Summary
在这个协议中，我们展示了如何驾驭的条件蜜蜂的触觉刺激和引进的2D动作捕捉技术的运动学分析精细尺度的触角采样模式。
Abstract
蜜蜂（ 蜜蜂 L.）是典型的社会性昆虫，其复杂的劳动分工和联想学习能力1，2众所周知的。工蜂花上半年在昏暗的蜂巢，他们的生活，他们是护士的幼虫或建设正六边形梳子食品（ 如花粉或花蜜）和育雏3。非凡的多感官触角，触角和各种触觉介导的任务，包括蜂巢5号楼和模式识别6中发挥了举足轻重的作用。以后在生活中，每个单一蜜蜂离开蜂巢饲料，用于食品。然后，一只蜜蜂学习歧视有利可图的食物来源，记住它们的位置，并将其传达到它的巢队友7。蜜蜂用不同的花卉信号，如颜色或气味，7，8，但也有触觉线索，从花瓣表面形成多感官记忆的食物来源。在实验室的合作的条件，蜜蜂可以训练，学习模式食欲，区分触觉的物体的特征，如边缘或沟槽，其触角10日，11日，12日，13。这种学习模式是密切相关的经典嗅觉空调的长鼻延伸反应（PER）的利用，蜜蜂14。在实验室中的触觉学习范式的优点是将与各种生理测量，包括触角的运动模式的分析，对学习行为实验相结合的可能性。
Protocol
1。准备蜜蜂
- 花蜜或花粉觅食，被发现在该领域无论是从蔗糖进纸器或直接从蜂巢入口，而返回的觅食之旅。每一个单一的蜜蜂被捕获到的玻璃小瓶，用泡沫插件进入实验室作进一步处理，并立即采取关闭。
- 在实验室中，捕获的蜜蜂进行了简要冷却冰箱在4°C不动，直到他们首先显示的迹象。
- 每个单一的固定化蜜蜂被安装在一个小的金属管与粘合带之间的头部和胸部和腹部上。长鼻和天线是可自由移动的，应小心。
- 油漆的固定用白色油漆的蜜蜂（ 例如无溶剂TIPP-EX），以堵塞视觉的复眼和单眼。
- 加一小滴融化的蜡头后面的蜜蜂来解决它在录音磁带头部和胸部之间，以防止头部运动。
- 一些在磁带上，更好地识别标记每个单蜜蜂和将管子固定的蜜蜂到一个潮湿的环境，以防止脱水。
- 互相喂单一的蜜蜂，持续5秒的30％的蔗糖溶液，用注射器的液滴，并让所有蜜蜂恢复与触觉的调理协议开始之前30分钟。
2。轻触式空调
- 在调节之前，每个单个的蜜蜂将测试其长鼻扩展响应（PER）到30％蔗糖的刺激施加到的触角。由此，将吸管尖端具有交叉的虚拟线之间的打开的下颌骨。丢弃所有的蜜蜂不响应的PER蔗糖刺激。
- 对于触觉空调使用的黄铜多维数据集（ 例如，3×5毫米）与平稳或刻图案， 例如 ，水平或垂直槽形成的光栅150微米波长，作为条件刺激（CS）。 F或非条件刺激（US）使用了30％的蔗糖溶液（户糖，在水中稀释）。
- 黄铜立方体（CS）被放置到一个保持器上显微操作（ 例如 MM33Märzhäuser）的，以确保在调节过程中的精确定位。美国提出了填充用30％的蔗糖溶液，用注射器的蜜蜂。
- 的调理过程包括五个审间5分钟的时间间隔（ITI）的触觉刺激（CS）和蔗糖溶液（US）的配对。将前面的显微操作器与所安装的触觉刺激（CS）中的一个单一的蜜蜂。位置CS缓慢，使得触觉刺激的表面是平行的蜜蜂的头部（ 图1中A和 B）。动物和触觉对象之间的距离应该是在测试蜜蜂触角的工作半径的范围内， 即在一个舒适的位置w的蜜蜂应该是能够扫描的触觉刺激第i个两个天线。在图1中所示的例子中，距离是3毫米。让蜜蜂扫描触觉刺激（CS），持续5秒。后的第3秒内，呈现出30％的蔗糖溶液（US）用注射器下长鼻液滴。使用的注射器的前端轻轻抬起长鼻。蔗糖刺激下的长鼻将引起每15个非条件。让蜜蜂舔蔗糖的奖励。使用秒表与一个报警信号，以维持精确的时间间隔期间空调。
- 空调PER的用作蜜蜂学习成功的量度。蜜蜂开始后的第一个奖励配对，以应对CS演示文稿延长他们的长鼻，这表明他们期待即将出台的奖励。完全伸出长鼻过程中随时观察到3秒的时间窗口之前的触觉刺激呈现和蔗糖介绍，取得了积极的响应。无响应计数负面的。在OCC的PER的urrence必须注意由实验者。每次试验的比例绘制蜜蜂的市盈率在CS介绍。
3。运动录音
- 一个单一的驾驭蜜蜂触角变动记录有数字视频相机透镜（ 如巴斯勒A602f-2配备技术规格VZM 200的操作，在50 fps的通过一个防火电线连接）与一个合适的宏。是相机处于上方的动物中的自顶向下的视图（ 图1 A）。在图1中，在录音的空间分辨率为0.02毫米/像素。
- 校准摄像头，通过记录一个10×10毫米的棋盘与从不同方位下的摄像头的目标的边缘的长度为1毫米的单的照片。校准可以用的摄像机标定工具箱Matlab的16。
- 下面的相机镜头放置一个固定的蜜蜂。目前的触觉刺激，固定显微操作，给动物。继续以同样的方式所描述的触觉空调，和记录触角运动而蜜蜂被扫描对象。充分触角的工作范围和触觉的刺激，这是很重要的是可见的。刺激模式的选择，测试和，试验数字取决于实验的设计。
4。数据分析
- 在Matlab计算图像的背景。首先，随着时间的推移的平均灰度值，要对每一个像素计算。静态对象，如固定头的蜜蜂和触觉刺激，将构成图像的背景。移动的物体，如两个天线，不会成为背景的一部分。
- 所记录的视频的每个帧的顺序加载，和当前帧的图像的背景之间的差异具有以被计算。相减的结果，强调的移动从帧到帧的图像中的那些部分。编号两坳一隆一斜坡，触角的蜜蜂的非零值（ 图1C）的唯一区域。
- 进行进一步的处理，两个最大的非零象素值的区域被假定为与天线。要产生含有对每一个像素的值1，如果像素属于天线和值，否则为0，对于这两种天线的二进制掩码。这个面膜是为本土化触角提示后，以此为基础。要获得初步的掩模对整个图像的差分图像的各像素的灰度值进行比较，以一个预先定义的阈值。因为我们照顾的噪音阈值选择是相当低的。初步面膜之后，还进行两种类型的错误：第一，由于图像噪声小区域仍有部分的面膜。其次，属于天线的领域，可能不一定完全连接。后者多发生，如果背景具有大致相同的发光作为天线。为了消除这些文物，图像处理形态学操作应用， 即图像的侵蚀和扩张相结合，依赖于标准的Matlab的功能imerode和imdilate（见17页158-205作进一步的解释）。经过去噪的过程中，天线的假设仍然包含在相同的面具。因此，作为下一个步骤的二进制掩码集中不相交的区域，使用标准的Matlab：功能bwlabel（的图像分割算法的进一步详情，请参阅17页40-48）。
- 在每个群集的像素的数目进行计数，并选择两个最大的群集。重心计算区分之间的左和右的天线（ 图1D）。
- 群集的近端到远端的方向（参见图1D）中的最高值的像素在一个可以被定义为为每个天线的触角小费。
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Representative Results
在下面的实验中，我们研究了，触觉学习如何在蜜蜂的行为影响触角采样。对于这一点，我们监测的天真和空调蜜蜂触角尖端之前和期间提交的触觉刺激的运动。
首先，自发触角花粉觅食一组（N = 42）的运动记录，持续1分钟。蜜蜂的二分之一（N = 21），然后，空调的配对5次用30％的蔗糖的奖励的触觉刺激。这是空调基。触觉刺激是30×50毫米的黄铜表面的立方体，一个刻有的水平光栅（λ= 150微米）。蜜蜂（N = 21）的另一半没有空调和作为一个天真基。 图2示出了空调组蜜蜂的平均学习曲线。自发行为（ 图2，空调PER后的第一个奖励的百分比是显着不同的第三奖励。
触角尖端的运动在两个空调和幼稚基之后再次记录在触觉刺激的存在下，持续1分钟。 图3，A 1 - B 2示出了在这两个群体的触角的尖端位置的分布，之前和期间演示文稿触觉对象。两者，幼稚和空调组改变他们的触角的运动模式中存在的触觉刺激相比，自发行为。搜索和/或样品区的刺激触角尖端的可能性显着增加，如果刺激，呈现自发的触角运动，触觉抽样涉及在触角的运动模式相比，一个显着的变化。这才是真正的蜜蜂（ 图3 C 1和C这两个群体的
总之，从本实验的结果展示，蜜蜂可以训练非常有效地作出反应的触觉刺激，并且，伴随着增加激活触觉学习已经搜索和采样行为。
图1。视频录制和触角跟踪程序。 答：自顶向下一个固定的蜜蜂和触觉刺激。触觉刺激定位在前面的头部的固定闭塞眼睛蜜蜂。它位于触角工作范围内。 d和p表示相对于动物的远端和近端的位置，B：相同的蜜蜂和侧视图的触觉刺激。触觉刺激和蜜蜂的头部（蓝色虚线）的表面是彼此平行的。C：判别移动从静态的视频序列中的像素的像素。减去每个图像从背景模型的移动部分， 即 ，一个可以识别ntennae。固定磁头的蜜蜂和触觉刺激（此处为红色虚线表示）是静态的和不可见的减法运算后，D：定义左，右和触角尖端。最大的两个减法后的像素群被确定为天线。的重心的计算允许区分左侧（红色）和右（绿色）的天线。可以被定义为针对每个天线（黑色交叉）在远侧方向上具有最大的值的像素在一个集群的触角的尖端。
图2。学习曲线的触觉PER空调。花粉觅食被训练使用五个配对的CS（触觉刺激）和美国（蔗糖溶液）审间的间隔为5分钟。 21只积极响应的百分比绘制的自发的行为（spont）和du每个空调试验后环介绍的CS。的百分比每发现后的第一个和所有以下奖励是显着不同的自发行为（Fisher确切概率检验，P <0.001）。
图3为1分钟的期间内的触角的尖端位置的归一化的平均分布。每个蜂触角前端分布进行归一每只动物的数据点的总数目。从天真（左，N = 21）和空调蜜蜂（右面板显示的结果，N = 21）（A）和在刺激呈现（B）。A 1，A 2：自发的触角运动刺激呈现前。横轴表示触角尖端的横向位置，相对于第e中央的头部（与图1C和 D比较）。纵轴表示触角尖远侧位置。色标表示触角尖端略去在任何给定的位置的时间的百分比。记录周期为1分钟的时间是相当于3000的视频帧。B 1和B 2：与在A 1,2相同 ，但在刺激呈现C 1和C 2：触角的尖端部位于内部的帧的平均数目的对象区域， 即 ，±3箱的远端或近端相对的刺激表面。 C1：天真组; C2：条件组。箱须图显示，平均中位数，四分位数，和每分钟的帧数量的5％至95％的百分范围。在这两个群体的蜜蜂，有一个显着的区别“无刺激”（A）和“刺激”（B，C，Wilcoxon符号秩检验，C 1：P = 5.39×10 -4，C 2 10-5）。平均帧数在触觉刺激呈现显着较大的空调蜜蜂比天真蜜蜂（采用Mann-Whitney U检验，C 1 - C 2：P = 0.007）。 点击此处查看大图 。
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Discussion
蜜蜂制备：收集和固定的蜜蜂应该迅速完成，以保持动物的低应力水平。应激反应的影响，因此，可能有间接影响的学习表现在蜜蜂19，20。的应力水平可以降低由放置玻璃小瓶，与直接在冰上的蜜蜂采集后立即迅速固定它们。必须加以考虑，蜜蜂需要更多的时间来恢复麻醉期间之前的时间越长。
视觉触觉学习有负面影响，在蜜蜂18。因此，重要的是要堵塞所画的动物的眼睛的视觉。为了增加的视觉对比度的视频记录，它是推荐使用白色油漆（ 例如 ，蒂普-Ex的）。应小心不与油漆接触得到的触角。
学习的性能：在实验室和现场的以往的研究表明，蔗糖敏感性影响蜜蜂觅食联想学习能力，21，22。高蔗糖敏感性正相关，具有更好的触觉收购和歧视的表现。花粉的蜂蜜蜂群的觅食响应蔗糖比花蜜觅食的觅食赛季第23周的平均。他们可以很容易地确定他们的后腿的花粉负载和夹在蜂巢入口。高糖灵敏度可以被捕获的花蜜觅食的觅食季节的结束，九月和十月之间。他们可以选择在人工喂料器充满了低浓度白糖水，放置约20米的距离蜂房23。
的学习表现和记忆的形成在很大程度上取决于饱食状态的蜜蜂在空调25。较长的饥饿周边OD前空调， 如，隔夜，可以提高的联想学习行为，提高动机水平的动物。
轻触式空调：每次被用作无条件响应，食欲学习协议14。因此，至关重要的是，所有的测试蜜蜂正呈现出完全伸展每无条件刺激（刺激糖），然后调节。蜜蜂不响应的糖刺激以及蜜蜂的PER空调的触觉刺激之前的触角接触过程中被丢弃。否则，这些动物的反应将非常低或非常高的变乱天下人的学习曲线。
本协议中使用的多维数据集的水平光栅（黄铜）的触觉刺激是随机选择的。蜜蜂也可以调节各种形状和纹理（见10）在不同的触觉刺激。
要比较不同群体的蜜蜂（ 如花粉与花蜜觅食）的收购，收购的得分，可以计算21。这个分数是空调的CS总数的，它有一个介于0（无空调PER）和5（每个空调试验后，空调PER）。
视频分析：在过去不同的视频分析方法被用来量化的改变，蜜蜂26，27在触角的运动行为。我们的方法具有的优点的分析触角，而不需要从各种图像处理工具在Matlab触角和福利的反射标记的变动。作为一个例子，也可以分析天线阻抗匹配定时朝着一个对象的人接触，确定触角运动的速度，计算在参照体轴的角度位置的触角或区分左和右触角运动。
以每个记录的对象，在空调蜜蜂触角反应过程中发生的，可能会影响以后的天线自动检测。在这种情况下，这是必要的编辑在VirtualDub中， 例如电影，并掩盖了干扰的检测处理， 例如通过覆盖的部分，在那里出现的长鼻带有灰色层相同形状的对象，该对象。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢约阿希姆·埃伯向我们介绍的触觉学习模式，蜜蜂。这项工作是由群集支持的卓越277 CITEC，资助在德国卓越计划的框架。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pollen foragers, Apis mellifera L. | Private hives | ||
| Glass vials (22 x 45 mm) | Carl Roth GmbH Co | X655.1 | |
| Brass tubes, 10 x 30 mm | Self-produced | ||
| Brass cube, 3 x 5 mm | Self-produced | ||
| Tipp-Ex (solvent-free) | Tipp-Ex GmbH Co KG | ||
| Sucrose solution (30%) | Household suger diluted in water | ||
| Ethanol (70%) | Carl Roth GmbH Co | 9065.3 | |
| Syringe (1 ml) and needle (0.6 x 25) | Carl Roth GmbH Co | 59.1 | |
| Stop Watch | Carl Roth GmbH Co | L423.1 | |
| Micromanipulator | Märzhäuser MM33 | 00-42-101-0000 | |
| Digital video camera | Basler A602f-2 | ||
| Macro lens for camera | TechSpec VZM 200 | ||
| Matlab R2009b | The MathWorks |
References
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