Summary
Hücre büyüme oranı düzenlenmiş bir süreç ve hücre fizyolojisi temel belirleyicisidir. Chemostats kullanılarak sürekli kültürü, hücre büyümesini ve ne kadar bu ağlar hücre büyümesini optimize etmek için moleküler evrim kontrol ağların çalışma kolaylaştırmak besin kısıtlaması hücre büyüme hızının dışsal kontrol edilmesini sağlar.
Abstract
Hücreler, dış dünyaya gelen sinyallerine yanıt olarak büyüme hızını düzenler. Hücre büyüdükçe, çeşitli hücresel işlemleri makromolekül sentezi, metabolizma ve hücre bölünmesi döngüsü sonunda, bağlılık içeren koordine edilmelidir. Kemostat, deneysel olarak hücre büyüme hızının kontrol edilmesi için bir yöntem olup, sistematik olarak okuyan bir araç sağlar ne kadar güçlü bir büyüme etkileri hücresel süreçleri - ve hücre büyüme hızını kontrol eden düzenleyici ağlar - gen ifadesi ve metabolizma da dahil olmak üzere. Kuşak chemostats yüzlerce muhafaza zaman, hücre büyümesini sınırlamaya çevre koşullarında mikropların uyarlanabilir evrimini incelemek için kullanılabilir. Biz, kemostat kültürlerin ilkesi tanımlamak çalışmalarını gösteren ve çeşitli uygulama örnekleri sağlar. Yirminci yüzyılın ortasında kendi girişten sonra kullanmama dönemi takiben, ile genom ölçekli metodolojileri yakınsama bir yenilenditerest hücre büyümesi ve adaptif evrim moleküler temelinin düzenlenmesinde biyolojik araştırma chemostats kullanımında bir rönesans uyarıcı olduğunu.
Introduction
Hücrelerin büyümesi, genetik ve çevresel faktörler 1,2 etkileşen kompleks ağlarda düzenlenir. Hücre büyümesi çok faktörlü yönetmelik çalışmada bir sistem düzeyinde yaklaşımı gerektirmektedir. Bununla birlikte, düzenlenmiş hücre büyümesinin sıkı çalışma deneysel olarak hücrelerin büyüme hızını kontrol zorluğu tarafından meydan. Ayrıca, hatta en basit deneylerde hücre-dışı koşullar, çoğaldıkları olarak hücreler sürekli olarak çevreyi değiştirmek sık olarak, dinamik ve karmaşıktır. , Tanımlanmış değişmez ve kontrollü ortamlarda hücre büyüme oranlarının deneysel kontrol edilmesini sağlar hücrelerin kültürlenmesi için bir yöntem: bu sorunlara bir çözüm, kemostat tarafından sağlanmaktadır.
Bir kemostat kullanarak sürekli kültür ait yöntem, bağımsız bir şekilde, 1950'de Monod 3 ve Novick ve Szilard 4 tarafından tanımlanmıştır. Aslen tasarlandığı gibi, hücreler con medya sabit bir ses yetiştirilentinually yeni medya eski ve ortam ve hücre eşzamanlı çıkarılması (Şekil 1) eklenerek seyreltildi. Akuple diferansiyel denklemler (Şekil 2) hücre yoğunluğunda (x) ve bir kap içinde, kemostat büyüme sınırlayıcı besin (ler) konsantrasyonundaki değişim oranını tarif eder. Önemlisi, denklem bu sistem kararlı durumda, hücrelerin (yani üstel büyüme hızı sabit) spesifik büyüme oranı oranına eşit olduğu olağanüstü ima ile bir tek (sıfır olmayan) kararlı kararlı durum (Şekil 3) tahmin bu da kültür (D) seyreltilir. Seyreltme oranı değiştirilerek, farklı büyüme oranları ve de besin sınırlama farklı koşullar altında hücrelerin kararlı hal popülasyonları kurmak mümkündür.
Chemostats kullanarak büyüme hızı deneysel kontrolü nasıl hücre fizyolojisi değişiklikleri bir anlayışın geliştirilmesi için kritikbüyüme 5,6 oranları ile. Ancak, mikrobiyolojik yöntemlerle bu eski dayanak yirminci yüzyılda moleküler biyoloji araştırma patlama sırasında giderek belirsiz hale geldi. Bugün, mikrop ve çok hücreli organizmalar ve sistemler düzeyinde analiz için genom ölçekli yöntemler gelişiyle hem de büyüme kontrolü ilgiyi chemostats kullanımı için motivasyon yeniledi. Burada, biz hücre büyüme oranlarının hassas kontrolü ve chemostats kullanarak benzersiz mümkündür dış ortama yararlanmak üç uygulamalarını tanımlamak. Transkript ve metabolitler olarak - - koordineli bir büyüme oranı ile düzenlenir İlk olarak, biyomoleküllerin binlerce bolluğu araştırmak için chemostats kullanılmasını tarif eder. İkinci olarak, chemostats rekabet deneyleri kullanılarak sınırlı besin ortamlarında, farklı genotipler arasında büyüme hızı farklılıkları hassas tahminleri elde etmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar. Üçüncü olarak, biz tarif nasıl chemostats yapabilirsinizSürekli besin-fakir ortamlarda büyüyen hücrelerin adaptif evrimini incelemek için kullanılabilir. Bu örnekler chemostats çevre etkileşimleri ve adaptif evrim tarafından hücre büyüme regülasyonu, gen sistemleri düzeyinde soruşturma sağlayan hangi bir şekilde sergilemiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bir kemostat kullanarak sürekli kültür ilkesi uygulamaları çeşitli elde edilebilir. Bütün chemostats olarak tüm bileşenlerin steriliteyi korumaya 1) yöntemleri olması esastır, 2), iyi karıştırılmış, kültür, kültür kabı 3), uygun havalandırma ve ortam toplama ve kültür kaldırma 4) güvenilir bir araç. Burada, hali hazırda alternatif kurulumları için adapte edilebilir yöntemler kullanılarak, kemostat bir Sixfors biyoreaktör (Infors Inc) kullanımını tarif eder.
1.. Kemostat Gemiler Montaj
- Ana düğmeyi kullanarak Sixfors açın.
- Iyice kemostat gemi, karıştırıcı montaj, ve deiyonize (DI) su ile ekli boru durulayın. Tüm boru ve o-halkaları kontrol edin ve herhangi bir yıpranmış görünümlü parçaları değiştirin.
- Tahrik mili destek tabanı cam kap içinde ve tahrik milinin üst karıştırma düzeneği üzerinde yuva içine geçerek olduğu yukarı baktığından emin olun. Stirre ayarlayınTahrik milinin alt sağlanması cam kabına r düzeneği tahrik mili destek oturduğundan. Cam kabına karıştırma tertibatını sağlamak için kelepçenin kullanın.
- DI suyun yaklaşık 300 ml damar doldurun.
- Prob (2 dO) ve alt muhafazayı sökerek ve alt kılıf elektrolit solüsyonu ile yarım dolu olduğundan emin yaparak elektrolit seviyesini kontrol edin, bir çözünmüş oksijen kapaklarını çıkarın. Alt kasa Rescrew ve kemostat gemide noktasına takın. Parmak Sımsıkı kadar vidalayın.
- PH probu alın ve depolama tamponu (3 M KCl) çıkarın. PH probu kapağını çıkarın ve fermentörüne 1 ekleyin. Sixfors kontrol ekranını kullanarak, fermentörü parametre menüsüne gidin ve "pH kalibre" seçeneğini seçin. Standart bir pH 7 tampon ve Yüksek Okudum kayıt okuma içine pH probu yerleştirin. PH 4 tamponu ve Düşük okuyun gibi rekor okuma ile tekrarlayın. Fermantörden pH probu ayırın, DI su ile yıkayın ve prob int eklemeko kemostat gemide liman. Parmak Sımsıkı kadar vidalayın.
- Rafa kemostat gemi yerleştirin. PH değeri sonda bağlanır ve kalibre edilmiştir fermantör (1-6) kabın hakkında not. PH probu üzerinde pH prob kapağı yerleştirin. Folyo kullanarak sıkıca dO 2 prob üst kapağı.
- , Kemostat kabına bağlı boru uçlarından folyo katlayın.
- Tekrar tüm gemiler için 1,2-1,8 adımları.
- Bir sıvı döngüsü 15 dakika boyunca, onları otoklav ile sterilize damarları.
2. Medya hazırlanması
- Farklı besin konsantrasyonlarda toplu büyüme kültürleri ile bir gıda maddesi için konsantrasyonlarının sınırlayıcı aralığını oluşturulması. Nihai hücre yoğunluğu başlangıçtaki besin konsantrasyonunun doğrusal bir fonksiyonu (Şekil 4) olduğu besin aralığında sınırlamaktadır. De sınırlayan aralığında bir besleyici konsantrasyonu seçin. Saccharomyce birlikte çalışmaları için, standart ortam bileşimin örnekleris cerevisiae 7-11 mevcuttur.
- Önce medya hortumun ucu folyo kaplı emin olduktan sonra bir hava girişi ve medya çıkış içeren bir lastik tıpa ile kapatılmış boş damacana otoklavlayın.
- Ayrı bir kap içinde 10 L ortam hazırlar.
- 100 ml'lik bir şişe için bir ortam 500 ml filtre fincan takın. Etanol içinde sterilize forseps ile pamuk filtreyi kaldırmak ve hemen medya damacanaya filtrasyon noktasına takın.
- Filtre fincan ekleyerek ortamı sterilize bir vakum kaynağına ve filtre medya damacana takın.
- Ortam filtrasyon işlemi tamamlandığında, metal bir kelepçe ile filtrasyon noktasını kapatmaktadır.
3. DO 2 Probları kalibre ve Kemostat ayarlama
- Kemostat gemiler otoklava ve karşılık gelen ısı ceketi burası gemi soğumasına izin alındıktan sonra. Sıcaklık probu, pH probu ve dO 2 probu bağlamak. Letdamar dO 2 sondalar kutuplaşmaya izin vermek için en az 6 saat süreyle gücü ile otur.
- Ayrı bir toplama deponun her bir çıkış borusunun ucunu. Otoklavlanmış filtre aracılığıyla hava kaynağını bağlayın ve hava akımı açın. Her bir kap içinde su her bir tıkaç oluşturduğu olduğunu gösterir, çıkış borularının üzerinden akmalıdır.
- İstenilen çalışma hacminin (örneğin 300 ml) 'ye göre çıkış borusunun yüksekliği ayarlayın. Biz farklı çalışma hacimleri kalibre tüp yerleşimler ile işaretlenmiş bir cetvel kullanın.
- , Kemostat kabına ortam damacana bağlayın. Tüpü tutmak için etanol kullanarak mümkün olduğu kadar steril sona erer. Pompa ve açık kelepçe ile pompa hortumu geçirin. Medya kemostat kabına akmaya başlayıncaya kadar elle pompayı basın. Pompadan boru bırakın, medya kemostat kabına serbestçe akmalıdır. Medya atık borusunu ulaştığında, pompa ve boru kelepçe takın.
- Ru başlayınpervane 400 rpm seti ve 30 ° C'ye ayarlanmış sıcaklık ile temel programı nning
- , DO 2 sondaları kalibre hava beslemesini kapatın ve azot gazına geçmek için. "Düşük okuma" gibi en az bir saat ve kayıt ölçü değeri bekleyin. Geri (yani ortam oksijen konsantrasyonu içeren) hava kaynağına geçiş "yüksek okuma" gibi en az bir saat daha kayıt ve ölçüm bekleyin.
- Iris yazılımı kullanarak veri kaydı başlatın.
4. Aşılama
- Kültür kabın üst sterilize etmek için% 70 etanol kullanın.
- , Kemostat kabına kap üst ve pipet bir gecelik kültürü için 1 ml ilgili vida çıkarın. Vidayı tekrar sıkın.
- Iris aşılama zamanı gösterir.
- Kültürler, erken durağan fazı ulaşmak için yaklaşık 24 saat bekleyin. Kültür büyüdükçe, çözünmüş oksijen ve pH azalır. Glikoz, sınırlayıcı ortam durumunda, çözünmüş oksijen sabit pha olarak ~% 100 geri dönecektirse. Diğer sınırlamalar besin için çözünmüş oksijen durağan faz olarak <% 100 kalır.
5. Pompalar başlatılıyor ve Steady State Kavuşturulması
- Seyreltme oranı kültür hacmi ile (ne kadar ortam saatte tekneye döküldüğü) akış hızını bölünmesi ile hesaplanır. Örneğin, 300 ml 0.1 arasında bir seyreltme oranı, bir hacim kullanılarak ortam 30 ml kültüre her saat ilave edilir demektir. Sistem, aynı ses kültür sürekli olarak seyreltilmiştir sağlayarak kabın kaldırılır pozitif basınç altında olduğu için. Seyreltme oranları (D) ihtiva eden bir dizi hücre, kemostat yıkanarak olacak, yukarıda hücrelerin maksimum büyüme oranı (μ max), aşmamak kullanılabilir.
- İstenilen akış hızını kurmak için, pompa üzerinde ve kapalı saniye sayısını belirtmek pompa ayarlarını seçin. Pompa ~ 0.11 ml / sn 'lik bir oranda ortam sunar.
- Sixfors int kullanarak bir program tanımlayınPompa zamanlama, sıcaklık ve kanatçıklı hızını belirtir Hiperface. Programını başlatın.
- Sıvı toplanması kapları boşaltın ve saati kaydedin.
- En az iki saat sonra, kabın kaldırılmıştır ne kadar ortam ölçmek için bir dereceli silindir kullanır. Bu, kemostat kabına ilave edilmiş ses eşit olacaktır. Seyreltme oranı (D = V çıkış / V kültür / saat) hesaplayın. Hesaplanan seyreltme oranı istenilen seyreltme oranına uygun değilse pompa ayarlarını yapın.
- Kararlı durumda, Kemostat hücre yoğunluğu zamanla değişmez. Bu çıkış örnekleme ile kültür bozucu olmadan ölçülebilir. Biz operasyonel en az bir nüfus iki katına ayrılır özdeş hücre yoğunluğu ölçümleri gibi istikrarlı devlet ulaşılmasını tanımlar. Kararlı duruma ulaşma kültürü seyreltme başlandıktan sonra yaklaşık sekiz kültür nesiller alacaktır. Kararlı durumda, hücreler yani (katlanarak büyüyecekbesin sınırlı koşullar zamanla e. sabit büyüme oranı). Nüfusun (üretim süresi) katlama zamanı ln (2) / D.
- Aralıklarla sabit bir seyreltme oranı muhafaza edilmesini sağlamak için deney süresince çıkış birimleri ölçmek için devam edin.
6. Uygulama 1: Kararlı durum Koşullarında Farklı fiyatlara Yetiştirme Eğitim Hücreleri
- Kemostat istikrarlı halde, hücrelerin nüfus artış hızı seyreltme oranına eşittir. Sistematik seyreltme oranını değiştirerek farklı oranlarda hücre büyümesi mümkündür. Bu hücre hacmi, hücre döngüsü aşaması ve gerilme direnci dahil olmak üzere bir büyüme oranı ile değişir fizyolojik parametrelerin sistematik bir çalışma sağlar. Buna ek olarak, küresel mRNA, protein ve metabolit seviyelerinin kararlı durum profilleri farklı oranlarda büyüyen hücrelerde analiz edilebilir. Örnekleri elde etmek için iki yol vardır:
- Küçük örnekler pasif ob olabilirBir 1.5 ml veya 15 ml tüp içine çıkış borusunun ucunu yerleştirerek saklanmaktadır. 1-5 ml'lik bir örneği (akış hızına bağlı olarak) birkaç dakika içinde elde edilebilir. Birçok fizyolojik parametreler, bu örneklerden ölçülebilir.
- Gen ifadesi, ya da metaboliti analizler mümkün olduğunca çabuk elde edilmesi gereken daha büyük örnekleri gerektirir. 15 ml konik bir tüp içine çıkış borusunun ucunu. Atık borusunun metal ucunu tutarak vidayı bırakın ve yavaşça aşağı doğru itin. A ~ 10 ml numune hızla tüp dolduracaktır. Kemostat kapta hacmi değişti unutmayın. Birçok ardışık numuneler alınır eğer bir sabit seyreltme oranını korumak için akışını azaltmak için gerekli olabilir.
7. Uygulama 2: Sitometrisi-tabanlı Yarışması Tahliller kullanma Kontrollü Ortamlarda Genotiplerinin Arasındaki Artış Oranları Farklılıkların hassas ölçümü
- Chemostats doğru besin konsantrasyonunun etkisini ölçmek için kullanılabilirfarklı genetik geçmişleri arasındaki büyüme oranları (yani spor) farklılıklar üzerine. Farklı floresan ile etiketlenmiş proteinleri ortak kültür suşları ile üstel büyüme sırasında rölatif çokluk içinde değişim oranı belirlenir. Farklı seyreltme oranı (D), bu deneyi gerçekleştirmek spor farkların besleyici madde konsantrasyonu (ler) etkileri çalışma sağlar.
- Aynı seyreltme oranları ve 300 ml'lik bir hacme sahip ayrı kemostat damarlarda iki suşların sabit durum kültürleri oluşturulması.
- Pasif her bir kabın 1 ml numune. Hücreleri aşağı Spin, fosfat tekrar süspansiyon 4 ° C'de tuzlu su (PBS) ve yer tamponlu Bu örnekler daha sonra akış sitometrisi analizi için kontroller homojen hücre örnekleri, içerir.
- Bir otoklav dereceli bir silindir içine bir kabından çıkış tüpü yerleştirin. Atık borusunun metal ucunu tutarak vidayı bırakın ve yavaşça Kemostat hücreleri çıkarmak için aşağı doğru itin. Ne zamanhacmi, orijinal pozisyonuna (300 mi) ile çıkış borusunun metal ucunu döndürmek, 150 ml ulaşır. Farklı bir dereceli silindir kullanarak, ikinci kap ile tekrarlayın.
- , Kemostat kabın üstüne vidayı kaldırılırken sterilliği korumak için,% 70 etanol kullanın. Açıklığında huni ve kemostat damar içine, diğer kültürden 150 ml dökün. Vidayı tekrar sıkın. İkinci hunisi kullanılarak, ikinci kap ile tekrarlayın. Her kemostat kap artık iki suş bir karışımını içerir.
- Her 2-6 saatte pasif örnekleme kullanılarak her bir kap bir 1 ml bir örnek elde edilir. Hücreleri aşağı Spin, tekrar süspansiyon 4 ° C'de PBS ve mağaza 2-3 gün dikkatle her numune alındığı zaman kayıt için numune almaya devam.
- Deney, sonikasyon sonunda ve örnekleri ~ 2 x 10 6 hücre / ml 'ye seyreltilir. Akış sitometresi kullanılarak, her bir numune iki suşların oranını ölçer. Her iki suşları katlanarak büyüyor gibi, göreli büyüme oranı farkısüresi (nesiller olarak ölçülür) karşı ln lineer regresyon (strain1/strain2) ile belirlenmiştir. Regresyon eğimi diğer bir suş göreli (spor avantaj yani) büyüme oranında oransal fark olduğunu.
- Karışık bir kültür, yeni bir kararlı duruma ulaşmak için biraz zaman alabilir, erken kez puan gerileme kötü uygun olabilir. Bu sorun, en iyi 2-3 nesiller örnekleme başlayan veya berrak aykırı değer olan erken noktaları çıkarmadan önce geçmesini sağlayarak çözülür. Bir suş diğer outcompeted kez tersine, veriler artık yararlıdır ve bu noktaları ekarte edilmelidir.
8. Uygulama 3: Deneysel Evrim
- Chemostats gerçekleştirilen deneysel evrim besin sınırlı ortamda uygunluk artmıştır mutantlar için seçer. Seçim genellikle nesiller yüzlerce üzerinde gerçekleştirilir.
- Bir gerginlik kullanarak istikrarlı bir devleti kemostat kültür kurmakbilinen genotip (ve tercihen, bilinen genom dizisi) ve belirli bir besin sınırlama.
- Adapte nüfusun bir "fosil kayıtlarını" korumak için pasif 2-3 günde Kemostat örnek ve -80 ° C'de% 15 gliserol örneği saklamak
- Medya rezervuar izlemek ve gerektiğinde taze medya ile doldurmak.
- Birkaç yüz nesiller için katlanarak büyüyen kültürünü korumak.
- Seçim levhası katı agar plakaları üzerinde bir hücre numunesi tamamlandıktan sonra. Hücreler koloniler haline sonra kürdanlar kullanılarak koloni ilgili bir örnek almak ve ortam ihtiva eden 100 ul, 96 oyuklu bir plakanın oyuklarına ayrı klonlar inoküle. Klonal örnekleri, gece boyunca büyümeye -80 ° de% 30 gliserol ve deposunun 100 ul ekle izin ver
- Tüm genom sekanslama ve uygulama 2'de tarif edildiği gibi, uygunluk değerlendirilmesi dahil olmak üzere fenotipik Analizleri yapan ortak bir flüoresan etiketli referans suşu kullanılarak klonlar karakterize eder. '/ Li>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Chemostats önemli bir avantajı seyreltme oranının değiştirilmesiyle deneysel olarak hücrelerin büyüme hızını kontrol etme yeteneğidir. Tomurcuklanma Mayalarda Saccharomyces cerevisiae, bir hücre morfolojisi, hücre bölünme döngüsündeki kendi fazın bilgilendirici. Daha yüksek büyüme oranları ile Nüfus unbudded hücrelerin fraksiyonu (Şekil 5A) ölçülerek belirlenir aktif olarak bölünen hücreler daha yüksek bir oranda içerir. Kemostat kültürlerde küresel mRNA ifadesinin analizi, çok sayıda genin ekspresyon diferansiyel büyüme oranı (Şekil 5B ve Şekil 5C) bir fonksiyonu olarak ifade edilmiştir göstermiştir.
Farklı genotipleri nispi spor floresanla işaretlenmiş hücreler kullanılarak chemostats rekabet deneyleri yapılarak belirlendi ve sitometri analizi (Şekil 6A) akış edilebilir. Şekil 6B, bir mutant soy com edildiği temsili bir sonuç göstermektedir Bir floresan etiketli yabani tip türüne karşı peted. Bu örnekte, mutant suş üretimi başına% 40 büyüme avantajı vardır. Karşılaştırma olarak, etiketsiz yabanitip gerginlik büyüme hızı farklıdır değildir yabanitip gerginlik etiketlendi Floresan karşı yarıştı.
Chemostats hücreleri üzerinde belirgin ve sürekli bir selektif basınç uygulamak için bir araç sağlar. Tüm genom dizi analizi artan uygunluk ile hücrelerde elde edilen mutasyonları tespit etmek için kullanılabilir. Farklı besin sınırlı chemostats maya hücrelerinde Adaptive evrim deneyler kopya sayısı uyarlanabilir mutasyonlar üretilen hangi bir yaygın ve tekrarlayan bir mekanizma olarak varyantlarını belirledik. Örneğin, farklı nitrojen kaynaklarını kullanarak nitrojen sınırlı chemostats gerçekleştirilir bağımsız adaptif evrim deneylerde, birden fazla kopya sayısı GAP1 gen 11 (Şekil 7) tespit edilmiştir içermesi (CNVs) varyantlarını içerir.
t "> Chemostats aksi standart mikrobiyolojik yöntemlerle karşılaşılan olmayan bazı benzersiz zorluklar oluşturmaktadır. Potansiyel sorunlar ve deneyler Kemostat özgü çözümler Tablo 1'de bulunabilir.
Şekil 1. Bir kemostat diyagramı. Kemostat bir rezervuar ortamı, pompa, kemostat kap, bir çıkış tüpü ve bir toplama kabı ihtiva eder.
Şekil 2. , Kemostat matematiksel modeli. Diferansiyel denklem 1, hücre büyümesi ve seyreltme (hücre ölümü ihmal edilebilir olduğu kabul edilir) ile hücre kaldırma sonucudur zaman, kemostat hücre yoğunluğunda değişim (x), anlatılmaktadır. Monod hücre büyümesi (μ) bağlı olduğunu 3 önerdimaksimal büyüme oranı (μ max) ve bir yarı-maksimal büyüme oranı sabiti (K ler) in değişkenleri içeren bir Michaelis-Menten tipi ilişkiye göre dış besin konsantrasyonuna s. Seyreltme oranı (D) ortam toplama ve kültür kaldırma oranı ile belirlenir. Diferansiyel denklem 2, kemostat kap içindeki sınırlandırıcı besleyici konsantrasyonu (ler) in değişim oranını tarif eder. , Kemostat kap içindeki sınırlayıcı besin konsantrasyonundaki değişim hücre parametreleri μ maksimum bağlıdır hücreleri tarafından akan ortam içindeki konsantrasyonu (R), çıkış (D) tarafından, seyreltme ve tüketim, K s bağlıdır ve sürekli bir verim, Y. Basitleştirilmesi için, Y, farklı büyüme oranları ile sabit olduğu varsayılır. Hücre dens - birleştiğinde adi diferansiyel denklemlerde değişkenler ve onların tipik birimler, x vardırSığ (hücre / ml), s - besin konsantrasyonu (iM) sınırlayıcı, μ max - maksimum büyüme oranı (saat -1), K s - büyüme hızı μ max / 2 (iM) eşit olduğu besin konsantrasyonu, Y - verim (hücre / ml / iM), D - seyreltme oranı (saat -1), R - medya haznesinde besin konsantrasyonu (mcM).
Şekil 3,. Matematiksel modelin öngördüğü gibi kararlı duruma yaklaşım. Besin konsantrasyonu (kırmızı) ve hücre yoğunluğu (mavi) sıfır olmayan istikrarlı devletler ulaşmak.
Şekil 4. Bir besin kısıtlayıcı aralığını oluşturmak. Saccharomyces cerevisiae suşu bir haploid, glikoz ve belirlenen nihai yoğunluk farklı konsantrasyonda büyütüldü. Doğrusal bir ilişki besin konsantrasyonu sınırlayıcı aralığında olduğunu gösterir.
Tablo 1. Potansiyel sorun ve çözümleri tablo. 
Şekil 5,. Hücre Fizyolojisi büyüme oranına bağlı olarak değişir. Kemostat büyüme oranı ve (aşılı hücrelerin fraksiyonu örneğin) hücre morfolojisi bazında analiz edilen bir) hücre bölünmesi arasındaki ilişkinin kontrollü çalışma sağlar. Maya mRNA'ların% 25 ~ bolluğu büyüme oranına bağlıdır: glikoz-(o hem de büyüme hızı artar) ve azot-sınırlı (Δ) chemostats ve gen C ekspresyonunda, örneğin gen B) UTR2 artar) ASM1 azalır büyüme oranı glikoz-(o) artışlara ve azot-sınırlı (Δ) olarak ifade seviyesi 10 chemostats. 
Şekil 6,. Chemostats Uzama rekabet deneyleri. A) farklı olarak kurucu olarak ifade floresan proteinleri ile etiketlenmiş iki suş tek kemostat co-kültürlenmiştir ve iki suşların rölatif çokluk içinde değişim oranı nispi dayanıklılık. B akış sitometrisi kullanılarak her 2-4 kuşakları) saptanır suşunun ora doğal log (İn) doğrusal regresyon ile belirlenirnesillerinde ölçülen zamana karşı iki suşları o. büyük rakam görmek için buraya tıklayın . 
Şekil 7. Chemostats uzun vadeli seçim verimli artan uygunluk ile mutantlar için seçer. Mutantların Genom-ölçek analizi sık kromozom anomalileri tespit ve artan uygunluk ile mutantlar sayı varyasyon (KNV) kopya etti. Genel amino asit permeaz kodlar (gri noktalı çizgilerle demarked) GAP1 odağı farklı CNV allelleri için seçimi farklı azot sınırlayıcı koşullar sonuçlarında bağımsız adaptif evrim deneyleri. Her bir veri noktası An ile karşılaştırıldığında gelişmiş bir suş içerisinde DNA kopya sayısı oranıdırcestral gerginlik anda her genini (siyah) analizleri DNA mikro kullanılarak ölçüldü. Sorun Çözüm Kültür kabı içinde düşük pH. pH gerçek zamanlı olarak izlenir ve asit / baz otomatik eklenmesiyle kontrol edilebilir. Seçenek olarak ise, tamponlu ortam kullanılabilir. Flokülan hücreleri ve kültür kabı içinde biyofilm. Iyi> 400 rpm'de kanatçıklı çalıştırarak karışık kültür tutun. Ortam besleme hatları büyüme. Giriş ağzı da filtrelerin kullanımı Ortam besleme hatlarının kolonizasyon potansiyelini azaltır. Hücre senkronizasyon ve istikrarlı dO 2 salınımlar in karbon sınırlı chemostats. Bu yüksek seyreltme oranları kullanılarak ve Kültür seyreltme başlamadan önce açlık, uzun süreli kaçınarak önlenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Chemostats büyüme kontrollü kararlı hal koşulları mikropların ekimi etkinleştirin. Hücreler, değişmeyen bir dış çevre ile sonuçlanan sabit bir oranda sürekli olarak büyür. Bu durum, dış çevre, sürekli değişen ve hücre büyüme oranı çevre ve genotip karmaşık etkileşimi ile belirlenen küme kültür yöntemlerin aksine bulunmaktadır. Bu nedenle, toplu kültürler üzerinde chemostats içinde mikropları kültür önemli bir avantajı, deneysel olarak hücrelerin büyüme hızını kontrol etme yeteneğidir.
Bir hücre büyür hangi hızı besin algılama, sinyal iletimi, makromoleküler sentez ve metabolizması dahil olmak üzere sayısız hücresel süreçleri arasındaki etkileşimin sonucudur. Global analitik yöntemler ile birlikte chemostats kullanıcıya sağlar araştırılması nasıl hücre düzenler ile hücresel işlemi koordinatları nasıl tersine büyüme etkilerin oranı temel hücre süreçleri vebüyüme hızı. Yabani tipteki hücrelerde çalışmalar RNA ve protein konsantrasyonları, hücre derece hücre büyümesi 6 oranları ile etkilenen ve daha yakın zamanda transcriptome 10,12,13 ve metabolome 8 önemli ölçüde hücre büyüme oranları ile etkilenen olduğu gösterilmiştir göstermiştir.
Chemostats mutant davranış çalışma büyüme hızı regülasyonu 14 için önemli olan yollarını inceleyerek potansiyel olarak güçlü bir araç sağlar. Mutantlar 15 bin moleküler Barkodlanan koleksiyonları, yüksek verimli sekanslamayı kullanmak, sınırlı besin ortamlarında büyüme için genetik gereklerine sistematik çalışmalar sağlayarak, bu tahliller multiplex artık mümkündür. Bu chemostats sınırlamaları biri de tek hücreli mikroskobik yöntemleri 16 kullanılarak değerlendirilebilir bireysel hücre büyüme oranlarında yatan heterojenliğini düŒmeyebileceœinin olduğunu, ancak unutulmamalıdır.
11,17-20 kendi adaptif yarar kanıtlamak adaptif evrim fonksiyonel temelini anlamak sözünü tutar.
Chemostats giderek transkripsiyonel dinamikleri 21,22 ve metabolik salınımlar 23-26 çalışmanın da dahil olmak üzere yeni araştırma alanlarında kullanılmaktadır. Ekoloji Onların uygulama av-avcı dinamikleri 27 çalışmada yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Memeli hücre büyümesi yönetmelik ve insan hastalığı kendi değer düşüklüğü bir ilgiyi, stu dönüşü motive edebilirsüspansiyon 28 kültürlenebilir hücreleri kullanılarak chemostats memeli hücre dy.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Bu çalışma fonlar New York University oluşturmak başlatmak tarafından desteklenmiştir. Biz başlangıçta chemostats olarak Sixfors biyoreaktörlerin kullanımını geliştirdi Maitreya Dunham ve Matt Brauer teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Infors-HT Sixfors Chemostat | Appropriate Technical Resources, Inc. | ||
| Glass Bottle 9.5 L | Fisher Scientific | 02-887-1 | For Media Vessel and Hosing |
| Pinchcock | Fisher Scientific | 05-867 | For Media Vessel and Hosing |
| Stopper, Size 12, Green Neoprene | Cole-Palmer | EW-62991-42 | For Media Vessel and Hosing |
| Straight Connector | Cole-Palmer | EW-30703-02 | For Media Vessel and Hosing |
| General purpose ties 4 in | Fisher Scientific | NC9557052 | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone Rubber | Small Parts | B000FMWTDE | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone, 3/8 in OD | Fisher Scientific | 02-587-1Q | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone, 7/32 in OD | Fisher Scientific | 02-587-1E | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Stainless Steel, 3/16 in OD | McMaster-Carr | 6100K164 | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Stainless Steel, 3/8 in OD | McMaster-Carr | 6100K161 | For Media Vessel and Hosing |
| Hook Connectors | Fisher Scientific | 14-66-18Q | For Media Vessel and Hosing |
| Ratchet Clamp | Cole-Palmer | EW-06403-11 | For Media Vessel and Hosing |
| Luer, Female | Cole-Palmer | EW-45512-34 | For Media Vessel and Hosing |
| Luer, Male | Cole-Palmer | EW-45513-04 | For Media Vessel and Hosing |
| Millipore Aervent MTGR05010 62 mm Filter, 0.2 μm | Fisher Scientific | MTGR05010 | For Media Vessel and Hosing |
| PTFE Acrodisc CR 13 mm filters, 0.2 μm | Fisher Scientific | NC9131037 | For Media Vessel and Hosing |
| Direct-Reading Flowtube for Air | Cole-Palmer | EW-32047-77 | For Nitrogen Gas Setup |
| Direct-Reading Flowtube for Nitrogen | Cole-Palmer | EW-32048-63 | For Nitrogen Gas Setup |
| Gas Proportioner Multitube Frames | Cole-Palmer | EW-03218-50 | For Nitrogen Gas Setup |
| Regulator, Two-Stage Analytical | Airgas | Y12-N145D580 | For Nitrogen Gas Setup |
| Hose Adaptor, Stainless Steel | Airgas | Y99-26450 | For Nitrogen Gas Setup |
| Hose Male Adaptor | Airgas | WES544 | For Nitrogen Gas Setup |
| Norprene Tubing | US Plastics | 57280 | For Nitrogen Gas Setup |
| Tripod Base | Cole-Palmer | EW-03218-58 | For Nitrogen Gas Setup |
| Valve Cartridges | Cole-Palmer | EW-03217-92 | For Nitrogen Gas Setup |
| Carboy 10 L | Fisher Scientific | 02-963-2A | For Media Preperation |
| Steritop Sterile Vacuum Bottle-Top Filters, 1,000 ml, PES membrane; for 45 mm neck size | Fisher Scientific | SCGP-T10-RE | For Media Preperation |
| Media Bottle 100 ml, 45 mm neck size | Fisher Scientific | FB-800-100 | For Media Preperation |
| calcium chloride·2H2O | Fisher Scientific | C79-500 | Media Reagents |
| sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | Media Reagents |
| magnesium sulfate·7H2O | Sigma Aldrich | 230391 | Media Reagents |
| potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | AC424205000 | Media Reagents |
| ammonium sulfate | Fisher Scientific | AC423400010 | Media Reagents |
| potassium chloride | Sigma Aldrich | P9541 | Media Reagents |
| boric acid | Sigma Aldrich | B6768 | Media Reagents |
| copper sulfate·5H2O | Sigma Aldrich | 209198 | Media Reagents |
| potassium iodide | Sigma Aldrich | 60400 | Media Reagents |
| ferric chloride·6H2O | Fisher Scientific | I88-100 | Media Reagents |
| manganese sulfate·H2O | Sigma Aldrich | 230391 | Media Reagents |
| sodium molybdate·2H2O | Sigma Aldrich | M7634 | Media Reagents |
| zinc sulfate·7H2O | Fisher Scientific | Z68-500 | Media Reagents |
| biotin | Fisher Scientific | BP232-1 | Media Reagents |
| calcium pantothenate | Fisher Scientific | AC24330-1000 | Media Reagents |
| folic acid | Sigma Aldrich | F7876 | Media Reagents |
| inositol (aka myo-inositol) | Fisher Scientific | AC12226-1000 | Media Reagents |
| niacin (aka nicotinic acid) | Sigma Aldrich | N4126 | Media Reagents |
| p-aminobenzoic acid | Fisher Scientific | AC14621-2500 | Media Reagents |
| pyridoxine HCl | Sigma Aldrich | P9755 | Media Reagents |
| riboflavin | Sigma Aldrich | R4500-25G | Media Reagents |
| thiamine HCl | Fisher Scientific | BP892-100 | Media Reagents |
| Leucine | Sigma Aldrich | L8000-100G | Media Reagents |
| Uracil | Sigma Aldrich | U0750 | Media Reagents |
| Dextrose | Fisher Scientific | DF0155-08-5 | Media Reagents |
References
- Ingraham, J. L., Maaloe, O., Neidhardt, F. C. Growth of the Bacterial Cell. , Sinauer Associates, Inc. (1983).
- Cell Growth: Control of Cell Size. Hall, M. N., Raff, M. C., Thomas, G. , CSHL Press. (2004).
- Monod, J. La technique de culture continue, theorie et applications. Ann. Inst. Pasteur. 79, 390-410 (1950).
- Novick, A., Szilard, L.
- Kjeldgaard, N. O., Maaloe, O., Schaechter, M. The transition between different physiological states during balanced growth of Salmonella typhimurium. J. Gen. Microbiol. 19, 607-616 (1958).
- Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. Control of macromolecular synthesis. , W.A. Benjamin. (1966).
- Saldanha, A. J., Brauer, M. J., Botstein, D. Nutritional Homeostasis in Batch and Steady-State. Culture of Yeast. Mol. Biol. Cell. 15, 4089-4104 (2004).
- Boer, V. M., Crutchfield, C. A., Bradley, P. H., Botstein, D., Rabinowitz, J. D. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Mol. Biol. Cell. 21, 198-211 (2010).
- Boer, V. M., de Winde, J. H., Pronk, J. T., Piper, M. D. The genome-wide transcriptional responses of Saccharomyces cerevisiae grown on glucose in aerobic chemostat cultures limited for carbon, nitrogen, phosphorus, or sulfur. J. Biol. Chem. 278, 3265-3274 (2003).
- Brauer, M. J., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Mol. Biol. Cell. 19, 352-367 (2008).
- Gresham, D., et al. Adaptation to diverse nitrogen-limited environments by deletion or extrachromosomal element formation of the GAP1 locus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 18551-18556 (2010).
- Regenberg, B., et al. Growth-rate regulated genes have profound impact on interpretation of transcriptome profiling in Saccharomyces cerevisiae. Genome Biol. 7, R107 (2006).
- Castrillo, J. I., et al. Growth control of the eukaryote cell: a systems biology study in yeast. J. Biol. 6, 4 (2007).
- Cipollina, C., et al. Revisiting the role of yeast Sfp1 in ribosome biogenesis and cell size control: a chemostat study. Microbiology. 154, 337-346 (2008).
- Gresham, D., et al. System-level analysis of genes and functions affecting survival during nutrient starvation in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 187, 299-317 (2011).
- Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant. PLoS Biol. 10, e1001325 (2012).
- Kao, K. C., Sherlock, G. Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae. Nat. Genet. 40, 1499-1504 (2008).
- Gresham, D., et al. The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoS Genet. 4, e1000303 (2008).
- Wenger, J. W., et al. Hunger Artists: Yeast Adapted to Carbon Limitation Show Trade-Offs under Carbon Sufficiency. PLoS Genet. 7, e1002202 (2011).
- Dunham, M. J., et al. Characteristic genome rearrangements in experimental evolution of Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16144-16149 (2002).
- Ronen, M., Botstein, D. Transcriptional response of steady-state yeast cultures to transient perturbations in carbon source. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 389-394 (2006).
- Kresnowati, M. T. A. P., et al. When transcriptome meets metabolome: fast cellular responses of yeast to sudden relief of glucose limitation. Mol. Sys. Biol. 2, 49 (2006).
- Tu, B. P., Kudlicki, A., Rowicka, M., McKnight, S. L. Logic of the yeast metabolic cycle: temporal compartmentalization of cellular processes. Science. 310, 1152-1158 (2005).
- Tzur, A., Kafri, R., LeBleu, V. S., Lahav, G., Kirschner, M. W. Cell Growth and Size Homeostasis in Proliferating Animal Cells. Science. 325, 167-171 (2009).
- Conlon, I., Raff, M.
- Conlon, I. J., Dunn, G. A., Mudge, A. W., Raff, M. C.
- Fussmann, G. F., Ellner, S. P., Shertzer, K. W., Hairston, N. G. Crossing the hopf bifurcation in a live predator-prey system. Science. 290, 1358-1360 (2000).
- Cohen, E. P., Eagle, H. A simplified chemostat for the growth of mammalian cells: characteristics of cell growth in continuous culture. J. Exp. Med. 113, 467-474 (1961).
