Summary
Cellevekstraten er en regulert prosess og en primær determinant av cellefysiologi. Kontinuerlig dyrking ved hjelp chemostats muliggjør ytre kontroll av celleveksthastighet av næringsbegrensning å lette studiet av molekylære nettverk som kontrollerer cellevekst, og hvor disse nettverkene utvikles for å optimalisere cellevekst.
Abstract
Celler regulere veksten i respons til signaler fra den ytre verden. Som cellen vokser, må ulike cellulære prosesser koordineres inkludert makromolekylært syntese, metabolisme og til slutt, engasjement for celledeling syklus. Den chemostat, en metode for eksperimentelt kontrollerende celle vekst, gir et kraftig middel til systematisk å studere hvordan vekstraten påvirker cellulære prosesser - inkludert genuttrykk og metabolisme - og de regulatoriske nettverk som styrer frekvensen av cellevekst. Ved opprettholdt i hundrevis av generasjoner chemostats kan brukes til å studere adaptive utviklingen av mikroorganismer i miljøforhold som begrenser cellevekst. Vi beskriver prinsippet om chemostat kulturer, vise sin drift og gi eksempler på sine ulike programmer. Etter en periode med stillstand etter at de ble introdusert i midten av det tjuende århundre, konvergens av genom-skala metoder med en fornyet iterest i regulering av cellevekst og det molekylære grunnlaget for adaptiv evolusjon er stimulerende en renessanse i bruk av chemostats i biologisk forskning.
Introduction
Veksten av celler reguleres av komplekse nettverk av samspill genetiske og miljømessige faktorer 1,2. Den multifaktoriell regulering av cellevekst nødvendiggjør en system-nivå tilnærming til studien. Imidlertid er den grundige studier med regulert cellevekst utfordret av vanskeligheten med eksperimentelt å styre hastigheten som cellene vokser. Videre, i selv de enkleste eksperimentene ekstracellulære forholdene er ofte dynamisk og kompleks som celler kontinuerlig endre sine omgivelser som de sprer. En løsning på disse problemer er gitt av chemostat: en fremgangsmåte for dyrking av celler som gir eksperimentell kontroll av cellevekstrater i definerte, invariante og kontrollerte omgivelser.
Fremgangsmåten for kontinuerlig dyrking ved hjelp av en chemostat ble uavhengig beskrevet av Monod 3 og Novick & Szilárd 4 i 1950. Som opprinnelig tenkt, er celler dyrket i et bestemt volum av media som er conkontinuerlig å fortynnes ved tilsetning av nye medier og samtidig fjerning av gamle mediet og cellene (figur 1). Sammen ordinære differensialligninger (figur 2) beskriver hastigheten av endringen i celletetthet (x), og konsentrasjonen av et vekstbegrensende næringsstoff (er) i chemostat fartøyet. Viktigere, ligningssystemet spår en enkelt (null) stabil steady-state (figur 3) med bemerkelsesverdig implikasjon at ved steady-state, er lik den kursen den spesifikke vekstraten av celler (dvs. den eksponentielle veksten konstant) ved hvilken kulturen fortynnet (D). Ved å variere fortynning satsen er det mulig å etablere steady-state-populasjoner av celler ved forskjellige vekstrater og under forskjellige betingelser av næringsbegrensning.
Den eksperimentelle kontroll av vekst ved hjelp chemostats var kritisk til utviklingen av en forståelse av hvordan cellefysiologi endringermed vekstrater 5,6. Men dette tidligere bærebjelke i mikrobiologiske metoder ble stadig mer obskure under eksplosjonen i molekylær biologi forskning i løpet av slutten av det tjuende århundre. I dag, har fornyet interesse i vekst kontroll i både mikrober og flercellede organismer og bruk av metoder genom-skala for systemer-nivå analyse fornyet motivasjon for bruk av chemostats. Her beskriver vi tre programmer som kapitalisere på den presis kontroll av cellevekstrater og det ytre miljø som er unikt mulig hjelp chemostats. Først beskriver vi bruk av chemostats å undersøke hvordan den overflod av tusenvis av biomolekyler - for eksempel utskrifter og metabolitter - er coordinately regulert med veksten. For det andre, vil vi beskrive hvordan chemostats kan brukes for å oppnå nøyaktige beregninger av vekst-rate forskjeller mellom forskjellige genotyper i næringsstoff-begrensede miljøer ved hjelp av konkurranseeksperimenter. Tredje, vi beskrive hvordan chemostats kanbli brukt for å studere utviklingen av adaptive celler som vokser i faste næringsfattige omgivelser. Disse eksemplene er eksempler på hvilke måter chemostats er slik at systemene nivå undersøkelser av cellevekst regulering, genet miljø samspill og adaptiv evolusjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Prinsippet for kontinuerlig dyrking ved hjelp av en chemostat kan realiseres i forskjellige implementeringer. I alle chemostats er det viktig å ha en) fremgangsmåter for å opprettholde sterilitet av alle komponenter, 2) en godt blandet kultur, 3) hensiktsmessig lufting av dyrkings-beholderen, og 4) en pålitelig middel for medietilsetning og fjerning av kulturen. Her beskriver vi bruken av en Sixfors bioreaktor (INFORS Inc) som en chemostat ved hjelp av fremgangsmåter som lett kan tilpasses alternative oppsett.
En. Montering av Chemostat Vessels
- Slå på Sixfors med hovedbryteren.
- Skyll chemostat fartøy, røre forsamlingen, og festet slangen med avionisert (DI) vann. Sjekk alle slanger og o-ringer og bytt slitte ser stykker.
- Kontroller at drivakselen støttebasen er vendt opp i glasset fartøy og at toppen av drivakselen er festet til sin bolig på røre forsamlingen. Sett stirrer-enheten i glassbeholder som sikrer bunnen av drivakselen er festet i drivakselen støtte. Bruk klemme for å feste røreenheten til glassbeholderen.
- Fyll karet til rundt 300 ml DI-vann.
- Fjern hettene fra et oppløst oksygen (DO 2) probe og sjekke væskenivået ved å skru den nederste foringsrør og sørge for at den nederste foringsrør er fylt halvveis med elektrolytt løsning. Rescrew bunnen casing og sett inn i porten på chemostat fartøy. Skru til med fingrene.
- Ta en pH probe og fjerne det fra lagringsbuffer (3 M KCl). Ta av pH probe cap og feste til gjærings en. Bruke Sixfors kontrollbildet fermentoren parameter meny og velg "kalibrere pH". Plasser pH sonde inn i et standard pH 7 buffer og ta opp lesing som High Read. Gjenta med pH 4 buffer og ta opp lesing som lav Read. Løsne pH probe fra gjærings, vask med DI vann og før sonden into porten på chemostat fartøy. Skru til med fingrene.
- Plasser chemostat fartøy i stativet. Legg merke på fartøyet som fermentor (1-6) pH-sonden ble koblet til og kalibrert. Plasser pH-probe hetten på pH-probe. Ved hjelp av folie tett dekke toppen av do to probe.
- Brett folie over endene av røret er festet til chemostat fartøyet.
- Gjenta trinn 01.02 til 01.08 for alle fartøy.
- Steriliser ved autoklavering fartøyene dem i 15 minutter på en flytende syklus.
2. Klar Media
- Etablere begrensende konsentrasjonsområde for et næringsstoff ved å dyrke satskulturer i forskjellige næringskonsentrasjoner. Næringsstoffet er begrensende i det område hvor den endelige celletettheten er en lineær funksjon av den innledende konsentrasjonen av næringsstoffer (figur 4). Velg et næringsstoff konsentrasjon godt innenfor den begrensende område. Eksempler på standard media sammensetning for studier med Saccharomyces cerevisiae er tilgjengelige i 7-11.
- Autoklav en tom carboy som er avkortet med en gummiplugg som inneholder et luftinntak og media utløp etter første sikre at slutten av media slangen er dekket i folie.
- I en separat beholder klar 10 ml media.
- Fest en 500 ml filterkoppen til en 100 ml flaske media. Fjern bomullsfilteret med tang sterilisert i etanol og umiddelbart feste til filtrering porten på medie carboy.
- Fest media carboy til en vakuumkilde og filter sterilisere media ved å legge den til filterkoppen.
- Ved filtrering av mediet er fullført, lukkes av filtrerings-port med en metallklemme.
Tre. Kalibrering gjør to prober og Sette opp Chemostat
- Etter chemostat skip er autoklavert og avkjølt ned sted på fartøyet i det tilsvarende varmekappen. Koble temperaturføler, pH probe, og gjøre to probe. LaFartøyet sitte med makten på i minst 6 timer for å la de gjøre to sonder å polarisere.
- Plasser enden av hver avløpsrøret inn i en separat oppsamlingsbeholder. Koble lufttilførselen via en autoklaveres filteret og skru på luftstrømmen. Vannet i hver beholder skal flyte ut av avløpsrørene, noe som indikerer at alle pakninger er godt dannet.
- Justere høyden på avløpsrøret i henhold til den ønskede arbeidsvolum (for eksempel 300 ml). Vi bruker en linjal som er merket med tube plasseringer kalibrert til ulike arbeidsmengder.
- Koble medie carboy til chemostat fartøy. Bruk etanol for å holde rørendene så sterilt som mulig. Tråd pumpeslangen gjennom pumpen og åpne klemmen. Trykke manuelt pumpen til media begynner å strømme inn i chemostat fartøy. Slipp slangen fra pumpen, bør media strømme fritt inn chemostat fartøy. Når media når avløpsvannet rør, feste slangen til å pumpe og klemme.
- Begynn running den grunnleggende program med impeller satt til 400 rpm og temperaturen innstilt på 30 ° C.
- For å kalibrere gjøre to sonder, slå av lufttilførsel og bytte til nitrogengass. Vent i minst en time og registrere måleverdi som "low read". Bytt tilbake til lufttilførsel (dvs. inneholder ambient oksygenkonsentrasjon), vente minst én ekstra time og rekordmåling som "høy lese".
- Initiere dataregistrering ved hjelp av Iris programvare.
4. Inoculation
- Bruk 70% etanol for å sterilisere toppen av kulturbeholderen.
- Fjern skruen på fartøyets topp-og pipette 1 ml av en over natten kultur inn i chemostat fartøyet. Stram skruen.
- Angir tidspunktet for vaksinasjon i Iris.
- Vent ca 24 timer for kulturer å komme tidlig stasjonærfasen. Etter hvert som kulturen vokser, oppløst oksygen og pH reduseres. I tilfelle av glukose-begrensende media, vil oppløst oksygen tilbake til ~ 100% i stasjonær phase. For andre nærings begrensninger oppløst oksygen vil forbli <100% i stasjonær fase.
5. Initiere Pumper og oppnå Steady State
- Fortynningen Hastigheten beregnes ved å dividere strømningshastigheten (hvor mye mediet strømmer inn i karet per time) av volumet kultur. For eksempel, ved å bruke et volum på 300 ml en fortynningshastighet på 0,1 betyr at 30 ml av media blir tilsatt til kulturen hver time. Fordi systemet er under positivt trykk med samme volum blir fjernet fra beholderen slik at kulturen blir kontinuerlig fortynnet. Kan brukes En rekke fortynning priser (D) som ikke overstiger den maksimale vekstrate (μ max) av cellene, over hvilke celler som skal vaskes ut av chemostat.
- Velg pumpeinnstillinger, som angir antall sekunder pumpen er av og på, for å etablere ønsket vannmengde. Pumpen leverer mediet med en hastighet på ~ 0,11 ml / sek.
- Definere et program ved hjelp av Sixfors interface som angir pumpe timing, temperatur og impellor hastighet. Start programmet.
- Tømme oppsamlings beholdere med væske og registrere tiden.
- Etter minst to timer, må en gradert sylinder for å måle hvor mye media er blitt fjernet fra beholderen. Dette vil tilsvare volumet som har blitt lagt til chemostat fartøy. Beregn fortynning rate (D = V avløp / V kultur / tid). Juster pumpeinnstillinger hvis beregnet fortynning frekvensen ikke samsvarer med ønsket fortynning rate.
- Ved steady state, ikke celletettheten i chemostat ikke endres over tid. Dette kan måles uten perturbing kulturen ved prøvetaking utstrømningen. Vi operativt definerer oppnåelse av steady state som identiske celletetthetsmålinger som er atskilt med minst en populasjons-fordoblings. Reaching steady state vil ta cirka åtte kultur generasjoner etter oppstart av kultur fortynning. Ved steady state, celler vokse eksponentielt (i.e. konstant vekstrate over tid) i næringsbegrenset forhold. Doblingstiden av befolkningen (generasjonstiden) er ln (2) / D.
- Fortsett til periodisk måling av avløpsvolumer for varigheten av forsøket for å sikre at en konstant fortynning hastighet opprettholdes.
6. Søknad 1: Studerer celler som vokser på ulike priser i Steady-state betingelser
- Ved steady state i chemostat, er veksten av befolkningen i cellene lik fortynning rate. Ved systematisk å endre fortynningshastigheten er det mulig å dyrke celler med forskjellige satser. Dette gjør det mulig systematisk studium av fysiologiske parametre som varierer med vekstrate inkludert cellevolum, cellesyklustrinn og stresstoleranse. I tillegg kan steady-state profiler av global mRNA, proteiner og metabolitter analyseres i celler som vokser i forskjellig takt. Det er to måter å skaffe prøvene:
- Små utvalg kan være passivt obholdt ved å plassere enden av avløpsrøret i et 1,5 ml eller 15 ml tube. En prøve på 1-5 ml kan oppnås i løpet av få minutter (avhengig av strømningshastigheten). Mange fysiologiske parametre kan måles fra disse prøvene.
- Genekspresjon, eller metabolitter analyser krever større prøver som må oppnås så raskt som mulig. Plasser enden av utløpet røret inn i et 15 ml konisk rør. Løsne skruen som holder metallet slutten av avløpsvannet røret og trykk ned forsiktig. En ~ 10 ml prøve vil raskt fylle røret. Husk at volumet i chemostat fartøyet har endret seg. Hvis flere etterfølgende prøver er tatt, kan det være nødvendig å redusere strømning for å opprettholde en konstant fortynningshastigheten.
7. Søknad 2: nøyaktig måling av forskjeller i vekstrater mellom genotyper i kontrollerte omgivelser ved hjelp av flowcytometri basert konkurranse Analyser
- Chemostats kan brukes til nøyaktig å kvantifisere effekten av nærings konsentrasjonpå forskjeller i vekstrater (dvs. fitness) mellom ulike genetiske bakgrunn. Ved co-dyrking stammer merket med ulike fluorescerende proteiner frekvensen av endring i relativ overflod under eksponentiell vekst bestemmes. Utføre denne analysen på ulike utvannings priser (D) gjør studiet av effekter av nærings konsentrasjon (er) på fitness forskjeller.
- Etablere steady state kulturer av de to stammene i separate chemostat fartøy med identiske fortynning priser og et volum på 300 ml.
- Passivt prøve en ml fra hvert fartøy. Spinn ned cellene, resuspender i fosfatbufret saltvann (PBS) og sted ved 4 ° C. Disse prøvene inneholder homogene celleprøver, som er styringer for den etterfølgende strømningscytometri-analyse.
- Plasser avløpsrøret fra en beholder til en autoklaveres gradert sylinder. Løsne skruen som holder metallet slutten av avløpsvannet røret og trykk forsiktig ned for å fordrive celler fra chemostat. Nårvolumet har nådd 150 ml, returnerer metallet ende av avløpsrøret til sin opprinnelige posisjon (300 ml). Gjenta med det andre fartøyet, bruker en annen målesylinder.
- Bruk 70% etanol for å opprettholde sterilitet under fjerning av skruen på toppen av chemostat fartøyet. Plasser trakten ved åpning eller helle 150 ml fra den andre kulturen inn i chemostat fartøyet. Stram skruen. Gjenta fremgangsmåten med det andre fartøy ved hjelp av den andre trakt. Hver chemostat fartøyet inneholder nå en blanding av de to stammene.
- Skaff en 1 ml prøve fra hvert fartøy ved hjelp av passiv prøvetaking hver 2-6 time. Spinn ned celler, resuspender i PBS og oppbevar ved 4 ° C. Fortsett å ta prøver i 2-3 dager nøye å registrere tids hver prøve ble tatt.
- Ved slutten av forsøket, sonicate og fortynne prøvene til ~ 2 x 10 6 celler / ml. Ved hjelp av strømningscytometri, måle den andel av de to spenninger i hver prøve. Som begge stammer vokser eksponentielt, er den relative veksten forskjellfastsettes ved lineær regresjon for ln (strain1/strain2) mot tid (målt i generasjoner). Skråningen av regresjonen er proporsjonal forskjell i vekstrate (dvs. trim fordelen) av en stamme i forhold til den andre.
- Som den blandede kultur kan ta litt tid å oppnå en ny steady-state, kan tidlig tidspunkt passer dårlig til regresjon. Dette problemet er best løses ved at 2-3 generasjoner å gå før du starter prøvetaking eller fjerne tidlige punkter som er klare uteliggere. Motsatt, når en stamme har utkonkurrert de andre dataene ikke lenger er nyttig, og disse punktene bør utelukkes.
8. Søknad 3: Eksperimentell Evolution
- Eksperimentell utvikling utført i chemostats velger for mutanter som er økt i trenings i næringsbegrenset miljø. Utvalget er generelt utført over hundrevis av generasjoner.
- Etablere en steady-state chemostat kultur ved hjelp av en belastningav kjent genotype (og fortrinnsvis kjent genomsekvens) og en definert næringsstoff-begrensning.
- For å opprettholde en "fossilene" av tilpasning befolkningen passivt prøve chemostat hver 2-3 dager, og oppbevare prøven i 15% glyserol ved -80 ° C.
- Overvåke media reservoaret og etterfylle med fersk media som nødvendig.
- Opprettholde den eksponentielt voksende kultur for flere hundre generasjoner.
- Etter fullførelse av det merkede plate en prøve av celler med faste agarplater. Når cellene har vokst til koloniene, velge en objektiv prøve av koloniene ved hjelp av tannstikker og inokuler kloner i individuelle brønner i en 96-brønners plate inneholdende 100 ul medium. Tillat clonal prøver å vokse over natten, tilsett 100 mL 30% glyserol og butikk i -80 ° C.
- Karakter kloner av hele genomsekvensering og utfører fenotypiske analyser inkludert vurdering av egnethet, ved hjelp av en vanlig fluorescensmerkede referansen belastning, som beskrevet i Application to. </ Li>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En stor fordel med chemostats er evnen til å kontrollere veksten av celler eksperimentelt ved å variere fortynningshastigheten. I det spirende gjær, Saccharomyces cerevisiae, morfologi av en celle er informativ av sin fase i celledeling syklus. Populasjoner med høyere vekstrater inneholder en høyere andel av aktivt delende celler som bestemt ved å måle hvor stor del av unbudded celler (figur 5A). Analyser av global mRNA ekspresjon i chemostat kulturer har vist at ekspresjonen av mange gener som er differensielt uttrykt som en funksjon av vekstrate (figurene 5B og figur 5C).
Den relative egnethet av forskjellige genotyper kan bestemmes ved å utføre konkurrerende bestemmelser i chemostats ved hjelp av fluorescensmerkede celler og strømningscytometri-analyse (figur 6A). Figur 6B viser et representativt resultat som en mutant stamme ble com peted mot en fluorescently merket villtype belastning. I dette eksempelet har den mutante stamme en 40% vekst fordel per generasjon. Til sammenligning et ukodet villtype belastning konkurrerte mot fluorescently tagget villtype belastning skiller seg ikke i sin veksttakt.
Chemostats tilveiebringe en anordning for utøvelse av en definert og kontinuerlig selektivt press på cellene. Kan brukes hele genomet sekvens analyse for å identifisere ervervede mutasjoner i celler med økt kondisjon. Adaptive evolution eksperimenter i gjærceller i ulike nærings begrensede chemostats har identifisert kopi nummer varianter som en hyppig og gjentatt mekanismen som adaptive mutasjoner er generert. For eksempel, i uavhengige adaptive evolusjon eksperimenter utført i nitrogenbegrenset chemostats med forskjellige nitrogenkilder, varianter multiple kopitall (CNVs) som omfatter produksjonsgapet1-genet ble identifisert 11 (figur 7).
t "> Chemostats utgjøre noen unike utfordringer som ikke er ellers oppstått i standard mikrobiologiske metoder. Potensielle problemer og løsninger som er spesifikke for chemostat eksperimenter kan finnes i tabell 1.
Figur 1. Diagram av et chemostat. Den chemostat omfatter en medie reservoar, pumpe, en chemostat skip, en avløpsrøret, og en oppsamlingsbeholder.
Figur 2. Matematisk modell av chemostat. Differential ligning 1. beskriver endringen i celletetthet (x) i chemostat over tid, noe som er et resultat av cellevekst og cellefjerning ved fortynning (celledød er antatt å være neglisjerbar). Monod foreslått tre at cellevekst (μ) avhenges på eksterne næringsstoff konsentrasjon ifølge en Michaelis-Menten typen forhold som omfatter variabler av maksimal vekstrate (μ max) og en halv-maksimal vekstrate konstant (K s). Den fortynningshastigheten (D) er bestemt av frekvensen av mediet addisjon og fjerning av kulturen. Differensial ligning 2 beskriver hastigheten av endringen i den begrensende næringsstoff konsentrasjon (er) i chemostat fartøyet. Endringen i konsentrasjonen av det begrensende næringsstoff i chemostat fartøyet er avhengig av dets konsentrasjon i den innstrømmende medier (R), dens fortynning av utstrømningen (D), og forbruket av cellene, noe som er avhengig av celleparametere μ max, K s og med et utbytte konstant, Y. For forenkling, er Y antas å være konstant ved forskjellige vekstrater. Variablene, og deres typiske enheter, i kombinert ordinære differensialligninger er x - celle hitet (celler / ml), s - begrensende næringsstoff konsentrasjon (uM), μ max - maksimal veksthastighet (hr-1), K s - næringskonsentrasjonen ved hvilken vekst lik μ max / 2 (uM), Y - utbytte (celler / ml / mm), D - fortynning rate (hr -1), R - næringskonsentrasjon i medie reservoar (mikrometer).
Figur 3. Tilnærming til steady-state som spådd av den matematiske modellen. Nutrient konsentrasjon (rød) og celletetthet (blå) oppnår ikke-null jevn stater.
Figur 4. Etablering den begrensende utvalg av et næringsstoff. Saccharomyces cerevisiae ble dyrket ved forskjellige konsentrasjoner av glukose og den endelige tetthet bestemmes. En lineær sammenheng angir at konsentrasjonen av næringsstoffer i den begrensende område.
Tabell 1. Tabell over potensielt problem og løsninger. 
Figur 5. Celle fysiologi varierer med vekstrate. The chemostat muliggjør kontrollerte undersøkelser av forholdet mellom vekstraten og A) celledeling som analyseres på basis av cellemorfologi (dvs. den fraksjon av budded celler). Overflod av ~ 25% av gjær mRNA avhenger av vekstrate: for eksempel genet B) UTR2 økninger i uttrykk som vekstrate økninger i både glukose-(o) og nitrogenbegrenset (Δ) chemostats og genet C) ASM1 avtar i uttrykk nivå som veksten renteøkninger i glukose-(o) og nitrogen-begrenset (Δ) chemostats 10. 
Figur 6. Strain konkurranse essay i chemostats. A) To stammer som er forskjellig merket med fluorescerende konstitutivt uttrykte proteiner er ko-dyrket i en enkelt chemostat og frekvensen av forandring i den relative mengde av de to stammene er bestemt hver 2-4 generasjoner ved hjelp av strømningscytometri. B) Den relative egnethet av en belastning bestemmes ved lineær regresjon av den naturlige log (ln) av Ratio av de to stammene mot tid målt i generasjoner. Klikk her for å se større figur . 
Figur 7. Long-term valg i chemostats effektivt velger for mutanter med økt kondisjon. Genome-skala analyse av mutanter har identifisert hyppige kromosomavvik rearrangements og kopiere nummer variasjon (CNV) i mutanter med økt kondisjon. Uavhengige adaptive evolution eksperimenter i ulike nitrogen begrensende forhold resultater i utvalg for ulike CNV alleler på produksjonsgapet1 locus (demarked av grå stiplede linjer), som koder for generell aminosyre permeaseproteiner. Hvert datapunkt er forholdet mellom DNA-kopitall i den utviklede belastningen i forhold til encestral belastning målt ved hjelp av en DNA microarray som samtidig analyserer hvert gen (svart). Problem Oppløsning Lav pH i kultur fartøy. pH kan overvåkes i sanntid, og styrt ved automatisert tilsetning av syre / base. Alternativt kan bufrede medier anvendes. Flokkuleringsmiddel celler og biofilm i kultur fartøy. Hold kultur godt blandet ved å kjøre impellor ved> 400 rpm. Veksten i mediefôringslinjer. Bruken av filtre ved innløpsporten reduserer muligheten for kolonisering av papirinntrekking linjer. Cell synkronisering og stabile dO to svingninger in karbon begrenset chemostats. Disse kan unngås ved å bruke høyere fortynning priser og unngå lengre perioder med sult før oppstart av kultur fortynning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Chemostats muliggjøre dyrking av mikrober i vekstkontrollert steady-state. Cellene vokser kontinuerlig ved en konstant hastighet som resulterer i en invariant ytre miljø. Dette er i motsetning til satsvis kultur metoder hvor det ytre miljø er kontinuerlig skiftende og hastigheten av celleveksten er bestemt av et komplekst samspill mellom omgivelsene og genotype. Således er en stor fordel ved dyrkning av mikroorganismer i chemostats enn satskulturer evnen til eksperimentelt å kontrollere veksten av celler.
Den hastigheten som en celle vokser er et resultat av samspillet mellom utallige cellulære prosesser, inkludert nærings sensing, signaltransduksjon, makromolekylært syntese og metabolisme. Bruke chemostats i kombinasjon med globale analysemetoder gjør etterforskningen av hvordan veksten påvirker grunnleggende prosesser i cellen og omvendt hvordan cellen regulerer og samordner cellulære prosessen medsin veksttakt. Studier i villtype-celler har vist at cellulære konsentrasjoner av RNA og protein er dypt preget av hastigheter for cellevekst 6, og mer nylig har det blitt vist at transkriptom 10,12,13 og metabolome 8 er dramatisk påvirket av cellevekst.
Studiet av mutant atferd i chemostats gir en potensielt kraftig middel til å studere de banene som er viktige for vekst regulering 14. Ved hjelp av høy gjennomstrømming sekvensering av molekylære strekkode samlinger av tusenvis av mutanter 15 er det nå mulig å multiplekse disse analysene slik at systematiske studier av genetiske krav til vekst i næringsbegrensede miljøer. Det bør bemerkes imidlertid at en av begrensningene i chemostats er at de ikke behandler den underliggende heterogenitet i enkelte celle vekstrater som kan vurderes ved hjelp av enkle cellemikroskopi metoder 16.
11,17-20 holder løftet om å forstå den funksjonelle basis av adaptiv evolusjon.
Chemostats brukes stadig i nye områder av forskning blant annet studiet av transkripsjons dynamikk 21,22 og metabolske svingninger 23-26. Deres søknad i økologi har vist seg nyttig i studiet av rovdyr og byttedyr dynamikk 27. En fornyet interesse i pattedyrceller vekstregulering, og dens verdifall i menneskelig sykdom, kan motivere en retur til study av pattedyrceller in chemostats ved hjelp av celler som kan dyrkes i suspensjon 28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av oppstart midler fra New York University. Vi takker Maitreya Dunham og Matt Brauer som opprinnelig utviklet bruken av Sixfors bioreaktorer som chemostats.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Infors-HT Sixfors Chemostat | Appropriate Technical Resources, Inc. | ||
| Glass Bottle 9.5 L | Fisher Scientific | 02-887-1 | For Media Vessel and Hosing |
| Pinchcock | Fisher Scientific | 05-867 | For Media Vessel and Hosing |
| Stopper, Size 12, Green Neoprene | Cole-Palmer | EW-62991-42 | For Media Vessel and Hosing |
| Straight Connector | Cole-Palmer | EW-30703-02 | For Media Vessel and Hosing |
| General purpose ties 4 in | Fisher Scientific | NC9557052 | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone Rubber | Small Parts | B000FMWTDE | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone, 3/8 in OD | Fisher Scientific | 02-587-1Q | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone, 7/32 in OD | Fisher Scientific | 02-587-1E | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Stainless Steel, 3/16 in OD | McMaster-Carr | 6100K164 | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Stainless Steel, 3/8 in OD | McMaster-Carr | 6100K161 | For Media Vessel and Hosing |
| Hook Connectors | Fisher Scientific | 14-66-18Q | For Media Vessel and Hosing |
| Ratchet Clamp | Cole-Palmer | EW-06403-11 | For Media Vessel and Hosing |
| Luer, Female | Cole-Palmer | EW-45512-34 | For Media Vessel and Hosing |
| Luer, Male | Cole-Palmer | EW-45513-04 | For Media Vessel and Hosing |
| Millipore Aervent MTGR05010 62 mm Filter, 0.2 μm | Fisher Scientific | MTGR05010 | For Media Vessel and Hosing |
| PTFE Acrodisc CR 13 mm filters, 0.2 μm | Fisher Scientific | NC9131037 | For Media Vessel and Hosing |
| Direct-Reading Flowtube for Air | Cole-Palmer | EW-32047-77 | For Nitrogen Gas Setup |
| Direct-Reading Flowtube for Nitrogen | Cole-Palmer | EW-32048-63 | For Nitrogen Gas Setup |
| Gas Proportioner Multitube Frames | Cole-Palmer | EW-03218-50 | For Nitrogen Gas Setup |
| Regulator, Two-Stage Analytical | Airgas | Y12-N145D580 | For Nitrogen Gas Setup |
| Hose Adaptor, Stainless Steel | Airgas | Y99-26450 | For Nitrogen Gas Setup |
| Hose Male Adaptor | Airgas | WES544 | For Nitrogen Gas Setup |
| Norprene Tubing | US Plastics | 57280 | For Nitrogen Gas Setup |
| Tripod Base | Cole-Palmer | EW-03218-58 | For Nitrogen Gas Setup |
| Valve Cartridges | Cole-Palmer | EW-03217-92 | For Nitrogen Gas Setup |
| Carboy 10 L | Fisher Scientific | 02-963-2A | For Media Preperation |
| Steritop Sterile Vacuum Bottle-Top Filters, 1,000 ml, PES membrane; for 45 mm neck size | Fisher Scientific | SCGP-T10-RE | For Media Preperation |
| Media Bottle 100 ml, 45 mm neck size | Fisher Scientific | FB-800-100 | For Media Preperation |
| calcium chloride·2H2O | Fisher Scientific | C79-500 | Media Reagents |
| sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | Media Reagents |
| magnesium sulfate·7H2O | Sigma Aldrich | 230391 | Media Reagents |
| potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | AC424205000 | Media Reagents |
| ammonium sulfate | Fisher Scientific | AC423400010 | Media Reagents |
| potassium chloride | Sigma Aldrich | P9541 | Media Reagents |
| boric acid | Sigma Aldrich | B6768 | Media Reagents |
| copper sulfate·5H2O | Sigma Aldrich | 209198 | Media Reagents |
| potassium iodide | Sigma Aldrich | 60400 | Media Reagents |
| ferric chloride·6H2O | Fisher Scientific | I88-100 | Media Reagents |
| manganese sulfate·H2O | Sigma Aldrich | 230391 | Media Reagents |
| sodium molybdate·2H2O | Sigma Aldrich | M7634 | Media Reagents |
| zinc sulfate·7H2O | Fisher Scientific | Z68-500 | Media Reagents |
| biotin | Fisher Scientific | BP232-1 | Media Reagents |
| calcium pantothenate | Fisher Scientific | AC24330-1000 | Media Reagents |
| folic acid | Sigma Aldrich | F7876 | Media Reagents |
| inositol (aka myo-inositol) | Fisher Scientific | AC12226-1000 | Media Reagents |
| niacin (aka nicotinic acid) | Sigma Aldrich | N4126 | Media Reagents |
| p-aminobenzoic acid | Fisher Scientific | AC14621-2500 | Media Reagents |
| pyridoxine HCl | Sigma Aldrich | P9755 | Media Reagents |
| riboflavin | Sigma Aldrich | R4500-25G | Media Reagents |
| thiamine HCl | Fisher Scientific | BP892-100 | Media Reagents |
| Leucine | Sigma Aldrich | L8000-100G | Media Reagents |
| Uracil | Sigma Aldrich | U0750 | Media Reagents |
| Dextrose | Fisher Scientific | DF0155-08-5 | Media Reagents |
References
- Ingraham, J. L., Maaloe, O., Neidhardt, F. C. Growth of the Bacterial Cell. , Sinauer Associates, Inc. (1983).
- Cell Growth: Control of Cell Size. Hall, M. N., Raff, M. C., Thomas, G. , CSHL Press. (2004).
- Monod, J. La technique de culture continue, theorie et applications. Ann. Inst. Pasteur. 79, 390-410 (1950).
- Novick, A., Szilard, L.
- Kjeldgaard, N. O., Maaloe, O., Schaechter, M. The transition between different physiological states during balanced growth of Salmonella typhimurium. J. Gen. Microbiol. 19, 607-616 (1958).
- Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. Control of macromolecular synthesis. , W.A. Benjamin. (1966).
- Saldanha, A. J., Brauer, M. J., Botstein, D. Nutritional Homeostasis in Batch and Steady-State. Culture of Yeast. Mol. Biol. Cell. 15, 4089-4104 (2004).
- Boer, V. M., Crutchfield, C. A., Bradley, P. H., Botstein, D., Rabinowitz, J. D. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Mol. Biol. Cell. 21, 198-211 (2010).
- Boer, V. M., de Winde, J. H., Pronk, J. T., Piper, M. D. The genome-wide transcriptional responses of Saccharomyces cerevisiae grown on glucose in aerobic chemostat cultures limited for carbon, nitrogen, phosphorus, or sulfur. J. Biol. Chem. 278, 3265-3274 (2003).
- Brauer, M. J., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Mol. Biol. Cell. 19, 352-367 (2008).
- Gresham, D., et al. Adaptation to diverse nitrogen-limited environments by deletion or extrachromosomal element formation of the GAP1 locus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 18551-18556 (2010).
- Regenberg, B., et al. Growth-rate regulated genes have profound impact on interpretation of transcriptome profiling in Saccharomyces cerevisiae. Genome Biol. 7, R107 (2006).
- Castrillo, J. I., et al. Growth control of the eukaryote cell: a systems biology study in yeast. J. Biol. 6, 4 (2007).
- Cipollina, C., et al. Revisiting the role of yeast Sfp1 in ribosome biogenesis and cell size control: a chemostat study. Microbiology. 154, 337-346 (2008).
- Gresham, D., et al. System-level analysis of genes and functions affecting survival during nutrient starvation in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 187, 299-317 (2011).
- Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant. PLoS Biol. 10, e1001325 (2012).
- Kao, K. C., Sherlock, G. Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae. Nat. Genet. 40, 1499-1504 (2008).
- Gresham, D., et al. The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoS Genet. 4, e1000303 (2008).
- Wenger, J. W., et al. Hunger Artists: Yeast Adapted to Carbon Limitation Show Trade-Offs under Carbon Sufficiency. PLoS Genet. 7, e1002202 (2011).
- Dunham, M. J., et al. Characteristic genome rearrangements in experimental evolution of Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16144-16149 (2002).
- Ronen, M., Botstein, D. Transcriptional response of steady-state yeast cultures to transient perturbations in carbon source. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 389-394 (2006).
- Kresnowati, M. T. A. P., et al. When transcriptome meets metabolome: fast cellular responses of yeast to sudden relief of glucose limitation. Mol. Sys. Biol. 2, 49 (2006).
- Tu, B. P., Kudlicki, A., Rowicka, M., McKnight, S. L. Logic of the yeast metabolic cycle: temporal compartmentalization of cellular processes. Science. 310, 1152-1158 (2005).
- Tzur, A., Kafri, R., LeBleu, V. S., Lahav, G., Kirschner, M. W. Cell Growth and Size Homeostasis in Proliferating Animal Cells. Science. 325, 167-171 (2009).
- Conlon, I., Raff, M.
- Conlon, I. J., Dunn, G. A., Mudge, A. W., Raff, M. C.
- Fussmann, G. F., Ellner, S. P., Shertzer, K. W., Hairston, N. G. Crossing the hopf bifurcation in a live predator-prey system. Science. 290, 1358-1360 (2000).
- Cohen, E. P., Eagle, H. A simplified chemostat for the growth of mammalian cells: characteristics of cell growth in continuous culture. J. Exp. Med. 113, 467-474 (1961).
