fisher Scientific | AC14621-2500 | Media Reagents |
| pyridoxine HCl | Sigma Aldrich | P9755 | Media Reagents |
| riboflavin | Sigma Aldrich | R4500-25G | Media Reagents |
| thiamine HCl | Fisher Scientific | BP892-100 | Media Reagents |
| Leucine | Sigma Aldrich | L8000-100G | Media Reagents |
| Uracil | Sigma Aldrich | U0750 | Media Reagents |
| Dextrose | Fisher Scientific | DF0155-08-5 | Media Reagents |
References
- Ingraham, J. L., Maaloe, O., Neidhardt, F. C. Growth of the Bacterial Cell. , Sinauer Associates, Inc. (1983).
- Cell Growth: Control of Cell Size. Hall, M. N., Raff, M. C., Thomas, G. , CSHL Press. (2004).
- Monod, J. La technique de culture continue, theorie et applications. Ann. Inst. Pasteur. 79, 390-410 (1950).
- Novick, A., Szilard, L. Description of the chemostat. Science. 112, 715-716 (1950).
- Kjeldgaard, N. O., Maaloe, O., Schaechter, M. The transition between different physiological states during balanced growth of Salmonella typhimurium. J. Gen. Microbiol. 19, 607-616 (1958).
- Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. Control of macromolecular synthesis. , W.A. Benjamin. (1966).
- Saldanha, A. J., Brauer, M. J., Botstein, D. Nutritional Homeostasis in Batch and Steady-State. Culture of Yeast. Mol. Biol. Cell. 15, 4089-4104 (2004).
- Boer, V. M., Crutchfield, C. A., Bradley, P. H., Botstein, D., Rabinowitz, J. D. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Mol. Biol. Cell. 21, 198-211 (2010).
- Boer, V. M., de Winde, J. H., Pronk, J. T., Piper, M. D. The genome-wide transcriptional responses of Saccharomyces cerevisiae grown on glucose in aerobic chemostat cultures limited for carbon, nitrogen, phosphorus, or sulfur. J. Biol. Chem. 278, 3265-3274 (2003).
- Brauer, M. J., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Mol. Biol. Cell. 19, 352-367 (2008).
- Gresham, D., et al. Adaptation to diverse nitrogen-limited environments by deletion or extrachromosomal element formation of the GAP1 locus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 18551-18556 (2010).
- Regenberg, B., et al. Growth-rate regulated genes have profound impact on interpretation of transcriptome profiling in Saccharomyces cerevisiae. Genome Biol. 7, R107 (2006).
- Castrillo, J. I., et al. Growth control of the eukaryote cell: a systems biology study in yeast. J. Biol. 6, 4 (2007).
- Cipollina, C., et al. Revisiting the role of yeast Sfp1 in ribosome biogenesis and cell size control: a chemostat study. Microbiology. 154, 337-346 (2008).
- Gresham, D., et al. System-level analysis of genes and functions affecting survival during nutrient starvation in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 187, 299-317 (2011).
- Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant. PLoS Biol. 10, e1001325 (2012).
- Kao, K. C., Sherlock, G. Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae. Nat. Genet. 40, 1499-1504 (2008).
- Gresham, D., et al. The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoS Genet. 4, e1000303 (2008).
- Wenger, J. W., et al. Hunger Artists: Yeast Adapted to Carbon Limitation Show Trade-Offs under Carbon Sufficiency. PLoS Genet. 7, e1002202 (2011).
- Dunham, M. J., et al. Characteristic genome rearrangements in experimental evolution of Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16144-16149 (2002).
- Ronen, M., Botstein, D. Transcriptional response of steady-state yeast cultures to transient perturbations in carbon source. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 389-394 (2006).
- Kresnowati, M. T. A. P., et al. When transcriptome meets metabolome: fast cellular responses of yeast to sudden relief of glucose limitation. Mol. Sys. Biol. 2, 49 (2006).
- Tu, B. P., Kudlicki, A., Rowicka, M., McKnight, S. L. Logic of the yeast metabolic cycle: temporal compartmentalization of cellular processes. Science. 310, 1152-1158 (2005).
- Tzur, A., Kafri, R., LeBleu, V. S., Lahav, G., Kirschner, M. W. Cell Growth and Size Homeostasis in Proliferating Animal Cells. Science. 325, 167-171 (2009).
- Conlon, I., Raff, M. Size control in animal development. Cell. 96, 235-244 (1999).
- Conlon, I. J., Dunn, G. A., Mudge, A. W., Raff, M. C. Extracellular control of cell size. Nat. Cell Biol. 3, 918-921 (2001).
- Fussmann, G. F., Ellner, S. P., Shertzer, K. W., Hairston, N. G. Crossing the hopf bifurcation in a live predator-prey system. Science. 290, 1358-1360 (2000).
- Cohen, E. P., Eagle, H. A simplified chemostat for the growth of mammalian cells: characteristics of cell growth in continuous culture. J. Exp. Med. 113, 467-474 (1961).
