Summary
معدل نمو الخلايا هو عملية تنظيم والمحددات الأساسية لعلم وظائف الأعضاء الخلية. زراعة المستمر باستخدام الكيموستات يمكن السيطرة خارجي من معدل نمو الخلايا بالتقادم المغذيات تسهيل دراسة الشبكات الجزيئية التي تتحكم في نمو الخلايا وكيف تتطور هذه الشبكات لتحسين نمو الخلايا.
Abstract
خلايا تنظيم معدل نموها في استجابة لإشارات من العالم الخارجي. مع نمو الخلية والعمليات الخلوية المختلفة يجب أن تكون منسقة بما في ذلك تجميع الجزيئات، والتمثيل الغذائي، وفي نهاية المطاف، والالتزام دورة انقسام الخلية. وناظم كيميائي، وهي طريقة للسيطرة على تجريبيا معدل نمو الخلايا، ويوفر وسيلة قوية لدراسة منهجية كيفية تأثير معدل نمو العمليات الخلوية - بما في ذلك التعبير الجيني والتمثيل الغذائي - والشبكات التنظيمية التي تتحكم في معدل نمو الخلايا. عندما يحتفظ به لمئات من الأجيال الكيموستات يمكن استخدامها لدراسة تطور التكيف من الميكروبات في الظروف البيئية التي تحد من نمو الخلايا. وصفنا مبدأ ناظم كيميائي الثقافات، وإظهار عملها وتقديم أمثلة من التطبيقات المختلفة. بعد فترة من الاهمال بعد بدء العمل بها في منتصف القرن العشرين، تلاقي المنهجيات الجينوم على نطاق ومع تجدد فيterest في تنظيم نمو الخلايا والأساس الجزيئي للتطور التكيف هو تحفيز نهضة في استخدام الكيموستات في الأبحاث البيولوجية.
Introduction
وينظم نمو الخلايا من خلال شبكات معقدة من التفاعل عوامل وراثية وبيئية 1،2. تنظيم سياقاتها من نمو الخلايا يتطلب نهجا على مستوى النظام لدراستها. ومع ذلك، يتم الطعن في دراسة دقيقة من نمو الخلايا ينظمها صعوبة السيطرة تجريبيا المعدل الذي تنمو الخلايا. علاوة على ذلك، حتى في أبسط التجارب الظروف خارج الخلية هي في كثير من الأحيان ديناميكية ومعقدة كخلايا تغيير بيئتهم بشكل مستمر لأنها تتكاثر. يتم توفير حل لهذه المشاكل من قبل ناظم كيميائي: وسيلة لزرع الخلايا التي يمكن السيطرة التجريبية من معدلات نمو الخلايا في بيئات محددة، ثابتة والسيطرة عليها.
طريقة زراعة المستمر باستخدام ناظم كيميائي وصفت بشكل مستقل من قبل مونود 3 و 4 نوفيك وزيلارد في عام 1950. كما تصور في الأصل، وتزرع الخلايا في حجم ثابت من وسائل الإعلام وهذا هو يخدعالمخفف tinually بإضافة وسائل الإعلام الجديدة وإزالة في وقت واحد من وسائل الإعلام القديمة والخلايا (الشكل 1). إلى جانب المعادلات التفاضلية العادية (الشكل 2) وصف معدل التغير في كثافة الخلية (س) وتركيز المغذيات منظم النمو (ق) في السفينة ناظم كيميائي. الأهم من ذلك، هذا النظام من المعادلات تتنبأ واحد (صفرية) مستقرة ثابتة للدولة (الشكل 3) مع ضمنا ملحوظا أنه في الحالة المستقرة، ومعدل نمو محدد من الخلايا (أي ثابت معدل النمو الأسي) يساوي معدل الذي يتم تخفيفه ثقافة (D). من خلال تغيير معدل التخفيف من الممكن لإقامة السكان المطرد للدولة من الخلايا في معدلات نمو مختلفة وتحت ظروف مختلفة من قيود المغذيات.
كانت السيطرة التجريبية من معدل النمو باستخدام الكيموستات حاسمة لتطوير فهم كيف يمكن للتغييرات فسيولوجية الخليةمع معدلات النمو 5،6. ومع ذلك، أصبح هذا دعامة السابق الأساليب الميكروبيولوجية غامضة بشكل متزايد خلال انفجار في البحوث البيولوجيا الجزيئية في أواخر القرن العشرين. اليوم، تجدد الاهتمام في السيطرة النمو في كل من الميكروبات والكائنات الحية متعددة الخلايا وظهور أساليب الجينوم على نطاق وللتحليل على مستوى النظم جددت الدافع لاستخدام الكيموستات. هنا، نحن تصف ثلاثة التطبيقات التي تستفيد من مراقبة دقيقة لمعدلات نمو الخلية والبيئة الخارجية التي من الممكن فريد باستخدام الكيموستات. أولا، نحن تصف استخدام الكيموستات إلى التحقيق في كيفية وفرة الآلاف من الجزيئات الحيوية - وينظم coordinately مع معدل النمو - مثل النصوص ونواتج الأيض. الثاني، نحن تصف كيف يمكن استخدام الكيموستات للحصول على تقديرات دقيقة للاختلافات معدل النمو بين الأنماط الجينية المختلفة في بيئات محدودة المغذيات باستخدام التجارب المنافسة. الثالث، ونحن تصف كيفية الكيموستات يمكنأن تستخدم لدراسة التطور على التكيف من خلايا تنمو في بيئات فقيرة بالمغذيات ثابتة. هذه الأمثلة أمثلة الطرق التي الكيموستات يتم تمكين التحقيقات على مستوى نظم تنظيم نمو الخلايا، الجين عن طريق تفاعلات البيئة والتطور على التكيف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
لا يمكن أن تتحقق مبدأ زراعة المستمر باستخدام ناظم كيميائي في مجموعة متنوعة من التطبيقات. في جميع الكيموستات فمن الضروري أن يكون 1) وسائل للحفاظ على عقم جميع المكونات، 2) ثقافة مختلطة جيدا، 3) التهوية المناسبة للسفينة الثقافة و 4) وسيلة يمكن الاعتماد عليها من وسائل الإعلام بالإضافة إلى إزالة والثقافة. هنا، نحن تصف استخدام مفاعل حيوي Sixfors (Infors المؤتمر الوطني العراقي) باعتبارها ناظم كيميائي باستخدام الأساليب التي يمكن تكييفها بسهولة للالاجهزة البديلة.
1. تجميع السفن ناظم كيميائي
- بدوره على Sixfors باستخدام مفتاح رئيسي.
- شطف جيدا السفينة ناظم كيميائي، والتجمع، والنمام، وأنابيب المرفقة مع منزوع الأيونات (DI) المياه. تحقق من كل أنابيب والخواتم O-واستبدال أي تهالك أبحث قطعة.
- تأكد من قاعدة دعم محرك رمح تواجه صعودا في إناء من الزجاج والتي قطعت الجزء العلوي من حملة رمح في السكن على الجمعية النمام. تعيين stirreيجلس التجمع ص في الإناء الزجاجي ضمان السفلي من حملة رمح في دعم حملة رمح. استخدام المشبك لتأمين التجمع النمام إلى وعاء زجاجي.
- ملء وعاء مع حوالي 300 مل من الماء DI.
- تنزع الأغطية من الأوكسجين المذاب (DO 2) التحقيق والتحقق من مستوى بالكهرباء عن طريق فك غلاف القاع، والتأكد من أن الغلاف السفلي شغل في منتصف الطريق مع الحل بالكهرباء. Rescrew الغلاف السفلي وتضاف الى ميناء على متن السفينة ناظم كيميائي. المسمار حتى ضيق الإصبع.
- نلقي التحقيق الحموضة وإزالته من العازلة التخزين (3 M بوكل). إزالة الغطاء مسبار درجة الحموضة ونعلق على المخمر 1. باستخدام شاشة التحكم Sixfors، انتقل إلى القائمة المعلمة المخمر وحدد "معايرة درجة الحموضة". وضع مسبار درجة الحموضة في مستوى درجة الحموضة 7 العازلة وقراءة السجل كما عالية القراءة. كرر مع درجة الحموضة 4 العازلة والقراءة كما سجل أدنى قراءة. فصل مسبار درجة الحموضة من المخمر، ويغسل بالماء DI وإدراج الباحث التحقيقس الميناء على متن السفينة ناظم كيميائي. المسمار حتى ضيق الإصبع.
- وضع السفينة ناظم كيميائي في رف. ملاحظة على متن السفينة التي المخمر (1-6) كان على علاقة الرقم الهيدروجيني إلى التحقيق ومعايرة. وضع غطاء مسبار درجة الحموضة على تحقيق درجة الحموضة. باستخدام رقائق تغطية بإحكام الجزء العلوي من التحقيق قيام 2.
- احباط أضعاف خلال نهايات الأنابيب التي تعلق على سفينة ناظم كيميائي.
- كرر الخطوات من 1،2-1،8 لجميع السفن.
- تعقيم الأوعية بواسطة التعقيم لهم لمدة 15 دقيقة على دورة السائل.
2. إعداد وسائل الإعلام
- إنشاء مجموعة الحد من تركيزات للمادة مغذية التي تنمو الثقافات دفعة في تركيزات المغذيات المختلفة. المغذيات هو الحد في النطاق حيث كثافة الخلية النهائية هي وظيفة خطية من تركيز المغذيات الأولية (الشكل 4). تحديد تركيز المغذيات بشكل جيد ضمن نطاق محدود. أمثلة على تكوين وسائل الإعلام القياسية للدراسات مع Saccharomyceتتوفر ق الخباز في 7-11.
- الأوتوكلاف لالدامجانة زجاجة كبيرة الفارغة التي توج مع المكونات المطاطية التي تحتوي على مدخل الهواء ومخرج وسائل الإعلام بعد التأكد أولا أن نهاية الأنابيب وسائل الإعلام تتناول في احباط.
- في وعاء منفصل إعداد 10 L من وسائل الإعلام.
- نعلق مرشح كوب 500 مل إلى 100 مل زجاجة سائل الإعلام. إزالة عامل التصفية القطن مع ملقط معقم في الإيثانول ونعلق على الفور إلى ميناء الترشيح على الدامجانة زجاجة كبيرة وسائل الإعلام.
- إرفاق الدامجانة زجاجة كبيرة وسائل الإعلام إلى مصدر فراغ وتصفية تعقيم وسائل الإعلام عن طريق إضافته إلى كأس فلتر.
- عندما الترشيح من وسائل الإعلام كاملة، تغلق ميناء الترشيح مع الشبك المعدني.
3. هل معايرة 2 المسابر وإعداد ناظم كيميائي
- بعد أن تم تعقيمها الأوعية ناظم كيميائي وسمح لتهدئة مكان السفينة في سترة في الحرارة المقابلة. ربط التحقيق في درجة الحرارة، ودرجة الحموضة التحقيق، والقيام 2 التحقيق. السماح للسفينة الجلوس مع السلطة لمدة لا تقل عن 6 ساعة للسماح للقيام 2 تحقيقات لاستقطاب.
- وضع نهاية كل أنبوب النفايات السائلة في وعاء جمع منفصلة. توصيل التيار الهواء عبر فلتر تعقيمها وبدوره على تدفق الهواء. الماء في كل سفينة ينبغي أن تتدفق من أنابيب مياه الصرف، مما يدل على أن جميع الأختام تتشكل بشكل صحيح.
- ضبط ارتفاع أنبوب مياه الصرف وفقا لحجم العمل المطلوب (مثلا 300 مل). نستخدم مسطرة التي تم وضع علامة مع مواضع أنبوب معايرة لأحجام عمل مختلفة.
- ربط الدامجانة زجاجة كبيرة وسائل الإعلام إلى وعاء ناظم كيميائي. استخدام الإيثانول من اجل الحفاظ على أنبوب ينتهي معقمة قدر الإمكان. الموضوع أنابيب مضخة من خلال مضخة والمشبك مفتوحة. اضغط يدويا حتى يبدأ ضخ وسائل الإعلام في التدفق إلى السفينة ناظم كيميائي. الإفراج عن أنابيب من المضخة، يجب أن تتدفق بحرية وسائل الإعلام في السفينة ناظم كيميائي. عندما تصل وسائل الإعلام أنبوب النفايات السائلة، أعد أنابيب لضخ والمشبك.
- بدء روnning البرنامج الأساسية مع مجموعة المكره إلى 400 دورة في الدقيقة ودرجة الحرارة التي حددت في 30 درجة مئوية.
- من أجل القيام معايرة 2 تحقيقات، وإيقاف العرض الجوي والتحول إلى غاز النيتروجين. الانتظار ساعة واحدة على الأقل وتسجيل قيمة الإجراء بأنه "منخفض للقراءة". التبديل إلى العرض الجوي (أي التي تحتوي على تركيز الأكسجين المحيطة)، وانتظر ساعة إضافية واحدة على الأقل، وقياس السجل ك "قراءة عالية".
- بدء تسجيل البيانات باستخدام برنامج ايريس.
4. تلقيح
- استخدام الايثانول 70٪ لتعقيم الجزء العلوي من سفينة الثقافة.
- إزالة المسمار على رأس السفينة وماصة 1 مل من ثقافة بين عشية وضحاها في الإناء ناظم كيميائي. إعادة إحكام المسمار.
- تشير إلى وقت التلقيح في ايريس.
- انتظر ما يقرب من 24 ساعة للثقافات لتصل إلى مرحلة ثابتة في وقت مبكر. مع نمو الثقافة، والأوكسجين المذاب ودرجة الحموضة الانخفاض. في حالة وسائل الإعلام الحد من الجلوكوز، والأكسجين الذائب العودة إلى ~ 100٪ في فا ثابتةحد ذاتها. لقيود المغذيات الأخرى ستبقى الأوكسجين المذاب <100٪ في مرحلة ثابتة.
5. بدء مضخات وتحقيق الدولة ثابت
- يتم احتساب معدل التخفيف بقسمة معدل التدفق (تدفق وسائل الاعلام وكم في الإناء لكل ساعة) من حجم الثقافة. على سبيل المثال، وذلك باستخدام حجم 300 مل معدل التخفيف من 0.1 يعني أن 30 مل من وسائل الإعلام يضاف إلى ثقافة كل ساعة. لأن النظام هو تحت ضغط إيجابي تتم إزالة نفس الحجم من السفينة ضمان أن الثقافة هي المخفف بشكل مستمر. وهناك مجموعة من معدلات التخفيف (D) يمكن استخدامها التي لا يتجاوز معدل النمو الأقصى (μ ماكس) من الخلايا، أعلاه والتي سيتم غسلها الخلايا من ناظم كيميائي.
- اختيار إعدادات مضخة، التي تحدد عدد الثواني المضخة وخارجها، لإنشاء معدل التدفق المطلوب. المضخة توفر وسائل الإعلام بمعدل 0.11 مل ~ / ثانية.
- تعريف البرنامج باستخدام الباحث Sixforserface التي تحدد توقيت مضخة، ودرجة الحرارة وسرعة impellor. بدء تشغيل البرنامج.
- إفراغ أوعية جمع السائل وتسجيل الوقت.
- بعد ساعتين على الأقل، واستخدام اسطوانة تخرج لقياس مدى سائل الإعلام قد أزيلت من السفينة. وهذا يساوي وحدة التخزين التي تم إضافتها إلى السفينة ناظم كيميائي. حساب معدل التخفيف (D = V النفايات السائلة / V الثقافة / الساعة). ضبط إعدادات مضخة إذا كان معدل التخفيف حساب لا يطابق معدل التخفيف المطلوب.
- في حالة مستقرة، لا يغير كثافة الخلية في ناظم كيميائي مع مرور الوقت. وهذا يمكن أن تقاس دون احداث بلبلة في الثقافة عن طريق أخذ عينات من تدفق. نحدد من الناحية التشغيلية تحقيق حالة مستقرة كما متطابقة قياسات كثافة الخلايا التي تكون مفصولة تضاعف السكان واحد على الأقل. سوف تصل إلى حالة مستقرة يستغرق ما يقرب من ثمانية أجيال الثقافة بعد الشروع في الثقافة التخفيف. في حالة مستقرة، والخلايا تنمو باطراد (اولاه. معدل نمو ثابتة على مر الزمن) في ظروف محدودة المغذيات. الوقت تضاعف عدد السكان (الجيل الوقت) هو قانون الجنسية (2) / د.
- مواصلة لقياس كميات النفايات السائلة بشكل دوري لمدة التجربة لضمان أن معدل التخفيف المستمر والمحافظة عليها.
6. تطبيق 1: دراسة الخلايا تنمو بمعدلات مختلفة في ظروف الحالة المستقرة
- في حالة مستقرة في ناظم كيميائي، فإن معدل نمو السكان من الخلايا يساوي معدل التخفيف. عن طريق تغيير منهجية معدل التخفيف فمن الممكن أن تنمو الخلايا بمعدلات مختلفة. وهذا يتيح الدراسة المنهجية للمعلمات الفسيولوجية التي تختلف مع معدل النمو بما في ذلك حجم الخلية، ومرحلة دورة الخلية ومقاومة الإجهاد. بالإضافة إلى ذلك، ملامح ثابتة للدولة مرنا العالمية والبروتين ومستوى الأيض يمكن أن يعاير في الخلايا تنمو بمعدلات مختلفة. هناك طريقتان للحصول على عينات:
- يمكن أن تكون عينات صغيرة أوب سلبيتترتب عليه من خلال وضع نهاية أنبوب مياه الصرف إلى 1.5 مل أو 15 مل أنبوب. ويمكن الحصول على عينة من 1-5 مل في بضع دقائق (اعتمادا على معدل التدفق). ويمكن قياس العديد من المعلمات الفسيولوجية من هذه العينات.
- التعبير الجيني، أو الأيض التحليلات تتطلب عينات أكبر التي يجب الحصول عليها في أسرع وقت ممكن. وضع نهاية أنبوب النفايات السائلة في أنبوب مخروطي 15 مل. الافراج عن المسمار عقد نهاية المعدني للأنبوب النفايات السائلة ودفع إلى أسفل بلطف. سوف A ~ 10 عينة مل ملء بسرعة الأنبوب الخاص. نضع في اعتبارنا أن وحدة التخزين في السفينة ناظم كيميائي قد تغير. إذا تم اتخاذ العديد من عينات متتالية قد يكون من الضروري للحد من تدفق للحفاظ على معدل ثابت التخفيف.
7. تطبيق 2: قياس دقيق من الاختلافات في معدلات النمو بين الطرز الوراثية في البيئات التي تسيطر عليها عن طريق فحوصات المسابقة على أساس التدفق الخلوي
- الكيموستات يمكن استخدامها لتحديد بدقة تأثير تركيز المغذياتعلى الفروق في معدلات النمو (أي لياقة بدنية) بين خلفيات وراثية مختلفة. بواسطة سلالات زراعة المشترك المسمى مع البروتينات الفلورية مختلفة يتم تحديد معدل التغير في الوفرة النسبية خلال النمو المتسارع. أداء هذا الاختبار في معدلات تخفيف مختلفة (D) يسمح دراسة آثار تركيز المغذيات (ق) على الاختلافات اللياقة البدنية.
- إنشاء ثقافات حالة مستقرة من سلالتين في الأوعية ناظم كيميائي منفصلة مع معدلات التخفيف متطابقة وحجم 300 مل.
- سلبية عينة 1 مل من كل سفينة. تدور باستمرار خلايا، resuspend في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ووضعت في 4 درجات مئوية. هذه العينات تحتوي على عينات الخلايا متجانسة، والتي هي الضوابط لتحليل التدفق الخلوي لاحقة.
- وضع أنبوب النفايات السائلة من سفينة واحدة في اسطوانة تخرج تعقيمها. الافراج عن المسمار عقد نهاية المعدني للأنبوب مياه الصرف، ودفع برفق إلى أسفل لطرد الخلايا من ناظم كيميائي. عندمايصل حجم 150 مل، والعودة نهاية المعدني للأنبوب مياه الصرف إلى موقعها الأصلي (300 مل). أكرر مع السفينة الثانية، وذلك باستخدام اسطوانة تخرج مختلفة.
- استخدام الايثانول 70٪ للحفاظ على العقم أثناء إزالة المسمار على الجزء العلوي من السفينة ناظم كيميائي. وضع القمع في افتتاح وتصب 150 مل من ثقافة أخرى في الإناء ناظم كيميائي. إعادة إحكام المسمار. أكرر مع السفينة الثانية، وذلك باستخدام قمع الثانية. يحتوي كل سفينة ناظم كيميائي الآن خليط من سلالات اثنين.
- الحصول على عينة 1 مل من كل سفينة باستخدام العينات سلبية كل 2-6 ساعة. تدور باستمرار خلايا، resuspend في برنامج تلفزيوني وتخزينها في 4 درجات مئوية. مواصلة اتخاذ عينات لتسجيل 2-3 أيام بعناية الوقت الذي اتخذ كل عينة.
- في نهاية التجربة، يصوتن وتمييع عينات إلى ~ 2 × 10 6 خلية / مل. باستخدام التدفق الخلوي، وقياس نسبة سلالتين في كل عينة. لأن كلا من سلالات تنمو باطراد، والفرق هو معدل النمو النسبييحددها الانحدار الخطي من قانون الجنسية (strain1/strain2) مع الزمن (يقاس في الأجيال). المنحدر من الانحدار هو الفرق النسبي في معدل النمو (أي ميزة اللياقة البدنية) من سلالة واحدة بالنسبة للأخرى.
- كما يمكن للثقافة مختلطة يستغرق بعض الوقت للوصول الى حالة استقرار جديدة، ونقاط الوقت المبكر قد تناسب بشكل ضعيف إلى الانحدار. هو افضل حل هذه المشكلة عن طريق السماح 2-3 أجيال تنقضي قبل بدء أخذ العينات أو إزالة النقاط المبكرة التي هي القيم المتطرفة واضحة. على العكس، مرة واحدة وسلالة واحدة outcompeted وغيرها من البيانات لم تعد مفيدة وينبغي استبعاد هذه النقاط.
8. تطبيق 3: تطور التجريبية
- تطور التجريبية التي أجريت في الكيموستات يختار لالمسوخ التي زادت في اللياقة البدنية في بيئة محدودة المغذيات. يتم تنفيذ الاختيار عموما على مدى مئات الأجيال.
- تأسيس ثقافة ناظم كيميائي ثابت للدولة باستخدام سلالةالنمط الجيني المعروفة (ويفضل أن يكون تسلسل الجينوم المعروف)، والمغذيات تعريف القيد.
- للحفاظ على "سجل الحفريات" من السكان التكيف بشكل سلبي عينة ناظم كيميائي كل 2-3 أيام وتخزين العينة في 15٪ الجلسرين في -80 درجة مئوية.
- رصد الخزان وسائل الإعلام وتجديد وسائل الإعلام الجديدة مع الضرورة.
- الحفاظ على الثقافة المتنامية باطراد لعدة مئات من الأجيال.
- بعد الانتهاء من لوحة اختيار عينة من الخلايا على لوحات أجار الصلبة. بعد أن نمت الخلايا في المستعمرات، واختيار عينة متحيزة من المستعمرات باستخدام المسواك وتطعيم الحيوانات المستنسخة في الآبار الفردية لوحة 96 جيدا تحتوي على 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام. تسمح عينات نسيلي أن تنمو بين عشية وضحاها، إضافة 100 ميكرولتر من 30٪ الجلسرين وتخزينها في -80 درجة مئوية.
- تميز الحيوانات المستنسخة من خلال تسلسل الجينوم كله وأداء فحوصات المظهري بما في ذلك تقييم اللياقة البدنية، وذلك باستخدام المشتركة سلالة مرجعية fluorescently المسمى، كما هو موضح في التطبيق 2. </ لى>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
والميزة الرئيسية لالكيموستات هو القدرة على التحكم في معدل نمو الخلايا تجريبيا من خلال تغيير معدل التخفيف. في الخميرة في مهدها، خميرة الخباز، مورفولوجية الخلية بالمعلومات من مرحلته في دورة انقسام الخلية. السكان مع ارتفاع معدلات النمو تحتوي على نسبة أعلى من تقسيم الخلايا بنشاط على النحو الذي يحدده قياس جزء من خلايا unbudded (الشكل 5A). وقد أظهرت التحاليل التي أجريت على التعبير مرنا في الثقافات العالمية ناظم كيميائي أن التعبير عن العديد من الجينات وأعرب تفاضلي بوصفها وظيفة من معدل النمو (أرقام 5B والشكل 5C).
اللياقة البدنية النسبية لمختلف الأنماط الوراثية يمكن تحديده من خلال إجراء فحوصات المنافسة في الكيموستات باستخدام خلايا fluorescently المسمى وتحليل التدفق الخلوي (الشكل 6A). ويبين الشكل 6B نتيجة ممثل فيها سلالة متحولة كان كوم peted ضد سلالة الموسومة fluorescently wildtype. في هذا المثال، سلالة متحولة لديه 40٪ معدل النمو ميزة لكل جيل. على سبيل المقارنة، تنافس سلالة wildtype معلم ضد الموسومة fluorescently سلالة wildtype لا تختلف في معدل النمو.
توفير الكيموستات وسيلة لممارسة الضغط الانتقائي تحديدا والمستمر على الخلايا. ويمكن استخدام تحليل تسلسل الجينوم كله لتحديد الطفرات في الخلايا المكتسبة مع زيادة اللياقة البدنية. وقد حددت التجارب تطور التكيف في خلايا الخميرة في مختلف الكيموستات محدودة المغذيات عدد النسخ كآلية المتكررة والمتكررة التي يتم إنشاؤها الطفرات التكيفية. على سبيل المثال، في تطور تجارب التكيف مستقلة أجريت في الكيموستات محدودة النيتروجين باستخدام مصادر النيتروجين المختلفة، متعددة عدد النسخ (التنوعات في عدد النسخ) التي تشمل تم تحديد الجين GAP1 11 (الشكل 7).
ر "> الكيموستات تشكل بعض التحديات الفريدة التي لم يتم اجه على خلاف ذلك في وسائل الميكروبيولوجية القياسية. مشاكل وحلول محددة لناظم كيميائي التجارب المحتملة يمكن العثور عليها في الجدول رقم 1.
الشكل 1. تخطيطي لناظم كيميائي. تضم ناظم كيميائي خزان سائل الإعلام، ومضخة، سفينة ناظم كيميائي، أنبوب مياه الصرف، وجمع وعاء.
الشكل 2. نموذج رياضي لناظم كيميائي. يصف المعادلة التفاضلية 1 التغير في كثافة الخلية (x) في ناظم كيميائي مع مرور الوقت، والذي هو نتيجة لنمو الخلايا وإزالة الخلايا عن طريق التخفيف (يفترض موت الخلايا لتكون ضئيلة). اقترح مونود 3 أن نمو الخلايا (μ) تعتمدق على تركيز المغذيات الخارجية وفقا لنوع العلاقة ميكايليس-منتن الذي يتضمن متغيرات معدل النمو القصوى (μ ماكس) وثابت معدل النمو نصف القصوى (K ق). يتم تحديد معدل التخفيف (D) من خلال معدل بالإضافة إلى ذلك وسائل الإعلام وإزالة الثقافة. المعادلة التفاضلية 2 يصف معدل التغير في تركيز المغذيات الحد (ق) في السفينة ناظم كيميائي. التغير في تركيز المغذيات الحد في السفينة ناظم كيميائي يعتمد على تركيزه في وسائل الإعلام المتدفق (R)، من خلال تخفيف تدفق (D) والاستهلاك من قبل الخلايا، والتي تعتمد على المعلمات الخلية μ ماكس، K ق والعائد المستمر، Y. للتبسيط، ويفترض أن تكون ثابتة Y بمعدلات نمو مختلفة. المتغيرات، وحداتهم نموذجي، في المعادلات التفاضلية العادية إلى جانب وس - أوكار خليةإيتي (خلية / مل)، ق - الحد من تركيز المغذيات (ميكرومتر)، μ ماكس - معدل النمو القصوى (-1 ساعة)، K و - تركيز المغذيات في معدل النمو الذي يساوي الحد الأقصى μ / 2 (ميكرومتر)، Y - العائد (خلية / مل / ميكرومتر)، د - تخفيف معدل (ساعة -1)، R - تركيز المغذيات في خزان سائل الإعلام (ميكرومتر).
الرقم 3. نهج ثابت للدولة كما تنبأ به النموذج الرياضي. تركيز المغذيات (الحمراء)، وكثافة الخلايا (الأزرق) تحقيق غير صفرية الدول مطرد.
الشكل 4. إنشاء مجموعة الحد من المغذيات. خميرة الخباز بتركيزات مختلفة من الجلوكوز وكثافة النهائي تحديدها. وثمة علاقة خطية يشير إلى أن تركيز المغذيات في نطاق الحد.
الجدول 1. جدول المشكلة والحلول الممكنة. 
الرقم 5. فسيولوجيا الخلية يختلف مع معدل النمو. وناظم كيميائي تمكن الدراسات التي تسيطر عليها العلاقة بين معدل النمو وA) انقسام الخلايا كما يعاير على أساس مورفولوجيا الخلايا (أي جزء من خلايا المبرعمة). وفرة ~ 25٪ من mRNAs والخميرة يعتمد على معدل النمو: الزيادات على سبيل المثال الجين B) UTR2 في التعبير كما يزيد معدل النمو في كل من الجلوكوز (س) و (Δ) الكيموستات محدودة النيتروجين والجين C) يقلل ASM1 في مستوى التعبير كما يزيد معدل النمو في مستوى السكر في (س) ومحدودة النيتروجين (Δ) الكيموستات 10. 
الرقم 6. المقايسات المنافسة في سلالة الكيموستات. A) اثنين من السلالات التي وصفت من قبل تفاضلي البروتينات الفلورية أعرب جوهري هي شارك في تربيتها في ناظم كيميائي واحد ويتم تحديد معدل التغير في الوفرة النسبية للسلالتين كل 2-4 أجيال باستخدام التدفق الخلوي. ب) اللياقة البدنية النسبية سلالة يتم تحديدها من قبل الانحدار الخطي سجل الطبيعية (LN) من راتيس من سلالتين ضد الزمن يقاس في الأجيال. انقر هنا لعرض أكبر شخصية . 
الرقم 7. اختيار المدى الطويل في الكيموستات يختار بكفاءة لالمسوخ مع زيادة اللياقة البدنية. وقد حدد تحليل الجينوم على نطاق من المسوخ إعادة ترتيب الكروموسومات المتكررة وتنوعات عدد النسخ (CNV) في المسوخ مع زيادة اللياقة البدنية. مستقلة التجارب التطور على التكيف في مختلف الظروف منظم النيتروجين النتائج في اختيار الأليلات CNV مختلفة في موضع GAP1 (demarked بواسطة الخطوط المنقطة الرمادي)، والذي بترميز بيرمياز الأحماض الأمينية العامة. كل نقطة البيانات هي نسبة عدد نسخ الحمض النووي في سلالة تطورت مقارنة مع لقياس الضغط cestral باستخدام ميكروأري الحمض النووي الذي يحلل كل الجينات في وقت واحد (أسود). مشكلة حل انخفاض الرقم الهيدروجيني في سفينة الثقافة. يمكن رصد درجة الحموضة في الوقت الحقيقي، والتي تسيطر عليها بالإضافة الآلي للحمض / قاعدة. بدلا من ذلك، وسائل الإعلام مخزنة يمكن استخدامها. خلايا Flocculant والأغشية الحيوية في سفينة الثقافة. الحفاظ على الثقافة تمتزج جيدا عن طريق تشغيل impellor في> 400 دورة في الدقيقة. النمو في خطوط تغذية وسائل الاعلام. استخدام الفلاتر في مدخل الميناء يقلل من احتمالات استعمار خطوط تغذية وسائل الاعلام. تزامن الخلية ومستقرة 2 هل التذبذبات طالكيموستات ن الكربون محدودة. هذه يمكن تجنبها باستخدام أعلى معدلات تخفيف وتجنب فترات طويلة من الجوع قبل الشروع في الثقافة التخفيف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الكيموستات تمكين زراعة الميكروبات في ظروف الحالة المستقرة التي تسيطر عليها النمو. الخلايا تنمو بشكل مستمر بمعدل ثابت مما يؤدي إلى بيئة خارجية ثابتة. هذا هو على النقيض من الأساليب ثقافة دفعة في البيئة الخارجية التي تتغير باستمرار ويتم تحديد معدل نمو الخلايا من خلال التفاعل المعقد بين البيئة وراثى. وهكذا، فإن الميزة الرئيسية لزراعة الميكروبات في الكيموستات على الثقافات الدفعة هو القدرة على التحكم تجريبيا معدل نمو الخلايا.
المعدل الذي ينمو خلية هو نتيجة التفاعلات بين العمليات الخلوية لا تعد ولا تحصى بما في ذلك الاستشعار عن المواد الغذائية، ونقل الإشارة، والتوليف الجزيئات والتمثيل الغذائي. يسمح باستخدام الكيموستات في تركيبة مع الأساليب التحليلية العالمية التحقيق في كيفية العمليات الأساسية معدل النمو الآثار في الخلية والعكس كيف ينظم وينسق عملية الخلية الخلوية مع معدل نموها. وقد أظهرت الدراسات في الخلايا wildtype أن تركيزات الخلوية من الحمض النووي الريبي والبروتينات تتأثر بعمق بنسب نمو الخلايا 6 ومؤخرا فقد تبين أن Transcriptome على 10،12،13 وmetabolome 8 تتأثر بشكل كبير بنسب نمو الخلايا.
دراسة السلوك متحولة في الكيموستات يوفر وسيلة قوية محتملة دراسة مسارات التي تعتبر مهمة لتنظيم معدل النمو 14. باستخدام إنتاجية عالية تسلسل مجموعات barcoded الجزيئية الآلاف من المسوخ 15 فمن الممكن الآن لمعدد هذه المقايسات تمكين الدراسات المنهجية لمتطلبات الجينية للنمو في بيئات محدودة المغذيات. تجدر الإشارة، مع ذلك، أن واحدة من القيود المفروضة على الكيموستات هو أنها لا تعالج عدم التجانس الكامنة في معدلات نمو الخلايا الفردية التي يمكن تقييمها باستخدام أساليب الفحص المجهري خلية واحدة 16.
الحمار = "jove_content"> الكيموستات أيضا توفير نظام مثالي لدراسة تطور الجراثيم. الحد المغذيات هو الضغط الانتقائي ذات الصلة من الناحية البيئية ومعدل النمو هو العنصر الرئيسي في اللياقة البدنية الميكروبية. يوفر ناظم كيميائي وسيلة للسيطرة على وجه التحديد الضغط الانتقائي ودراسة كيفية تطور الشبكات الجزيئية. تحديد مواضع الوراثية التي هي أهداف الاختيار وتثبت فائدة على التكيف في نفس محدودة المغذيات البيئة 11،17-20 يبشر فهم الأساس الوظيفي للتطور التكيف.
ويتزايد استخدام الكيموستات في مجالات جديدة من البحث بما في ذلك دراسة ديناميات النسخي 21،22 والتذبذبات الأيض 23-26. وقد ثبت تطبيقها في البيئة مفيدة في دراسة ديناميات المفترس والفريسة 27. وتجدد الاهتمام في تنظيم نمو الخلايا الثديية، وضعف في الأمراض التي تصيب البشر، قد تحفز العودة إلى ستودى من خلايا الثدييات في الكيموستات باستخدام الخلايا التي يمكن تربيتها في التعليق 28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل عن طريق بدء الأموال من جامعة نيويورك. نشكر مايتريا دنهام ومات براور الذي طور في البداية استخدام المفاعلات الحيوية Sixfors كما الكيموستات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Infors-HT Sixfors Chemostat | Appropriate Technical Resources, Inc. | ||
| Glass Bottle 9.5 L | Fisher Scientific | 02-887-1 | For Media Vessel and Hosing |
| Pinchcock | Fisher Scientific | 05-867 | For Media Vessel and Hosing |
| Stopper, Size 12, Green Neoprene | Cole-Palmer | EW-62991-42 | For Media Vessel and Hosing |
| Straight Connector | Cole-Palmer | EW-30703-02 | For Media Vessel and Hosing |
| General purpose ties 4 in | Fisher Scientific | NC9557052 | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone Rubber | Small Parts | B000FMWTDE | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone, 3/8 in OD | Fisher Scientific | 02-587-1Q | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone, 7/32 in OD | Fisher Scientific | 02-587-1E | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Stainless Steel, 3/16 in OD | McMaster-Carr | 6100K164 | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Stainless Steel, 3/8 in OD | McMaster-Carr | 6100K161 | For Media Vessel and Hosing |
| Hook Connectors | Fisher Scientific | 14-66-18Q | For Media Vessel and Hosing |
| Ratchet Clamp | Cole-Palmer | EW-06403-11 | For Media Vessel and Hosing |
| Luer, Female | Cole-Palmer | EW-45512-34 | For Media Vessel and Hosing |
| Luer, Male | Cole-Palmer | EW-45513-04 | For Media Vessel and Hosing |
| Millipore Aervent MTGR05010 62 mm Filter, 0.2 μm | Fisher Scientific | MTGR05010 | For Media Vessel and Hosing |
| PTFE Acrodisc CR 13 mm filters, 0.2 μm | Fisher Scientific | NC9131037 | For Media Vessel and Hosing |
| Direct-Reading Flowtube for Air | Cole-Palmer | EW-32047-77 | For Nitrogen Gas Setup |
| Direct-Reading Flowtube for Nitrogen | Cole-Palmer | EW-32048-63 | For Nitrogen Gas Setup |
| Gas Proportioner Multitube Frames | Cole-Palmer | EW-03218-50 | For Nitrogen Gas Setup |
| Regulator, Two-Stage Analytical | Airgas | Y12-N145D580 | For Nitrogen Gas Setup |
| Hose Adaptor, Stainless Steel | Airgas | Y99-26450 | For Nitrogen Gas Setup |
| Hose Male Adaptor | Airgas | WES544 | For Nitrogen Gas Setup |
| Norprene Tubing | US Plastics | 57280 | For Nitrogen Gas Setup |
| Tripod Base | Cole-Palmer | EW-03218-58 | For Nitrogen Gas Setup |
| Valve Cartridges | Cole-Palmer | EW-03217-92 | For Nitrogen Gas Setup |
| Carboy 10 L | Fisher Scientific | 02-963-2A | For Media Preperation |
| Steritop Sterile Vacuum Bottle-Top Filters, 1,000 ml, PES membrane; for 45 mm neck size | Fisher Scientific | SCGP-T10-RE | For Media Preperation |
| Media Bottle 100 ml, 45 mm neck size | Fisher Scientific | FB-800-100 | For Media Preperation |
| calcium chloride·2H2O | Fisher Scientific | C79-500 | Media Reagents |
| sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | Media Reagents |
| magnesium sulfate·7H2O | Sigma Aldrich | 230391 | Media Reagents |
| potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | AC424205000 | Media Reagents |
| ammonium sulfate | Fisher Scientific | AC423400010 | Media Reagents |
| potassium chloride | Sigma Aldrich | P9541 | Media Reagents |
| boric acid | Sigma Aldrich | B6768 | Media Reagents |
| copper sulfate·5H2O | Sigma Aldrich | 209198 | Media Reagents |
| potassium iodide | Sigma Aldrich | 60400 | Media Reagents |
| ferric chloride·6H2O | Fisher Scientific | I88-100 | Media Reagents |
| manganese sulfate·H2O | Sigma Aldrich | 230391 | Media Reagents |
| sodium molybdate·2H2O | Sigma Aldrich | M7634 | Media Reagents |
| zinc sulfate·7H2O | Fisher Scientific | Z68-500 | Media Reagents |
| biotin | Fisher Scientific | BP232-1 | Media Reagents |
| calcium pantothenate | Fisher Scientific | AC24330-1000 | Media Reagents |
| folic acid | Sigma Aldrich | F7876 | Media Reagents |
| inositol (aka myo-inositol) | Fisher Scientific | AC12226-1000 | Media Reagents |
| niacin (aka nicotinic acid) | Sigma Aldrich | N4126 | Media Reagents |
| p-aminobenzoic acid | Fisher Scientific | AC14621-2500 | Media Reagents |
| pyridoxine HCl | Sigma Aldrich | P9755 | Media Reagents |
| riboflavin | Sigma Aldrich | R4500-25G | Media Reagents |
| thiamine HCl | Fisher Scientific | BP892-100 | Media Reagents |
| Leucine | Sigma Aldrich | L8000-100G | Media Reagents |
| Uracil | Sigma Aldrich | U0750 | Media Reagents |
| Dextrose | Fisher Scientific | DF0155-08-5 | Media Reagents |
References
- Ingraham, J. L., Maaloe, O., Neidhardt, F. C. Growth of the Bacterial Cell. , Sinauer Associates, Inc. (1983).
- Cell Growth: Control of Cell Size. Hall, M. N., Raff, M. C., Thomas, G. , CSHL Press. (2004).
- Monod, J. La technique de culture continue, theorie et applications. Ann. Inst. Pasteur. 79, 390-410 (1950).
- Novick, A., Szilard, L.
- Kjeldgaard, N. O., Maaloe, O., Schaechter, M. The transition between different physiological states during balanced growth of Salmonella typhimurium. J. Gen. Microbiol. 19, 607-616 (1958).
- Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. Control of macromolecular synthesis. , W.A. Benjamin. (1966).
- Saldanha, A. J., Brauer, M. J., Botstein, D. Nutritional Homeostasis in Batch and Steady-State. Culture of Yeast. Mol. Biol. Cell. 15, 4089-4104 (2004).
- Boer, V. M., Crutchfield, C. A., Bradley, P. H., Botstein, D., Rabinowitz, J. D. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Mol. Biol. Cell. 21, 198-211 (2010).
- Boer, V. M., de Winde, J. H., Pronk, J. T., Piper, M. D. The genome-wide transcriptional responses of Saccharomyces cerevisiae grown on glucose in aerobic chemostat cultures limited for carbon, nitrogen, phosphorus, or sulfur. J. Biol. Chem. 278, 3265-3274 (2003).
- Brauer, M. J., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Mol. Biol. Cell. 19, 352-367 (2008).
- Gresham, D., et al. Adaptation to diverse nitrogen-limited environments by deletion or extrachromosomal element formation of the GAP1 locus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 18551-18556 (2010).
- Regenberg, B., et al. Growth-rate regulated genes have profound impact on interpretation of transcriptome profiling in Saccharomyces cerevisiae. Genome Biol. 7, R107 (2006).
- Castrillo, J. I., et al. Growth control of the eukaryote cell: a systems biology study in yeast. J. Biol. 6, 4 (2007).
- Cipollina, C., et al. Revisiting the role of yeast Sfp1 in ribosome biogenesis and cell size control: a chemostat study. Microbiology. 154, 337-346 (2008).
- Gresham, D., et al. System-level analysis of genes and functions affecting survival during nutrient starvation in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 187, 299-317 (2011).
- Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant. PLoS Biol. 10, e1001325 (2012).
- Kao, K. C., Sherlock, G. Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae. Nat. Genet. 40, 1499-1504 (2008).
- Gresham, D., et al. The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoS Genet. 4, e1000303 (2008).
- Wenger, J. W., et al. Hunger Artists: Yeast Adapted to Carbon Limitation Show Trade-Offs under Carbon Sufficiency. PLoS Genet. 7, e1002202 (2011).
- Dunham, M. J., et al. Characteristic genome rearrangements in experimental evolution of Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16144-16149 (2002).
- Ronen, M., Botstein, D. Transcriptional response of steady-state yeast cultures to transient perturbations in carbon source. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 389-394 (2006).
- Kresnowati, M. T. A. P., et al. When transcriptome meets metabolome: fast cellular responses of yeast to sudden relief of glucose limitation. Mol. Sys. Biol. 2, 49 (2006).
- Tu, B. P., Kudlicki, A., Rowicka, M., McKnight, S. L. Logic of the yeast metabolic cycle: temporal compartmentalization of cellular processes. Science. 310, 1152-1158 (2005).
- Tzur, A., Kafri, R., LeBleu, V. S., Lahav, G., Kirschner, M. W. Cell Growth and Size Homeostasis in Proliferating Animal Cells. Science. 325, 167-171 (2009).
- Conlon, I., Raff, M.
- Conlon, I. J., Dunn, G. A., Mudge, A. W., Raff, M. C.
- Fussmann, G. F., Ellner, S. P., Shertzer, K. W., Hairston, N. G. Crossing the hopf bifurcation in a live predator-prey system. Science. 290, 1358-1360 (2000).
- Cohen, E. P., Eagle, H. A simplified chemostat for the growth of mammalian cells: characteristics of cell growth in continuous culture. J. Exp. Med. 113, 467-474 (1961).
