Summary
起源の臓器への癌細胞の移植は、新規治療法を評価するための有用な前臨床モデルとして役立つことができる。 MB49膀胱癌細胞は、膀胱内注入後の膀胱内に成長させることができる。このプロトコルは、腫瘍移植およびアデノウイルス引渡しのために、マウスの膀胱のカテーテル法を示しています。
Abstract
膀胱癌は尿生殖路、再発および進行が必要な削減することができ、新たな治療アプローチの第二の最も一般的な癌である。腫瘍微小環境が著しく腫瘍の発生および治療応答に影響を与えることができる。それは、それらが由来する器官に腫瘍細胞を増殖させることが望ましい場合が多い。このプロトコルは、MB49マウス膀胱癌細胞はカテーテル法を介して膀胱に点滴注入された膀胱癌の同所性モデルを記載している。このモデルで成功した腫瘍細胞移植は、物理的または化学的手段によって達成することができるグリコサミノグリカン、保護層の破壊を必要とする。我々のプロトコルでは、膀胱前細胞点滴をトリプシンで処理する。膀胱カテーテル法はまた、腫瘍が確立されれば治療薬を送達するために使用することができる。このプロトコルは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するアデノウイルス構築の送達を記載する。 O間ウルプロトコルは短期試験用に最適化遺伝子送達に焦点を当ててきた、マウスの膀胱カテーテル法の方法論は、幅広い用途を有する。
Introduction
膀胱癌は2012年1で予想はほぼ75,000の新しい症例と15000人が死亡した尿生殖路の第二の最も一般的な癌である。再発率の高さは、膀胱癌治療する最も高価な癌の1になり、生涯のフォローアップを必要とする。筋層に侵入している膀胱がんは、リンパ系を経由して肝臓、肺や骨に転移することがあります。 5年後にのみ20から40まで%生存における進行した腫瘍の結果マルチモーダル療法。そのため、表在性膀胱癌の再発や進行を減らすだけでなく、高度な疾患を持つ患者の治療結果の向上を目的とした効果的な治療戦略が緊急に必要とされている。
新規治療薬の開発は初期のインビトロ評価以下の効果を評価する前臨床モデルを必要とします。腫瘍微小環境が大幅にpreclinicの必要性を強調しており、癌の発生と応答性に影響を与えることができる腫瘍が生じたからモデルは、起源の器官において確立することができる。一つのアプローチは、腫瘍が自然発生または器官特異的に誘導することが可能なトランスジェニックモデルの開発である。トランスジェニック膀胱癌モデルの優れたプロトコルは、最近2公表されている。トランスジェニックモデルの欠点は、腫瘍はゆっくりと所望未満の均一性で開発する傾向があることである。また、繁殖コロニーを維持するためのコストを考慮しなければならない。トランスジェニックモデルに代わるものは、市販のマウスにおける腫瘍の確立のための短い時間枠の利益を有する腫瘍細胞の同所移植である。いくつかのヒト膀胱癌細胞株は（我々はUM-UC-3を首尾よく使用している）同所成長させることができるが、免疫応答性マウスにおいて腫瘍を確立することが望ましい場合がある。同所性増殖二つマウス膀胱癌細胞株は、MBT-2およびMB49 3である。 MBT-2細胞を複製に汚染されているのでC型レトロウイルス4、我々は我々の研究のためMB49細胞を選択しました。それは、MB49細胞は雄のマウスから単離され、同所着床は雌マウスで行った解剖学的な理由であるしていることに注意することが重要である。これは、Y染色体のマーカーによって移植された細胞を容易に識別するという利点がありますが、性別の不一致が免疫学的研究のための欠点です。
膀胱上皮は、微生物による感染症のためのバリアとして機能グリコサミノグリカン（GAG）層によって裏打ちされている。この障壁はまた、この困難性（ 表1）を克服するために開発された腫瘍細胞およびいくつかの方法の着床を妨害する可能性がある。電気焼灼は、GAG層5月13日を破壊する物理的手段として広く使用されており、電気メスを実証プロトコルは最近、Joveの14に掲載されました。しかし、電気焼灼器が利用できない場合は、化学物質は、Gを破壊することを意味する例えば、硝酸銀またはポリ-L-リジンなどAG層も15-24を使用することができる。腫瘍は、ポリ-L-リジンとの長い接触又は0.1 mg / mlと（100μl の （〜10秒、5〜10μlを、0.15〜1.0 M）の硝酸銀を少量の膀胱への短時間曝露することにより効果的に確立される20分間）（ 表1）。ここでは、MB49細胞の移植を容易にするために、トリプシンを使用する方法を記載している。
膀胱癌のための治療アプローチを改善する試みにおいて、遺伝子治療に大きな注目を集めている。臨床的な観点からは、膀胱癌は簡単に臓器のアクセシビリティと、ローカルにペイロードを提供する能力のために、遺伝子治療のための理想的なターゲットである。膀胱癌の遺伝子治療のために検討されているウイルスベクターは、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス25、レトロウイルス26、カナリア痘ウイルス27、ワクシニアウイルス、AAV、およびadenoviruを含む28秒 。我々のプロトコルの第二部では、腫瘍細胞の点滴注入と実質的に同一であるウイルス送達するための方法を記載している。私たちの研究室で興味深いのは、我々はルシフェラーゼ導入遺伝子を発現するアデノウイルスベクターを用いた生物発光を経由して評価した遺伝子デリバリーへの新しいアプローチの開発である。しかし、膀胱カテーテル法の方法論は様々な薬剤の送達のために使用され、従って広い適用性を有することができる。
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Protocol
動物に関わるすべての手順は、検討されている、サウスカロライナ医科大学の施設内動物管理使用委員会によって承認された。プロトコルは、痛みのための米国農務省のカテゴリーDの下で承認されました。
1。細胞移植
- 二日手順を実行する前に、T-25フラスコに1×10 6個の細胞をプレートMB49。 （所望の場合、および抗生物質）を10％FBSを補充した高グルコースDMEMを使用する。 Oneフラスコを麻酔し、平行に移植されるまでの5匹のマウスの各群のために十分である。
- 処置の日に、滅菌DMEM基礎培地（1:2希釈）で0.125％滅菌0.25％組織培養グレードのトリプシンを希釈することにより点滴トリプシンを調製する。 1.2mlを10匹のマウスには十分である。平衡に37℃の水浴中に置きます。
- 加熱パッドを予熱し及びiを送達するために使用される麻酔システムのノーズコーンの下に配置するsoflurane。加熱パッドの上にきれいに吸収パッドを配置します。
- 麻酔システムの誘導チャンバ内にマウスを置き、3％のイソフルランで麻酔を誘導する。マウスはつま先ピンチ反射の消失によって検証され、意識を失っているときに、ノーズコーンに転送。各動物は仰臥位であり、適切に体温を維持するために加温パッド上に配置されていることを確認してください。
- 麻酔を維持するために、2％イソフルラン濃度を低下させる。
- 乾燥を防ぐために両眼に眼軟膏を適用します。
- オプションのステップ：腹部の毛を削除します。 in vivoでの生物発光イメージングが実行される場合には、下腹部の毛を除去しなければならない。
- 外性器に接触しないように注意しながら、腹部に毛皮の二乗で最低1に、このようなVeetのように、除毛クリームの寛大な層を適用します。 3分待ちます。
- 乾いたスポンジでエリアを擦って髪を削除してから、肌を清潔にするために湿らせたスポンジを使用。必要であれば、一回繰り返します。
- 膀胱カテーテルを挿入
- このようなKYなどの非刺激性の潤滑ジェルを使用して新しい滅菌24 G小児静脈カテーテルを潤滑。針を取り外し、廃棄します。カテーテルの周りの流体の漏れは共通の問題、 すなわちである場合。それはより頻繁に10匹のマウスのいずれにおいてより発生し、大きなボアカテーテル（20 G）を使用することができる。これは8週間以上経過したマウスでは重要な考慮事項があります。
- カテーテルのハブを保持している、マウスの後ろ足を広げて、尿道口を露出するために、あなたの反対の手の親指と人差し指を使用しています。そっとそれを完全に挿入するために、ベンチで1並列に角度を変え、45°の角度で尿道にカテーテルを挿入します。
- 完全に挿入した後、ベンチに平行に、かつ視覚的にそれは尿道ではなく、それを下回っている膣内に配置されていることを確認し、それを維持し、ゆっくりとカテーテルを持ち上げます。正しく配置されている場合、カテーテルは、であることができるようになる膣は尿道よりも短くなっているので、完全にアサート。
- 1％イソフルラン濃度を低下させる。
- P200ピペッターにチップを取り付け、カテーテルの外端に吸引を適用することにより、膀胱から尿を取り除く。カテーテルのハブから残りの尿を除去します。尿を破棄し、所定の位置にカテーテルを残す。
- 慎重に気泡を避け、カテーテルのハブに80μlの0.125％トリプシン溶液をピペット。カテーテルハブに1ミリリットルの空気で満たされた注射器を接続し、徐々に膀胱内にトリプシンを配信するために、プランジャー0.1〜0.2ミリリットルを押し下げる。
- 15分間の場所に注射器やカテーテルアセンブリのままにしておきます。繰り返して、残りの麻酔したマウスのいずれか（最大4）のための1.8から1.11を繰り返します。待機期間中、次のステップに進みます。ヒント：最初はそれは他の誰かが細胞（ステップ1.12）を調製しておくと便利かもしれません。
- 移植のためMB49細胞を準備します。細胞は、T-2あたり1×10 6でプレーティングした5フラスコ48の移植には、HR（ステップ1.1）。
- メディアを取り出し、フラスコに0.25％トリプシンを500μlを加える。細胞が剥離すると、細胞を再懸濁し、完全DMEMを5ミリリットルを追加。カウントし、5分間1,000 rpmで残りを遠心分離する50μlアリコートを削除します。遠心分離工程の間にステップ1.12.2と1.12.3に進みます。
- 血球計数器を用いて細胞を数える。細胞/ mlを計算します。その後、4×10 6細胞/ ml（50μlの当たり2×10 5細胞）に、細胞ペレットをもたらすために必要な体積を計算する。
- 遠心分離した細胞からの上清を捨て、（1.12.2ステップで計算された）4×10 6細胞/ mlに細胞を懸濁するために必要なボリュームを使用してDMEMベースの培地中でペレットを再懸濁。室温で細胞を維持する。
- ブラダーのトリプシン処理し、15分の時点に到達すると、所定の位置にカテーテルを残してカテーテルから空気が充填された注射器を取り外す。使用済みのトリプシンますノーマルLYは、カテーテルを通って逆流する。上記のステップ1.9のように、P200ピペッターで吸引によって膀胱から残っているトリプシンを取り外して廃棄します。
- すぐにカテーテルのハブにMB49細胞懸濁液50μlをピペットで。カテーテルのハブに1ミリリットルの空気が充填された注射器を取り付け、ゆっくりとプランジャ0.1〜0.2ミリリットルを押すことにより、膀胱に細胞を送達。すべての5匹のマウスを注入するさらに4回には、このステップアップを繰り返します。未使用のセルを廃棄。
- 所定の位置にカテーテル注射器組立体を残して、細胞を50分間膀胱内に住むことができます。
- そっと尿道からカテーテル注射器アセンブリを撤回。ゼロにイソフルラン濃度の電源を入れ、加熱パッド上で回復さインチまたは2離れてノーズコーンから各マウスを移動します。
- マウスは、その立ち直り反射を取り戻したとき、そのケージに戻します。
2。 （8日間細胞移植後の）アデノウイルスの膀胱内デリバリー注意：プロトコルのこの部分は、感染性因子であるアデノウイルスを使用し、厳格なBSL2ガイドライン（http://oma.od.nih.gov/manualchapters/intramural/3035/）の下で処理される必要があります。
感染性病原体で実行されるすべての手続きは、サウスカロライナ医科大学の機関のバイオセーフティ委員会によって承認された。
- 八日MB49細胞をマウスに注入した後、血尿を確認してください。吸収性白い紙の上に個々の動物をピックアップし、ゆっくりと紙の上に尿の滴を去るために腹部に押します。赤にピンク尿が血尿を示し、腫瘍が確立している兆候である。腫瘍テイク率が少なくとも80％であり、優れた技術と100％の高さであり得る。
- 氷上でのアデノウイルスストックを解凍し、滅菌、室温のPBSに10 9 PFU/50μL（2×10 10 PFU / ml）をに希釈する。
- 上記の手順で1.3から1.6で説明したように、マウスを麻酔。
- ステップ1.8で説明したように、マウスをカテーテルを挿入し、ステップ1.9のように、尿を取り除く
- 尿を除去した後、すぐにカテーテルのハブにウイルス懸濁液50μlをピペットで。カテーテルのハブに1ミリリットルの空気が充填された注射器を取り付け、ゆっくりとプランジャ0.1〜0.2ミリリットルを押すことにより、膀胱にウイルスを配信します。
- 所定の位置にカテーテル注射器組立体を残して、ウイルスが40分間膀胱内に住むことができます。
- 穏やかに尿道カテーテルから注射器組立体を撤回し、残りのウイルスを不活性化するために10％漂白剤溶液中に捨てる。
- ゼロにイソフルラン濃度の電源を入れ、加熱パッド上で回復さインチまたは2離れてノーズコーンから各マウスを移動します。
- マウスは、その立ち直り反射を取り戻したとき、そのケージに戻します。
- マークは、ケージのマウスはアデノウイルスに点眼されたことを示す。ウイルスは数日間ケージの寝具に放出され、すべてのケージや寝具でなければなりません処理され、適切に消毒さ。
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Representative Results
血尿200,000 MB49細胞の移植後8日以内にほぼ全てのマウスにおいて観察される。 図1に示すように、34.7±3.3ミリグラムから倍以上、膀胱重量以上の（31-37 mgの範囲、n = 4）の非腫瘍87.5±19.2 mgの担持マウス（77から120 mgの範囲であり、n = 10）マウスのそれMB49細胞を移植されてきた。遺伝子送達の面では、マウスに24時間を撮像するウイルスの点滴注入は、48時間（ 図2）後よりも強いシグナルを生じることを見出した後。アデノウイルスの送達は、統計目的（ 図2および3）のためにグループサイズを計画する際に考慮されるべき動物の間で高度に可変である。小動物イメージングシステムが利用できない場合、ルシフェラーゼ導入遺伝子の発現を測定するための別のアプローチは、 インビトロ分析のために膀胱を除去し、均質化することである。 IVIS200小動物の体系を用いたin vivo解析との比較ステディ-グロキットを用いて、mおよびインビトロ分析では 、データセット間の優れた相関関係（ 図3）を示す。
9日20万MB49細胞の点滴注入後の図1腫瘍負荷の分析非腫瘍の重量（n = 4）は、腫瘍保有た（n = 10）マウスのブラダー。統計的有意性は、グラフパッドソフトウェアを用いて、スチューデントt検定によって決定した。 * P = 0.0002。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図2遺伝子発現のインビボ分析。 9 PFU AdCMV.Luc（+）。ルシフェラーゼを可視化するために、マウスを200μgのルシフェリン/マウスを腹腔内注射した。ルシフェラーゼ遺伝子の発現は、IVIS200小動物イメージングシステムを用いて生体内で測定した。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図3。24時間のウイルス保存緩衝液（白丸）または1×10 9 PFU AdCMV.Luc（黒丸）の送達後にインビボ小動物イメージングおよびインビトロアッセイによって得られた生物発光シグナルの比較は 、マウスがあったIVIS200を使用して画像化して、犠牲にするED。ブラダーは、定常グロキットを用いて生物発光シグナルのインビトロ分析のために取り出し、ホモジナイズした。各方法で得られたルシフェラーゼシグナルは任意単位（AU）で表される。決定係数（R2）は、データ分析アドインを使用してMicrosoft Excelで計算した。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
| GAG層への侮辱 | 移植された細胞 | 保持時間 | 腫瘍の検出および開発 | リファレンス |
| 電気焼灼器 | 0.01から1×10 5 MB49 | 血尿：1,000細胞：0/0;万セル：4月6日、100,000細胞：6月6日腫瘍：1,000細胞：0/6;万以上のセル：6月6日、6月6日（100％） | 5 | |
| ElectrocautERY | 5×10 4 MB49リュック | 腫瘍発生率：90％（参考11のように） | 6 | |
| 電気焼灼器 | 1×10 5 MB49 | 〜3時間 | 腫瘍発生率：90％50日目 | 7 |
| 電気焼灼器 | 1×10 5 MB49-PSA | PSA：移植後、早ければ4日のように検出されました | 8 | |
| 電気焼灼器 | 1×10 5 MB49 | 腫瘍発生率：90％ | 9 | |
| 電気焼灼器 | 5×10 4 MB49 | 2時間 | 腫瘍発生率：83.3％（10月12日）21日目 | 10 |
| 電気焼灼器 | 2×10 4 MB49 | 2時間 | 腫瘍発生率：1日28で100％ | 11 |
| 電気焼灼器 | 1-5×10 4 MB49 | 3時間 | 血尿：1日16分100％、腫瘍発生率：100％ | 12 |
| 電気焼灼器 | 1×10 5 MB49 | 3時間 | 腫瘍発生率：97.3％（75分の73） | 13 |
| PLL（100μlの0.01％20分） | 1×10 5 MB49-PSA | 2時間 | 腫瘍発生率：100％ | 15 |
| PLL（0.1 mg / ml）を | 1×10 5 MB49-PSA | 2時間 | 腫瘍発生率：100％ | 16 |
| PLL（100μL0.1 mg / mlの20分） | 1×10 5 MB49 | 1時間 | 腫瘍発生率94％（15/16） | 17 |
| PLL（0.1 mg / ml）を | 1×10 6 MB49 | 7日目に血尿：14日目に50％、100％ | 18 | |
| PLL（100μL0.1μg/ mlの20分）または22％エタノール | 1×10 5メガバイト49 | 1時間 | 腫瘍発生率：変更されていない膀胱：0％、PLL：80から100パーセント;エタノール40から80パーセント | 19 |
| 硝酸銀（5μLの0.2 M） | 1×10 6 MB49 | 1時間 | 腫瘍発生率：100％ | 20 |
| 硝酸銀（10μL、0.15M 10秒） | 5×10 5 MB49 | 腫瘍発生率92％（46/50） | 21 | |
| 硝酸銀（8μLの1M 10秒） | 5×10 5 MB49 | 2時間 | 血尿：7日目に100％;日血尿100％;腫瘍発生率：96.7％（30分の29匹）15日目 | 22 |
| 硝酸銀5μLの0.2 M | 0.5〜2×10 6 MB49-PSA | 1時間 | PSAが検出 | 23 |
| 塩酸（100μLの0.1M 15秒） | 1×10 6 MB49 | 1時間 | 24 |
表1。MB49細胞の同所移植後に腫瘍の検出と開発。異なる物理的·化学的な傷害は、MB49細胞の膀胱内成長を促進するために、GAG層の破壊のために使用されている。 MB49同所性モデルを使用して、以前の研究から実験条件および結果をまとめる。ご利用の際は、最初の列の括弧内の情報は、ボリューム、濃度、およびエージェントの接触時間のGAG層の化学的破壊に用いるが含まれています。
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Discussion
このプロトコルで説明する主な方法は、細胞の点滴や膀胱上皮への局所送達のために意図されたいずれの薬剤のための広範なアプリケーションを持っていたマウスの膀胱のカテーテル法、である。上記で概説した具体的なプロトコルは、短期試験（〜10日）のために最適化されている。より高い細胞数が大きい腫瘍量、より急速な腫瘍増殖およびおそらく動物の損失をもたらすので、細胞の正確な数を注入して、重要である。点眼20万MB49細胞を使用することで、過度の腫瘍量に14日までに、動物の25％までの安楽死が必要な場合があります。我々の経験では、マウスに悪影響を12日以内に、腫瘍負荷の影響を受けません。このような無気力、貧しいグルーミング、および/または、このモデルでは食欲過剰な腫瘍量の減少などの標準的な基準に加えて排尿することができないことによって証明されている。
このプロトコルのための重要な考慮事項は、物流です。まず、MB49細胞はrapidlを育てる2日間、移植の前にYとメッキ百万の細胞を点滴注入の日に対数期において最適な文化を生み出す。実験に必要な動物の数は1日に移植することができる動物の数を超えると、MB49培養は培養液の異常増殖を防ぐために、（複数の日に）それに応じて設定されなければならない。技術が完成されるまで第二に、ユーザーは、動物の小グループで動作するはずです。経験豊富なユーザーは、アシスタント（滞留時間を含む1.5時間/群）なしで1日に5匹ずつの6グループを移植することができるようになります。しかし、当初はアシスタントが点滴のための細胞を調製し、カウントしておくと便利です。最後に、機器の位置が重要である。理想的にはバイオセーフティキャビネットや麻酔機器は同じ部屋に配置されています。
潜在的な制限は、麻酔装置はドウェル時間の間に使用されている5ノーズコーンを有することである。多数のマウスは日常的に注入される場合、それveralそのようなシステムは、並列に使用することができる。理論的には、麻酔の他の方法を用いることができる。しかしながら、イソフルラン吸入麻酔の利点は、滞留時間を制御できることである。
カテーテル法の技術が習得されると、このプロトコルは、実験条件の数に適用することができる。原発性膀胱腫瘍に由来する新しい膀胱癌細胞株または細胞は、同所で増殖するそれらの能力について評価することができる。さらに、腫瘍テイクために必要な閾値量を決定するために、細胞の異なる数字を注入することができる。腫瘍増殖率も確立することができる。比較は、腫瘍の確立または増殖速度に目的の遺伝子の影響を判断するために遺伝的に改変された細胞との間に形成されている場合、これらのバリエーションは、特に有用であり得る。接着、増殖速度、または腫瘍テイクの監視のために、細胞は、ルシフェラーゼ6のようなレポーター遺伝子をトランスフェクトすることができる。しかし、重要なconside配給は、生物発光信号29上低酸素症および壊死の影響である。カテーテル法はまた、治療剤を送達するために使用することができる。我々は現在、生体内の設定で遺伝子送達戦略を評価するために同所モデルを使用している。このモデルは、治療薬の送達を最適化すると、腫瘍退縮および生存への影響を決定するために有用であろう。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、クリスティーナVoelkel·ジョンソンにNIHのR21〜CA143505によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of reagent |
Company | Catalog number |
Comments |
| 6-8 week old female mice |
Jackson Laboratories | Strain Name: C57BL/6J Stock Number: 000664 |
|
| Trypsin* |
MediaTech | MT25-053-CI |
Obtained through Fisher |
| DMEM* |
MediaTech | MT10-017-CV |
Obtained through Fisher |
| FBS |
Hyclone | SH30071.03 |
Heat-inactivated |
| T25 flasks* |
Corning Costar | Corning No.:3056 Fisher: 07-200-63 |
Obtained through Fisher |
| MB49 cells |
N/A | N/A |
Obtained from Dr. Boehle (see reference11) |
| Puralube Vet Ointment* |
Pharmaderm | Henry Schein Company No.:036090-6050059 Fisher: NC9676869 |
Obtained through Fisher |
| Depilatory cream: Veet |
local pharmacy | ||
| Lubricant: K-Y Jelly |
local pharmacy | ||
| Catheters* |
Exel International | Exel International No.:26751; Fisher: 14-841-21 |
Obtained through Fisher |
| Isoflurane |
Terrell | NDC 66794-011-25 |
Obtained though hospital pharmacy |
| 1 ml slip tip TB syringes |
Becton Dickinson | BD309659 Fisher:14-823-434 |
|
| D-Luciferin |
Gold Biotechnologies | L-123-1 |
|
| Ad-CMV-Luc |
VectorBiolabs | 1000; Request large scale amplification and CsCl purification for in vivo use |
Infectious agent that requires BSL2 containment |
| Steady-Glo Luciferase Assay System |
Promega | E2510 (10 ml), E2520 (100 ml), or E2550 (10 x 100 ml) |
|
*available through multiple vendors |
|||
EQUIPMENT |
|||
| Anesthesia system |
E-Z Systems, Euthanex Corporation | Anesthesia system: EZ7000 5-port mouse rebreathing device: EZ109 |
Obtained through Fisher |
| Xenogen IVIS 200 |
Caliper Life Sciences | http://www.caliperls.com/products/preclinical-imaging/ivis-imaging-system-200-series.htm |
|
| FLUOstar Optima |
BMG Labtech | http://www.bmglabtech.com/products/microplate-reader/instruments.cfm?product_id=2 |
|
References
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