Summary
I detta protokoll visar vi hur man tillstånd utnyttjas honungsbin till taktila stimuli och införa en 2D teknik motion capture för att analysera kinematik finskaliga antenn provtagning mönster.
Abstract
Honungsbin (Apis mellifera L.) är eusocial insekter och väl kända för sin komplicerade arbetsfördelning och associativ inlärning kapacitet 1, 2. De arbetstagare bin tillbringar den första halvan av sitt liv inom mörka kupan, där de ammar larverna eller bygga ordinarie sexkantiga kammar för livsmedel (t.ex. pollen eller nektar) och grubbla 3. Antennerna är extra multisensoriska känselspröt och spelar en central roll i olika taktila medierade uppgifter 4, inklusive bikupa byggnad 5 och mönsterigenkänning 6. Senare i livet, lämnar varje enskild bee bikupa till foder för mat. Sedan ett bi måste lära sig att skilja lönsamma mat källor, memorera deras plats och förmedla det till sitt bo kompisar 7. Bin använder olika blommor signaler som färger eller lukt 7, 8, men även taktila signaler från bladet ytan 9 för att bilda multisensoriska minnen av föda. Enligt laboratorium conditions kan bina tränas i appetitive lärande att diskriminera taktila föremål funktioner, till exempel kanter eller spår med sina antenner 10, 11, 12, 13. Detta lärande är nära besläktad med den klassiska lukt konditionering av snabel förlängning svar (PER) i selade bin 14. Fördelen med det taktila lärande i laboratoriet är möjligheten att kombinera beteende experiment på lärande med olika fysiologiska mätningar, bland annat en analys av antenn rörelsemönster.
Protocol
1. Förbereda Bees
- Nektar eller pollen fälthackar fångas i fältet antingen från en sackaros matare eller direkt från kupan ingången samtidigt som återvänder från en födosök resa. Varje enskild bi fångas i en glasflaska som är försluten med en skum plugg och tas omedelbart till laboratoriet för vidare hantering.
- I laboratoriet är de infångade bina kortfattat kyldes i kylskåp vid 4 ° C tills de visar första tecknen på orörlighet.
- Varje enstaka immobiliserade bi är monterad i en liten metallrör med tejp mellan huvudet och bröstkorgen och över buken. Försiktighet bör iakttas att snabel och antenner är fritt rörliga.
- Måla sammansatta ögon och Ocelli av den fasta biet med vit färg (t.ex. lösningsmedelsfri Tipp-Ex) att täppa vision.
- Lägg en liten droppe smält vax bakom huvudet på biet att åtgärda det till bandet mellan huvudet och bröstkorgen för att förhindra huvudrörelser under inspelning.
- Markera varje enskild bi med ett nummer på bandet för bättre identifiering och placera röret med den fasta biet i en fuktig atmosfär för att förhindra uttorkning.
- Feed varje enskild bi i 5 sekunder med droppar av en 30% sackaroslösning presenteras med en spruta och låt alla bin återhämta under 30 min innan den taktila konditionering protokollet.
2. Taktil Arbetsbord
- Före konditionering, har varje enskild bi som skall testas för det snabelliknande organet förlängning svar (PER) till en 30% sackaros stimulans appliceras på antennerna. Därigenom spets snabel måste korsa en virtuell linje mellan de öppnade mandibler. Släng alla bin som inte svarar med en per till sackaros stimulans.
- För taktil konditionering använda mässing kub (t.ex. 3 x 5 mm) med en slät eller en graverad mönster, t.ex. horisontella eller vertikala spår som bildar ett gitter med 150 nm våglängd, som betingade stimulus (CS). Feller den obetingat stimulus (US) använder en 30% sackaroslösning (hushåll socker, utspätt i vatten).
- Mässing kuben (CS) placeras i en hållare på en mikromanipulator (t.ex. Märzhäuser MM33) för att säkerställa exakt positionering under konditioneringen proceduren. USA presenteras för bi med en spruta fylld med en 30% sackaroslösning.
- Konditionering förfarande består av fem para ihop den taktila stimulus (CS) och sackaroslösning (US) med en inter-rättegång intervall (ITI) av 5 minuter. Lägg ett bi framför mikromanipulator med monterad taktila stimulus (CS). Placera CS långsamt, så att ytan av det taktila stimulus är parallell med huvud bi (figur 1 A och B). Avståndet mellan djuret och den taktila föremål bör vara i intervallet för antenn arbetsradie av den testade biet, dvs biet ska kunna skanna taktila stimulansen i en bekväm ställning wed båda antennerna. I det exempel som visas i figur 1, var avståndet 3 mm. Låt biet skanna taktila stimulus (CS) i 5 sek. Efter de första 3 sek, presentera en droppe av 30% sackaros (US) lösning med en spruta under snabel. Använd spetsen på sprutan för att försiktigt höja snabel. Sackaros stimulering under snabel framkallar det obetingade PER 15. Låt biet att slicka sackaros belöning. Använd ett stoppur med en larmsignal för att bibehålla exakta tidsintervall under konditioneringen.
- Den konditionerade PER används som ett mått för den lärande framgång ett bi. Efter de belönas 1:a ihopkopplingar bin börjar svara på CS presentation av förlängning av deras snabel, vilket indikerar att de förväntar det kommande belöning. En helt utsträckt snabel observerats när som helst under 3 sek tidsfönstret för taktil stimulans presentation och innan sackaros presentation görs som ett positivt svar. Inget svar räknas negativt. OCCurrence av PER bör noteras av försöksledaren. Den procentuella andelen bin visar PER under CS presentationen plottas för varje försök.
3. Kinematiska inspelningar
- Antenn rörelser en utnyttjas enda bi registreras med en digital videokamera med en lämplig makroobjektiv (t.ex. Basler A602f-2 utrustad med TechSpec VZM 200, som drivs vid 50 fps via en brand ledaranslutning). Kameran är placerad ovanför djuret i en vy uppifrån och ned (Figur 1 A). I figur 1, är den rumsliga upplösningen i inspelningarna 0,02 mm / pixel.
- Kalibrera kameran genom att registrera enstaka bilder på en 10 x 10 mm checkerboard med en kant längd på 1 mm från olika inriktningar under kameran målet. Kalibreringen kan göras med kameran kalibrering verktygslåda Matlab 16.
- Placera en enda fast bi under kameralinsen. Presentera den taktila stimulansen fäst vid en mikromanipulator, Till djuret. Gör på samma sätt som beskrivits för taktil konditionering och spela in antenn rörelsen medan biet skannar objektet. Det är viktigt att hela antenn arbetsområde och den taktila stimulus är synliga. Val av stimulans mönster testats och rättegång nummer beror på experimentell design.
4. Dataanalys
- Beräkningen av bildens bakgrund görs i Matlab. Först har medianvärdet gråskala värdet över tiden beräknas för varje pixel. Statiska objekt, liksom den fasta huvud biet och den taktila stimulansen kommer att utgöra bildens bakgrund. Rörliga föremål, som de två antennerna, inte kommer att vara en del av bakgrunden.
- Varje ram av den inspelade videon måste lastas sekventiellt, och skillnaden mellan den aktuella bildrutan och bilden bakgrunden måste beräknas. Resultatet av denna subtraktion betonar de delar av bilden som rör sig från ram till ram. Ideally, antennerna för biet är de enda områdena av icke-nollvärden (Figur 1C).
- För vidare bearbetning, är de två största områdena med icke-noll pixelvärden antas vara antenner. För båda antennerna en binär mask skall genereras innehållande för varje pixel ett värde 1, om pixeln tillhör antennen och värdet 0 annars. Denna mask tjänar som en grund för att lokalisera antenn tipsen senare. För att få en preliminär mask för hela bilden grå-värdet för varje pixel i bilden skillnaden jämförs med ett fördefinierat tröskelvärde. Eftersom vi tar hand om buller senare denna tröskel väljs att vara ganska låg. Den preliminära masken då fortfarande bär två typer av fel: För det första, på grund av små bildbrus regioner är fortfarande en del av masken. Andra kan områden som hör till antennen inte nödvändigtvis vara helt ansluten. Det senare sker oftast om bakgrunden har ungefär samma luminiscensen som antennen. För att eliminera dessa artefakter, standardbildbehandling morfologiska drift tillämpas, det vill säga en kombination av bild erosion och dilatation, förlita sig på de vanliga Matlab funktioner imerode och imdilate respektive (se 17 s. 158-205 för ytterligare förklaring). Efter denoising process antenner hypoteser fortfarande finns inom samma mask. Därför, som ett nästa steg den binära masken klustrade för disjunkta områden med standard Matlab-funktionen bwlabel (se 17 s. 40-48 för mer information om bilden segmentering algoritm).
- Antalet pixlar per kluster räknas och de två största klustren väljs. Tyngdpunkten beräknas att skilja mellan vänster och höger antenn (figur 1D).
- Den antenn spets för varje antenn kan definieras som pixeln i ett kluster med det högsta värdet i den proximala-till-distala riktningen (se figur 1D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I följande experiment studerade vi hur taktil inlärning påverkar antenn provtagning beteende i honungsbin. För detta, övervakade vi rörelsen hos antenn spetsen i naiva och konditionerat bin före och under uppvisande av en taktil stimulus.
Först den spontana antenn rörelsen av en grupp av pollen fälthackar (N = 42) registrerades under 1 minut. Hälften av de bin (N = 21) fick sedan konditionerades genom att para ihop fem gånger en taktil stimulus med en 30% sackaros belöning. Detta var den betingade gruppen. Den taktila stimulansen var 30 x 50 mm yta av en mässing kub med en graverad horisontell galler (λ = 150 nm). Den andra hälften av bin (N = 21) var inte konditionerades och användes som en naiv grupp. Figur 2 visar medelvärdet inlärningskurva av det konditionerade gruppen bin. Den procentuella andelen konditionerade PER efter den första belöningen är signifikant skild från spontana beteendet (figur 2 e belöning.
Efteråt rörelse antenn spetsen i både konditionerade och naiva gruppen registrerades igen under 1 min i närvaro av det taktila stimulus Figur 3 A 1 -. B 2 visar fördelningen av antenn tips platser i båda grupperna, före och under presentationen av det taktila objektet. Både den naiva och den konditionerade gruppen bytte antenn rörelsemönster i närvaro av en taktil stimulus jämfört med spontana beteendet. Sannolikheten för att antenn tips till sök-och / eller prov området för stimulus avsevärt ökas om stimulans var närvarande, visar att taktila provtagning innebär en markant förändring i antenn rörelsemönstret jämfört med spontan antenn rörelse. Detta gäller för båda grupperna av bin (Figur 3 C 1 och C
Sammanfattningsvis att resultaten från detta experiment visar honungsbin kan tränas mycket effektivt för att svara på en taktil stimulans och att taktila lärandet åtföljs av ökad aktive söka och provtagning beteende.
. Figur 1 Videoinspelning och antenn följoperationen A:. Uppifrån av en fast bi och taktila stimulansen. Den taktila stimulansen är placerad framför huvudet av fasta biet med ockluderade ögon. Det ligger i den antenn arbetsför sortiment. d och p indikerar distala och proximala lägen i förhållande till djuret B:. Sidovy av samma bi och taktila stimuli. Ytan på den taktila stimulansen och chefen för biet (blå streckade linjer) är parallella med varandra C:. Skilja rörliga pixlar från statiska pixlar i en videosekvens. Subtrahera varje bild från en bakgrund modellen tillåter identifiering av rörliga delar, det vill säga, antennae. Den fasta huvud biet och den taktila stimulansen (anges här som röda streckade linjer) är statiska och inte synliga efter subtraktionen D:. Definiera vänster och höger och antenn spetsen. De två största pixel kluster efter subtraktion identifieras som antenner. Beräkning av tyngdpunkt gör skillnad mellan vänster (röd) och höger (grön) antenn. Den antenn spets för varje antenn (svart kors) kan definieras som pixeln i ett kluster med det största värdet i den distala riktningen.
Figur 2. Inlärningskurvan av taktila PER konditionering. Pollen fälthackar tränades med fem ligaspel i CS (taktila stimuli) och USA (sackaroslösning) med en inter-rättegång intervall av 5 minuter. Andelen positiva svar 21 djur plottas för spontana beteende (Spont) och during presentation av CS efter varje konditionering försök. Den procentuella av PER observerades efter den första och alla följande belöningar skiljer sig signifikant från den spontana beteende (Fisher exakta sannolikhetstest, p <0,001).
Figur 3. Normaliserade genomsnittliga fördelningar av antenn spetsläget under en period av 1 minut. Den antenn spets Fördelningen av varje bi normaliserades till det totala antalet datapunkter per djur. Panelerna visar resultat från naiva (vänster, N = 21) och luftkonditionerade bin (höger, N = 21) före (A) och under stimulans presentation (B) A 1 och A 2:. Spontan antenn rörelse innan stimulans presentation. Abskissan visar den laterala positionen för antenn spetsen relativt the centrum av huvudet (jämför med figur 1C och D). Ordinatan visar den distala positionen för antenn spets. Färgskalan anger den procentandel av tiden som den antenn spetsen spenderas vid varje given plats. Inspelningen perioden 1 minut motsvarade 3.000 videobildrutor B 1 och B 2:. Samma som i A 1,2, men under stimulans presentationen C 1 och C 2:. Genomsnittligt antal ramar i vilka antenn spetsen var belägen innanför objektet området, dvs ± 3 lådor distalt eller proximalt i förhållande till den stimulans yta. C1: naiv grupp, C2: betingade grupp. The Box-morrhår tomter visar medianen, menar kvartiler och 5-95% intervall percentilen av antal bilder per minut. I båda grupperna av bin, det finns en betydande skillnad mellan "ingen stimulans" (A) och 'med stimulans "(B, C, Wilcoxon signed-rank test, C 1: P = 5,39 * 10 -4, C 2 -5). Det genomsnittliga antalet bildrutor under taktil stimulans presentation är betydligt större i betingade bin än naiva bin (Mann-Whitney U test, C 1 - C 2: P = 0,007). Klicka här för att se större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beredning av bin: Insamling och fastställande av bin bör göras snabbt, för att hålla stressnivån hos djuret låg. Stress påverkar per-lyhördhet och därför kan ha en indirekt effekt på lärandet prestanda i bin 19, 20. Stressnivån kan minskas genom att placera glasflaska med bina direkt på is omedelbart efter samlingen att immobilisera dem snabbt. Det måste beaktas att bin behöver mer tid för att återhämta ju längre anestesi tiden är före.
Vision har en negativ effekt på taktila lärande bin 18. Därför är det viktigt att täppa syn genom målning ögon djuret. För att öka den visuella kontrasten av videoinspelningar, är det rekommenderat att använda vit färg (t.ex. Tipp-Ex). Försiktighet bör iakttas att inte få antennerna i kontakt med färgen.
Lärning prestanda: Tidigare studier i laboratorium och fält visade att sackaros känslighet i fälthackar honungsbiet påverkar deras associativa inlärningsförmåga 21, 22. Hög sackaros känslighet är positivt korrelerad med bättre taktil förvärv och föreställningar diskriminering. Pollen fälthackar en honungsbiet koloni är i genomsnitt mer lyhörda för sackaros än nektar fälthackar i de flesta veckor en födosök säsong 23. De kan lätt identifieras genom de pollen belastning på bakbenen och fångas vid bikupa entrén. Nectar fälthackar med hög sackaros känslighet kan fångas i slutet av en födosök säsong mellan september och oktober. De kan väljas på artificiella matare fyllda med låg koncentrerat socker vatten placeras ca 20 m från kupan 23.
Den lärande prestanda och minne bildning är starkt beroende mättnad status ett bi under konditioneringen 25. En längre svält period före konditionering, t.ex. över natten, kan förbättra associativa inlärning beteende och öka motivationen nivån av ett djur.
Taktil konditionering: PER används som obetingade responsen i en appetitive lära protokoll 14. Därför är det viktigt att alla testade bin visar en fullt utsträckt PER till obetingat stimulus (socker stimulus) före konditionering. Bin som inte svarar på socker stimulansen bör kasseras liksom bin som svarar med en per under antenn kontakt med taktila stimulansen innan konditionering. Annars kommer den extremt låga eller extremt höga känslighet hos dessa djur förbrylla inlärningskurvan.
Den taktila stimulansen som används i detta protokoll (mässing kub med horisontella galler) var slumpmässigt utvalda. Honungsbin kan också villkorat av olika taktila stimuli med olika former och texturer (se 10).
Att jämföra förvärv i olika grupper av bin (t.ex. pollen-kontra Nectar fälthackar) kan ett förvärv poäng räknas 21. Denna värdering är det totala antalet betingade svar på CS och har ett intervall mellan 0 (ingen betingad PER) och 5 (betingad PER efter varje konditionering försök).
Videoanalys: Olika video analyserar metoder användes tidigare för att kvantifiera förändringar i antenn rörelsen beteende honungsbin 26, 27. Vår metod har fördelen att analysera antenn rörelser utan att kräva reflekterande markörer på antenner och förmåner från olika verktyg bildbehandling i Matlab. Som ett exempel, kan man analysera också tidpunkten för Antennal kontakter mot ett objekt, bestämmer hastigheten antenn rörelse beräkna vinkellägen antennerna i förhållande till kroppen axlar eller diskriminera mellan vänster och höger antenn rörelse.
Per som uppstår under inspelning av antenn svar på objektet i betingade bin kan störa senare med automatisk detektering av antennerna. I detta fall är det nödvändigt att redigera filmen, t ex i VirtualDub, och att maskera det föremål som stör detekteringsprocessen, exempelvis genom att täcka den sektion där snabel visas med en grå skikt av samma form.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Joachim Erber för att införa oss till den taktila lärande i honungsbin. Detta arbete stöddes av Cluster of Excellence 277 CITEC, finansieras inom ramen för det tyska Excellence Initiative.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pollen foragers, Apis mellifera L. | Private hives | ||
| Glass vials (22 x 45 mm) | Carl Roth GmbH Co | X655.1 | |
| Brass tubes, 10 x 30 mm | Self-produced | ||
| Brass cube, 3 x 5 mm | Self-produced | ||
| Tipp-Ex (solvent-free) | Tipp-Ex GmbH Co KG | ||
| Sucrose solution (30%) | Household suger diluted in water | ||
| Ethanol (70%) | Carl Roth GmbH Co | 9065.3 | |
| Syringe (1 ml) and needle (0.6 x 25) | Carl Roth GmbH Co | 59.1 | |
| Stop Watch | Carl Roth GmbH Co | L423.1 | |
| Micromanipulator | Märzhäuser MM33 | 00-42-101-0000 | |
| Digital video camera | Basler A602f-2 | ||
| Macro lens for camera | TechSpec VZM 200 | ||
| Matlab R2009b | The MathWorks |
References
- Page, R. E., Scheiner, R., Erber, J., Amdam, G. V. The development and evolution of division of labor and foraging specialization in a social insect (Apis mellifera L.). Curr. Top. Dev. Biol. 74, 253-286 (2006).
- Menzel, R., Müller, U. Learning and memory in honeybees: From behavior to neural substrates. Annu. Rev. Neurosci. 19, 379-404 (1996).
- Seeley, T. D. The wisdom of the hive. , Harvard University Press. Cambridge Mass, London. (1995).
- Staudacher, E., Gebhardt, M. J., Dürr, V. Antennal movements and mechanoreception: neurobiology of active tactile sensors. Adv. Insect Physiol. 32, 49-205 (2005).
- Martin, H., Lindauer, M. Sinnesphysiologische Leistungen beim Wabenbau der Honigbiene. Z. Vergl. Physiol. 53, 372-404 (1966).
- Kevan, P. G. Texture sensitivity in the life of honeybees. Neurobiology and behavior of honeybees. Menzel, R., Mercer, A. , Springer Verlag. Berlin, Heidelberg, New York. 96-101 (1987).
- von Frisch, K. Tanzsprache und Orientierung der Bienen. , Springer Verlag. Berlin, Heidelberg, New York. (1965).
- Waser, N. M. Flower constancy: definition, cause, and ceasurement. Am. Nat. 127, 593-603 (1986).
- Kevan, P. G., Lane, M. A. Flower petal microtexture is a tactile cue for bees. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 4750-4752 (1985).
- Erber, J., Kierzek, S., Sander, E., Grandy, K. Tactile learning in the honeybee. J. Comp. Physiol. A. 183, 737-744 (1998).
- Kisch, J., Erber, J. Operant conditioning of antennal movements in the honey bee. Behav. Brain. Res. 99, 93-102 (1999).
- Scheiner, R., Erber, J., Page, R. E. Tactile learning and the individual evaluation of the reward in honey bees (Apis mellifera L.). J. Comp. Physiol. A. 185, 1-10 (1999).
- Erber, J., Scheiner, R. Honeybee learning. Encyclopedia of Neuroscience. Adelman, G., Smith, B. , Elsevier. (2004).
- Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schäfer, S. Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera). J. Comp. Psychol. 97, 107-119 (1983).
- Dacher, M., Gauthier, M. Involvement of NO-synthase and nicotinic receptors in learning in the honey bee. Physiol. Behav. 95, 200-207 (2008).
- Camera Calibration Toolbox for Matlab [Internet]. , Available from: http://www.vision.caltech.edu/bouguetj/calib_doc (2004).
- Haralick, R. M., Shapiro, L. G. Computer and Robot Vision. I, Addison-Wesley. Reading, Mass. (1992).
- Erber, J. Tactile antennal learning in the honey bee. Honeybee Neurobiology and Behavior. Galizia, C. G., et al. , Springer Verlag. 439-455 (2012).
- Pankiw, T., Page, R. E. Effect of pheromones, hormones, and handling on sucrose response thresholds of honey bees (Apis mellifera L.). J. Comp. Physiol. A. 189, 675-684 (2003).
- Harris, J. W., Woodring, J. Effects of stress, age, season and source colony on levels of octopamine, dopamine and serotonine in the honey bee (Apis mellifera L.) brain. J. Insect. Physiol. 38, 29-35 (1992).
- Scheiner, R., Kuritz-Kaiser, A., Menzel, R., Erber, J. Sensory responsiveness and the effects of equal subjective rewards on tactile learning and memory of honeybees. Learn. Mem. 12, 626-635 (2005).
- Mujagic, S., Sarkander, J., Erber, B., Erber, J. Sucrose acceptance and different forms of associative learning of the honey bee (Apis mellifera L.) in the field and laboratory. Front. Behav. Neurosci. 4, 46 (2010).
- Scheiner, R., Barnert, M., Erber, J. Variation in water and sucrose responsiveness during the foraging season affects proboscis extension learning in honey bees. Apidologie. 34, 67-72 (2003).
- Mujagic, S., Erber, J. Sucrose acceptance, discrimination and proboscis responses of honey bees (Apis mellifera L.) in the field and the laboratory. J. Comp. Physiol. A. 195, 325-339 (2009).
- Friedrich, A., Thomas, U., Müller, U. Learning at different satiation levels reveals parallel functions for the cAMP-protein kinase A cascade in formation of long-term memory. J. Neurosci. 24, 4460-4468 (2004).
- Erber, J., Pribbenow, B., Grandy, K., Kierzek, S. Tactile motor learning in the antennal system of the honeybee (Apis mellifera L.). J. Comp. Physiol. A. 181, 355-365 (1997).
- Lambin, M., Déglise, P., Gauthier, M. Antennal movements as indicators of odor detection by worker honeybees. Apidologie. 36, 119-126 (2005).
