Summary
このプロトコルでは、条件に触覚刺激にミツバチを活かしたとファインスケール触角サンプリングパターンの運動を解析するための2Dモーションキャプチャ技術を導入する方法を示しています。
Abstract
ミツバチ（ セイヨウミツバチ L.）は真社会性昆虫であるとよく労働と連想学習能力1、2のその複雑な除算で知られています。働き蜂は、彼らが幼虫の介護や食品（ 例えば花粉や花の蜜）とひな3の正六角形の櫛を構築している暗いハイブ、内側に自分の人生の最初の半分を費やしています。アンテナは臨時五感触手あり、ハイブビル5と6パターン認識を含む様々な触覚媒介タスク4、極めて重要な役割を果たす。その後の人生で、それぞれ単一の蜂が食べ物をあさるにハイブを残す。すると蜂は、収益性の高い食品のソースを区別その場所を記憶し、7その巣の仲間にそれを伝えるために学ばなければならない。蜂は食料源の多感覚記憶を形成するために、花弁表面9から色や臭い、7,8のような別の花の信号だけでなく、触覚的手がかりを使用しています。研究室の共同の下nditionsは、ミツバチは、それらのアンテナ10、11、12、13とエッジや溝などの触覚のオブジェクト機能を、区別するために食欲の学習パラダイムに訓練することができます。この学習パラダイムは密接に活かさ蜂14でテングザルの拡張応答（PER）の古典的な嗅覚のコンディショニングに関連しています。実験室における触覚学習パラダイムの利点は、触角運動パターンの分析を含む様々な生理学的測定と学習に行動実験を組み合わせることの可能性である。
Protocol
1。蜂の準備
- 採餌旅行から帰国しながら花の蜜や花粉飼料収穫機は、スクロースフィーダから、または直接ハイブの入り口から、どちらかのフィールドでキャッチされます。各シングル蜂は泡栓で閉じ、さらなる処理のための実験室にすぐに取られるガラスバイアル中に取り込まれます。
- 彼らは不動の最初の兆候を示し°Cまでの研究室では、キャプチャされたミツバチは簡潔に4℃冷蔵庫で冷却される。
- 各シングル固定化されたハチは、頭部と胸部の間に粘着テープで、腹部の上に小さな金属管に装着されています。ケアは、口吻とアンテナは自由に移動可能であるように注意してください。
- ビジョンを閉塞する白色塗料（ 例えば無溶媒ティペックス）の固定ミツバチの複眼と単眼をペイント。
- 録音中にヘッドの動きを防ぐために、頭部と胸部の間にテープにそれを修正するために蜂の頭の後ろに溶けたワックスの小滴を追加。
- 識別しやすくするために、テープ上の番号で各単蜂をマークし、脱水を防ぐために、湿気のある大気中に固定されたハチとチューブを配置します。
- シリンジを用いて提示され、30％ショ糖溶液の液滴と5秒間、各単一蜂を養うために、触覚コンディショニングプロトコルで始まる前に、すべてのハチが30分間回復させる。
2。触覚コンディショニング
- エアコンの前に、各単蜂がアンテナに適用し、30％スクロース刺激に対する口吻拡張応答（PER）のためにテストする必要があります。それによって、口吻の先端が開いた下顎骨の間に仮想回線を横断する必要があります。ショ糖刺激にPERで応答しないすべてのハチを捨ててください。
- 触覚のコンディショニングのために条件刺激（CS）のように、150μmの波長と回折格子を形成し、 例えば 、平滑または刻まれたパターンが水平方向または垂直方向の溝と真鍮のキューブ（ 例えば 3×5 mm）を使用しています。 Fまたは無条件刺激（US）は、30％ショ糖溶液（家庭用の砂糖、水で希釈した）を使用します。
- 真鍮キューブ（CS）は、コンディショニング手順の間に正確な位置決めを確実にするために（ 例えば 、MärzhäuserMM33）マイクロマニピュレータにホルダーに置かれます。米国は、30％ショ糖溶液が充填されたシリンジを持つ蜂に提示されます。
- 条件付けの手続きは5分の間トライアル間隔（ITI）と触覚刺激（CS）とショ糖溶液（米国）の5ペアで構成されています。マウントされた触覚刺激（CS）を持つマイクロマニピュレータの前に単一蜂を置きます。触覚刺激の表面がハチの頭（ 図1およびB）に平行になるようにゆっくりと、CSを配置します。動物と触覚物体の間の距離は、試験ハチの触角の作業半径の範囲内である必要があり、ミツバチが快適な位置wに触覚刺激をスキャンすることができる必要があり、すなわちi番目のアンテナの両方。 図1に示す例では、距離は3mmであった。蜂が5秒間触覚刺激（CS）をスキャンしてみましょう。最初の3秒後に、30％ショ糖（米国）長い鼻の下にシリンジで溶液の液滴を提示します。優しく口吻を上げるために注射器の先端を使用しています。長い鼻の下スクロース刺激が15％無条件を引き出すだろう。蜂はスクロース報酬をなめるすることができます。空調時の正確な時間間隔を維持するためにアラーム信号とストップウォッチを使用しています。
- エアコンPERはミツバチの学習成功のための尺度として用いられる。第一報わペアリングした後に、ミツバチは、彼らが今度の報酬を期待することを示し、それらの口吻の伸長によってCSのプレゼンテーションへの対応を開始します。完全に伸びた口吻は、触覚刺激提示の3秒の時間窓の間、ショ糖プレゼンテーションが肯定的な反応として採点される前に、いつでも観察した。応答が負の計測されません。 OCCPERのurrenceは、実験者が留意しなければならない。 CSのプレゼンテーション中にPERを示すミツバチの割合は、各試験ごとにプロットされています。
3。キネマ録音
- シングル活かしハチの触角の動きは、適切なマクロレンズ（ 例えば TECHSPEC VZM 200装備バスラーA602f-2は、火災のワイヤ接続を経由して50 fpsで運営）を使用して、デジタルビデオカメラで記録されます。カメラはトップダウンビューでは、動物（ 図1）の上方に位置している。 図1では、録音の空間分解能は0.02mm /ピクセルです。
- カメラの目標の下、異なる向きから1mmの辺の長さと10×10mmの市松模様の画像をまとめて記録することにより、カメラのキャリブレーションを行います。キャリブレーションは、カメラキャリブレーションツールボックスMatlabの16で行うことができます。
- カメラレンズの下に単一の固定された蜂を置きます。マニピュレーターに固定され、触覚刺激を提示、動物に。触覚のコンディショニングのために説明したのと同じ方法で進行し、蜂がオブジェクトをスキャンしている間に触角の動きを記録。それは完全な触角作業範囲と触覚刺激が目に見えるものであることが重要です。刺激パターンの選択肢がテストされ、試験番号は、実験的なデザインによって異なります。
4。データ解析
- 画像背景の計算は、Matlabで行われます。まず、時間をかけて中央値グレースケール値は、画素毎に算出する必要があります。静的オブジェクトは、ハチと触覚刺激の固定ヘッドのように、画像の背景を構成することになる。移動するオブジェクトは、二つのアンテナのように、背景の一部にはなりません。
- 記録されたビデオの各フレームを順次ロードする必要があり、現在のフレームと画像の背景の違いは計算しなければならない。この減算の結果は、フレームからフレームへと移動している画像の部分を強調している。イドeally、ハチの触角は、ゼロ以外の値（ 図1C）の唯一の領域である。
- さらに処理するために、ゼロ以外のピクセル値を持つ2つの最大の領域はアンテナであると想定されます。両方のアンテナ用のバイナリマスクピクセルがアンテナと値以外の場合は0に属している場合、各画素ごとに値1を含む生成されるべきである。このマスクは後で触角ヒントをローカライズするための基礎としての役割を果たす。画像全体の予備のマスクを得るために、差分画像の各ピクセルのグレイ値は、事前に定義されたしきい値と比較されます。我々はノイズの世話をするので、後でこのしきい値は非常に低くなるように選択される。まず、画像ノイズ小領域に起因まだマスクの一部です：予備マスクがまだエラーの2種類を搭載しています。第二に、アンテナに属している領域は、必ずしも完全に接続されない場合があります。背景はほぼアンテナと同じ発光を持っている場合、後者は主に発生します。これらの影響を排除するために、標準画像処理モルフォロジー演算が適用され、標準のMATLAB関数はimerodeと（詳細な説明については、17頁158から205を参照）をそれぞれIMDILATE頼る、画像の侵食と拡張の組み合わせ、 すなわち 。ノイズ除去処理の後にアンテナの仮説は、まだ同じマスク内に含まれています。したがって、次のステップとしてバイナリーマスクは標準のMATLAB関数bwlabel（画像セグメンテーションアルゴリズムの詳細については17頁40から48を参照）を使用してばらばらの分野では、クラスタ化されています。
- クラスタあたりのピクセル数がカウントされ、2つの最大のクラスタが選択されています。重心は左右のアンテナ（ 図1D）を区別するために計算されます。
- 各アンテナの触角の先端が近位から遠位方向（ 図1D参照 ）の中で最も大きい数値を使用してクラスタ内のピクセルとして定義することができます。
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Representative Results
以下の実験では、触覚学習がミツバチで触角サンプリング動作にどのように影響するかを検討した。このため、我々は触覚刺激のプレゼンテーションの実行前と実行中ナイーブおよびエアコン蜂で触角の先端の動きを監視した。
まず、花粉飼料収穫機のグループの自発的な触角の動き（N = 42）は、1分間記録した。ミツバチの半分（N = 21）は、その後、30％スクロース報酬の5倍の触覚刺激を組み合わせることで調整した。これはエアコンのグループだった。触覚刺激が刻まれた水平格子（λ= 150μm）の真鍮のキューブの30×50mmの面だった。ミツバチの他の半分（N = 21）が調整され、ナイーブ群として使用し、 図2は、ミツバチの馴化群の平均学習曲線を示していませんでした。第一報酬後のPERはエアコンの割合は、自発的行動（ 図2との間に有意差がある番目の報酬後の彩度を示しています。
その後、エアコンとナイーブグループは触覚刺激の存在下で1分間再び記録した図3の 1の両方の触角先端の動き- B 2は、プレゼンテーションの実行前と実行中、両群の触角先端の位置の分布を示している触覚のオブジェクトとなります。 、ナイーブおよび馴化群はどちらも自発的な行動に比べて触覚刺激の存在下で彼らの触角の動きのパターンを変更しました。刺激が存在していた場合、検索する触角先端の可能性および/またはサンプル刺激の面積が大幅に増加し、その触覚のサンプリングを示すことは自発的な触角の動きと比較して、触角の動きのパターンに顕著な変化を伴います。これは、ミツバチ（ 図3 C 1とCの両方のグループに当てはまります
要約すると、この実験から得られた結果は、ミツバチが触覚刺激に応答するために非常に効果的に訓練することができることを示し、その触覚的学習が増加ACTIが付属していますVEの検索や振る舞いをサンプリング。
図1ビデオ録画と触角トラッキング手順A：固定蜂と触覚刺激のトップダウンビュー。触覚刺激は、閉塞した目で固定された蜂の頭部の前方に配置されています。それは触角実務範囲内に位置している。 dとpは動物に対して遠位と近位の位置を示すB：同じ蜂と触覚刺激のサイドビュー。触覚刺激とハチ（青い点線）のヘッドの表面は互いに平行であるC：ビデオシーケンス内の静的なピクセルの区別移動するピクセル。背景モデルから各画像を引き算すると、可動部分、 すなわちの同定を可能にするntennae。 。ハチと触覚刺激の固定ヘッド（赤点線としてここに示されている）は、静的および減算Dの後に表示されていない：左と右の定義と触角の先端。減算後の二大画素クラスタは、アンテナとして識別されます。重心の計算は、（赤）左と右（緑）アンテナを区別することができます。各アンテナ（黒い十字）の触角の先端は遠位方向に最大値を持つクラスタ内のピクセルとして定義することができます。
図2触覚PERコンディショニングの学習曲線。花粉飼料収穫機を5分間の試行間間隔でCS（触覚刺激）、米国（ショ糖溶液）の5ペアを使用して訓練を受けた。 21頭の陽性反応の割合は、自発的行動（SPONT）とduのためにプロットされ各コンディショニング試験後のCSのリングプレゼンテーション。最初と次のすべての報酬の後に観察PERの割合は、自発的行動（フィッシャー正確確率検定、p <0.001）との間に有意差がある。
図3 1分の期間中の触角先端位置の正規化された平均的なディストリビューション。各ハチの触角先端分布は動物あたりのデータポイントの合計数に正規化した。パネルはナイーブ（左、N = 21）とエアコンミツバチからの結果を示す（右、N = 21）の前（A）と刺激提示（B）の中に1と2：刺激提示前に自発的な触角の動き。横軸は目に相対触角先端の横方向の位置を示しています頭のeセンター（ 図1CおよびDと比較）。縦軸は触角先端の遠位の位置を示しています。カラースケールは、触角の先端は、任意の場所で過ごしている時間の割合を示します。図1,2のように同じですが、刺激提示中にC 1とC 2：1分間の記録期間は、B 1とB 2 3000ビデオフレームに相当した触角の先端が内側に配置されたフレーム数の平均オブジェクトの領域、 すなわち 、刺激面に遠位または近位相対±3ビン。 C1：ナイーブ群、C2：エアコングループ。箱ヒゲプロットは、中央値、平均値、四分位数、分あたりのフレーム数の5〜95％パーセンタイルの範囲を示しています。 P = 5.39×10 -4、C 2：Wilcoxonの符号付き順位検定は、C 1;ミツバチの両群において、 "いいえ刺激'（A）と"刺激と'（A、B、Cの間には有意な差がある-5）。触覚刺激提示時のフレーム数の平均はナイーブミツバチ（Mann-WhitneyのU検定、C 1 - C 2：p = 0.007）に比べてエアコンのミツバチで非常に大きくなります。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
ミツバチの調製：ミツバチの収集と固定は、動物の低応力レベルを維持するために、迅速に行われるべきである。ストレスがPER-反応性に影響を与え、したがって、蜂19、20の学習パフォーマンスに間接的な影響を及ぼす可能性があります。ストレスレベルはすぐにそれらを固定するために収集した直後に直接氷の上でハチとガラスバイアルを配置することによって減少させることができる。それは蜂が麻酔期間が前にある長い回復するために多くの時間を必要とすることを考慮しなければならない。
ビジョンは蜂18内触覚的学習にマイナスの影響を持っています。したがって、動物の目を塗ることによって視力を閉塞することが重要です。ビデオ録画の視覚的なコントラストを向上させるためには、白い塗料（ 例えば 、ティペックス）の使用を推奨します。ケアは、塗料と接触してアンテナを取得しないように注意するべきです。
学ぶる性能：実験室およびフィールドにおける旧研究はミツバチの飼料収穫におけるスクロース感受性が彼らの連想学習能力21、22に影響を及ぼすことを示した。高ショ糖感受性は正に良い触覚買収や差別のパフォーマンスと相関している。ミツバチのコロニーの花粉飼料収穫機は、平均して採餌シーズン23の最も週間蜜飼料収穫よりもショ糖への応答が。彼らは簡単に後ろ足に花粉負荷によって識別され、ハイブの入り口にキャッチすることができます。高ショ糖感受性を持つネクター飼料収穫は9月と10月の間、餌シーズンの終わりにキャッチすることができます。彼らは、23ハイブから車で約20メートルを置いた低濃度の砂糖水で満たされた人工のフィーダー上で選択することができます。
学習能力と記憶形成は、コンディショニング25時蜂の飽食状態に強く依存する。長い飢餓ペリODコンディショニングの前に、 例えば一晩、連合学習行動を改善し、動物のモチベーションのレベルを上げることができます。
触覚エアコン：PERは食欲の学習プロトコル14で無条件反応として使用されます。したがって、それはすべてのテストされたハチが完全にエアコンの前に無条件刺激（砂糖刺激）へのPER拡張を見せていることが重要です。砂糖の刺激に反応しない蜂は、コンディショニングの前に触覚刺激と触角の接触時のPERで応答ミツバチと同様に捨てられるべきです。それ以外の場合は、これらの動物の極端に低いまたは非常に高い応答性は、学習曲線を混同します。
このプロトコルに使用される触覚刺激（水平格子と真鍮のキューブ）を無作為に選ばれました。ミツバチはまた、様々な形状やテクスチャ（10を参照）とは異なる触覚刺激を条件とすることができます。
ミツバチの異なるグループ（ 例えば花粉対ネクター飼 料収穫機）で買収を比較するには、取得スコアが21を計算することができます。このスコアは、CSにエアコン応答の合計数であり、それは0（PER条件付け）と5（各コンディショニング試験後のPERを条件付け）の間の範囲を持っています。
ビデオ分析：異なるビデオ分析法はミツバチ26,27における触角の動き行動の変化を定量化するために、過去に使用されていました。我々の方法は、Matlabで画像処理のさまざまなツールからアンテナ及び利益に反射マーカーを必要とせずに、触角の動きを解析するという利点があります。一例として、またantennのタイミングを分析することができます対象物に向けらの接点は、触角の動きの速度を決定し、体軸を参考にアンテナの角度位置を計算したり、左右の触角の動きを区別します。
エアコンミツバチ内のオブジェクトへの触角応答の記録中に発生したPERはアンテナの自動検出と後で干渉することがあります。この場合、それは口先が同じ形状の灰色の層が表示されるセクションをカバーして、ムービー、VirtualDubの中で、 例えば 、検出プロセスを妨害するオブジェクトをマスクするために、 例えばを編集する必要があります。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
私たちはミツバチに触覚学習パラダイムをご紹介してヨアヒムErberに感謝します。この作品はドイツのエクセレンス·イニシアチブの枠組みの中で賄わエクセレンス277 CITECのクラスター、サポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pollen foragers, Apis mellifera L. | Private hives | ||
| Glass vials (22 x 45 mm) | Carl Roth GmbH Co | X655.1 | |
| Brass tubes, 10 x 30 mm | Self-produced | ||
| Brass cube, 3 x 5 mm | Self-produced | ||
| Tipp-Ex (solvent-free) | Tipp-Ex GmbH Co KG | ||
| Sucrose solution (30%) | Household suger diluted in water | ||
| Ethanol (70%) | Carl Roth GmbH Co | 9065.3 | |
| Syringe (1 ml) and needle (0.6 x 25) | Carl Roth GmbH Co | 59.1 | |
| Stop Watch | Carl Roth GmbH Co | L423.1 | |
| Micromanipulator | Märzhäuser MM33 | 00-42-101-0000 | |
| Digital video camera | Basler A602f-2 | ||
| Macro lens for camera | TechSpec VZM 200 | ||
| Matlab R2009b | The MathWorks |
References
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