Summary
Мы сообщаем о способе выделения наивным мультипотентны, полученных из кожи предшественника (SKP) клеток из первичной культуры фибробластов человека. Покажем, что эти SKPs, полученных из культур фибробластов имеют сходные свойства стволовых клеток, чтобы те, выводится непосредственно из биопсии человеческой кожи. Эти клетки экспрессируют нервной маркер гребень, нестин, в дополнение к мультипотентных маркеры, такие как OCT4 и Nanog.
Abstract
За последнее десятилетие в ряде популяций взрослые стволовые клетки были идентифицированы в коже человека 1-4. Выделение кожного мультипотентны взрослых прекурсоров был впервые сообщил Миллер F. D лаборатории 5, 6. Эти ранние исследования, описанные мультипотентны популяции клеток предшественников от взрослых млекопитающих дермы 5. Эти клетки - называют SKPs, для кожи полученных предшественников - были выделены и расширена от грызунов и человека кожи и дифференцировались в обоих нервных и мезодермального потомство, в том числе типов клеток не найден в коже, такие как нейроны 5. Иммуноцитохимическая исследованиях на культуре SKPs показали, что клетки экспрессируют нестин и виментин, промежуточный белок нити выражены в нервной и предшественников скелетных мышц, в дополнение к фибронектин и мультипотентных стволовых клеток маркеры 6. До сих пор взрослые стволовые клетки SKPs населения не были выделены из свежесобранных млекопитающих биопсии кожи.
ve_content "> В последнее время мы создали и сообщил, что население шкуру, полученную клетки-предшественники могли остаться присутствует в первичных культурах фибробластов устанавливается с биопсии кожи 7. предположение, что несколько стволовых соматические клетки могут находиться в первичных культурах фибробластов на ранних удвоения населения был основанных на следующие замечания: (1) SKPs и первичных культурах фибробластов являются производными от дермы, и, следовательно, небольшое количество клеток SKP могли остаться присутствует в первичных культурах фибробластов кожных и (2) первичных культурах фибробластов, выращенных из замороженного аликвоты, которые были подвергается неблагоприятным температура во время хранения или передачи содержал небольшое количество клеток, которые остаются жизнеспособными 7. Эти редкие клетки смогли расширить и может быть пассировать несколько раз. Это наблюдение предположить, что небольшое число клеток с высокой активностью пролиферации и устойчивость к стрессу присутствовали в человеческих культурах фибробластов 7.Мы воспользовались этими выводами установить протокол для быстрого выделения взрослых стволовых клеток из первичных культурах фибробластов, которые легко доступны из ткани банков по всему миру (рис. 1). Этот метод имеет важное значение, поскольку она позволяет изолировать клетки-предшественники, когда образцы кожи не доступны в то время культур фибробластов могут быть получены от банков тканей, тем самым, открывая новые возможности для того чтобы рассечь молекулярные механизмы, лежащие в основе редких генетических заболеваний, а также заболеваний в моделировании блюдо.
Protocol
1. SKP Изоляция от первичных культурах фибробластов
- Фибробластов культур или из банков клеток или получен непосредственно из биопсии кожи поддерживают в культуре фибробластов ростовой среде DMEM, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина, 10 мг / мл пенициллина и 10 мкг / мл стрептомицина.
Фибробласты человека GMO3349C и GMO8398A были получены из Coriell института медицинских исследований (Камден, Нью-Джерси) и были использованы в данном исследовании.
- Культуры из удвоений популяции (ОПП) от 20 до 35 были использованы для SKP культур при слиянии 80%. Один 10 см культуре ткани блюдо (BD Falcon), содержит около 1.5x10 6 клеток.
- Мытье клеток с PBS и инкубируют с 2 мл раствора трипсина (0,25%, Invitrogen) в течение 1 часа при 37 ° С.
- Собирают клетки от пластины с 5 мл PBS и передачи клеточной суспензии в 15 мл трубки сокола.
- Клетки инкубируют при 4 ° С в течение 24 час.
- Подготовка SKP роста среде, состоящей из DMEM-F12, 3:1 (об / об) и 40 нг / мл FGF2 (BD Biosciences, 20 нг / мл EGF (BD Biosciences), B27 бессывороточной добавка 2% (Invitrogen), 1 мкг / мл Fungizone (Invitrogen) и 25 мкм / мл гентамицина (Invitrogen).
- Гранул клетки при 1200 оборотах в минуту в течение 5 мин и ресуспендируют осадок клеток непосредственно в 4 мл среды роста СКП. Передача клеточной суспензии до 25 см 2 культуре ткани колбы (BD Сокол).
- Инкубируют в колбе при 37 ° С и контролировать культуру сферы образование в день в течение от 3 до 4 недель.
2. Условия сфере культуры
- Культуры клеток в 25 см2 колбы (BD Falcon), при 37 ° С, 5% СО 2.
- Встряхнуть колбу энергично ежедневно, чтобы избежать клеток прикрепляться к нижней части колбы. При необходимости пипетку вверх и вниз с 2 мл стерильной пипетки, чтобы отделить прилипшие клетки и передавать культуру в новую колбу.
- Первая сферах начать строить в 3 тO 4 дней.
- Пусть сферы осадок на дно колбы и изменение половины среды каждые 3 дня. Для поддержания же самой конечной концентрации факторов роста добавлять 2X факторов роста в свежеприготовленной ростовой среды СКП.
- Держите постоянным объемом не более 4 мл.
- Когда сферах достигают размера ~ 200 мм, то они пассировать счет разрушения сфер меньшего размера энергичным пипетки вверх и вниз с 2 мл пипетки.
- Культура состоит из двух 25 см2 колбах (BD Falcon), и сферы культуры корма, как описано в пункте 2.4).
- Сферы собираются для маркеров стволовых клеток скрининга днем от 16 до 21.
Процедуру 2.6) и 2.7) описывают распространение сфер (1) позволяет питательные вещества и факторы роста включены в среднесрочный SKP получить доступ ко всем клеткам в каждой сфере и (2), чтобы развернуть SKP сфере культуры перед использованием.
Обычно сфера культуры под нашим у.е.lture условиях поддержания способность расти в течение трех месяцев и пассируют в пределах от 3 до 4 раз.
3. Иммуноцитохимическая для маркеров стволовых клеток
- Сфера культур собирают в PBS на день 16 до 21. Культуры осаждали при 1000 оборотах в минуту в течение 5 мин.
- Сферы ресуспендировали в небольшом объеме PBS.
- Нарисуйте два круга с ручкой ДАКО около 0,5 мкм в диаметре под микроскопом (Fisher бренда).
- Добавить 50 мкл суспензии в сфере кругах.
- Проверка с помощью световой микроскопии на наличие сфер в каждой капле.
- Пусть капли сухого под капотом.
- Либо заморозить слайды при температуре -80 ° C или переходите к протоколу окрашивания иммунофлюоресцентным.
- Для окрашивания иммунофлюоресценции, исправить слайды с предварительно охлажденным метанолом (100%) при температуре -20 ° С в течение 10 мин.
- Вымойте слайды с PBS.
- Блок слайды с ЗФР/10% эмбриональной телячьей сыворотки / 0,02% Triton X100течение по крайней мере 1 час.
- Инкубируют с первичным антителом (например, анти-Nestin, анти-Oct4, анти-TG30, анти-антител Nanog, таблица 3) разводили в блокирующем буфере: ЗФР/10% FBS в течение 2 часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С.
- Промыть 3 раза блокирующим буфером и инкубировали со вторичными антителами в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Промыть 3 раза блокирующим буфером и три раза PBS.
- Горы слайды с Vectashield монтажа среды (Vector Inc.)
- Анализ образцов на экспрессию маркеров стволовых клеток с помощью иммунофлуоресценции микроскопии.
4. Realtime ПЦР-анализ уровня экспрессии маркеров стволовых клеток
- Берут примерно 2-3 мл сфере культуры с 18 дня до 21.
- Гранула сферы на 1200 оборотах в минуту в течение 5 мин и аспирации всех средних.
- Изолят РНК из сфер использованием Minikit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA).
- Оценка чистоты РНК спектрометрии и агарозном геле. </ Li>
- Синтезировать кДНК (Omniscript обратной транскриптазы (Qiagen)) с использованием полной клеточной РНК в качестве матрицы.
- Подтвердить маркеров стволовых клеток путем реальном времени ПЦР с использованием праймеров для маркеров стволовых клеток (см. таблицу 1) в мощность SYBR Green PCR Mastermix (Applied Biosystems) в концентрации 375 нМ каждого праймера и 50 нг матрицы в 20 мкл реакционного объема. GAPDH используется в качестве эндогенного контроля.
- Для амплификации использовать первоначальной денатурации при 95 ° С в течение 2,5 мин с последующими 40 циклами при 95 ° С в течение 5 сек и при 60 ° С в течение 20 сек.
- Анализ выполняется с 2 (ΔΔCt) Способ 8.
5. Направленной дифференцировки в клетках гладкой мускулатуры
- Сферы с первого дня с 21 по 26 высевали в 6-луночные планшеты для культивирования (BD Falcon), в среду СКП.
- Клетки позволено придерживаться и перерастают из сферы в среду СКП в течение 72 часов.
- Клетки гладких мышц (ГМК) differentiatион начала инициированной заменены среде с SMC дифференциации среды, состоящей из высоко-глюкозы Игла, модифицированной Дульбекко среде (Invitrogen), содержащей 5% FBS, 5 нг / мл PDGF-BB (Invitrogen) и 2,5 нг / мл TGF-b1 (Invitrogen) .
- Среду меняли каждые 3 дня свежеприготовленным SMC среднего дифференциации на срок от 3 до 4 недель в культурах.
- Скрининг на маркеры SMC проводили через 3 до 4 недель с помощью иммуногистохимии.
- Клетки фиксировали 4% параформальдегидом раствора в PBS в течение 10 мин.
- Клетки были проницаемыми ЗФР, содержащим 0,3% Тритон Х-100 в течение 30 мин.
- Клетки инкубировали с антителами против αSMA (MO851, Dako, 1:100) или calponin (M3556, Dako, 1:100) в течение 1 часа при комнатной температуре и далее обрабатывают, как описано в 3,12) до 3,15).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы показали, что популяция клеток, которые селективно расширить для создания СКП сфере при контролируемых условиях роста, состоящие из EGF и FGF2 присутствуют в первичных культурах фибробластов кожные (рис. 1), как мы недавно сообщила 7.
Фибробластов культур от PPDs 15 до 25, которые обычно относятся к первичному штаммов фибробластов доступны из банков клеток были использованы в этом исследовании. Культурами фибробластов представлен двойной обработке, состоящей из холодной обработки температура вместе с истощением питательных веществ в течение 24 часов описанных в данном методе воспроизводимо генерируется культур, содержащих плавающей сферы (также упоминается как эмбриональные EB тела) с аналогичными признаками роста, как описана выше для SKPs получены непосредственно из образцов кожи, 7, 9.
Здесь мы покажем, что с помощью метода, который мы недавно сообщали 7, мы изолируем населения CELLS от первичных культурах фибробластов, которые обладают свойствами, аналогичными свойствам мультипотентны нервных стволовых / клеток-предшественников, выделены и идентифицированы в человека и мыши дермы использованием нейросфер условиях культивирования 5, 10, 11. Эти SKP-получают из первичных человеческих культурах фибробластов показать самообновлению потенции, поскольку они могут быть расширены и пассировать, по крайней мере в течение трех месяцев в пробирке (обратитесь к методу раздел). Когда сферах достиг размера от 150 до 200 мкм в диаметре после 18 до 21 дней в культуре, они были механически разбивается на в среднем 50 мкм в диаметре и позволило повторно разворачивать в суспензионной культуре в средней SKP. Эти сломанного сферах было позволено расти, пока не достигла 200 мкм до того пассировать еще раз, как описано в разделе Метод. SKP сферы могут быть пассировать по крайней мере три раза. Это наблюдение показывает, что клетки внутри сферы были способны самостоятельно обновить и расширить под нейросфер условиях культуры как оThers, и мы сообщили 5, 7.
Более того, эти SKP клетки, полученные из культур фибробластов выразил нервного гребня и нейронных стволовых клеток маркера нестину а также эмбриональных стволовых клеток транскрипционных факторов Nanog и Oct4 и плюрипотентных маркеров клеточной поверхности TG30 (рис. 2), как и в СКП получены непосредственно из кожи Биопсии 5, 7, 10. Иммуногистохимия на сферах SKP указано нестину позитивный сигнал в цитоплазме, октябрь 4 показало перемежается сигнал ядерной и Nanog показал более рассеянный сигнал ядерной (рис. 2). Кроме того, маркер клеточной поверхности плюрипотентных человеческие эмбриональные стволовые клетки TG30 положительно окрашивание цитоплазматических мембран на СКП сфера препараты (рис. 2). С помощью ПЦР в реальном времени, мы также подтвердили наличие мРНК, кодирующих нестину и Oct4 в подготовке РНК, выделенной из SKP сферы собранных день 18 в культуре (рис. 3 5,10. Для дальнейшего тестирования мультипотентностью СКП, полученные из культур фибробластов, то индуцированный этих клеток к дифференцировке в клетки гладких мышц (рис. 4). Через 3 недели индукции в среде, содержащей фактор роста PDGF-BB и TGF-b1 12, иммуноцитохимия подтвердили выражение SMC маркеры, αSMA, calponin в гладкомышечных клеток, полученные из этих SKPs (рис. 4).
В совокупности этот метод, и результаты показывают, что СКП сферы изолированы от первичных культурах фибробластов имеют сходные свойства с теми, полученные из биопсии кожи и необходимо исходить из взрослой клетки стволовые населения, проживающего в пределах человеческого дермы кожи.
| Название | Entrez ID | Праймер последовательности | Amplicon |
| GAPDH | 2597 | F-CTC ТГК TCC TCC TGT TCG AC | 144 б.п. |
| R-TTA AAA GCC GCA CTG GTG AC | |||
| Nestin | 10763 | F-GCCCTGACCACTCCAGTTTA | 200 б.п. |
| R-GGAGTCCTGGATTTCCTTCC | |||
| 4-октябрь | 5460 | F-GAT CTG GGC GTA TGG GCC C | 195 б.п. |
| R-TGG GAC TCC TCC GGG ТТТ TG |
Таблица 1. Список праймеры, используемые для ПЦР в реальном времени и кПЦР.
| Антитело | Компания | Номер по каталогу | Комментарии |
| анти-Nestin | Chemicon | MAB5326 | 1/100 |
| анти-Oct4 | Abcam | ab19857 | 1/400 |
| анти-TG30 | Millipore | TG30 | 1/400 |
| анти-Nanog | Abcam | ab21624 | 1/400 |
| анти-αSMA | Dako | MO851 | 1/100 |
| анти-Calponin 1 | Dako | M3556 | 1/100 |
| Alexa Fluor; 555 осла против кроличьего IgG (H + L) | Invitrogen | A31572 | 1/800 |
| Alexa Fluor; 555 осла против мышиных IgG (H + L) | Invitrogen | A31570 | 1/800 |
| Alexa Fluor; 488 осла против мышиных IgG (H + L) | Invitrogen | A21202 | 1/800 |
| Alexa Fluor; 488 осла против кроличьего IgG (H + L) | Invitrogen | A21206 | 1/800 |
Таблица 3. Список происхождения антител.
Рисунок 1. Выделение SKPs от первичных культурах фибробластов. Метод SKP сфере культуры начиная с первичных кожных культур фибробластов GMO3349C при прохождении 12 изложена. День 0 показано исходное фибробластов суспензии в питательной среде СКП. День 4 видимые формирования сферы. День 17 показан типичный 3D сферы SKP. Шкала бар: 50 мм до 100 мкм, как указано.arge.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок.
Рисунок 2. Иммунофлуоресцентное окрашивание SKP сфер, полученных из первичных культурах фибробластов. Иммунофлуоресценция выполнить анализ SKPs полученные из человеческих первичных культурах фибробластов (GMO3349C). Сферы из 16-й день были нанесены на предметные стекла микроскопа и окрашивали анти-Nestin, анти-TG30, анти-Oct4 и анти-Nanog антитела, как указано. Ядра контрастным пятном ДНК DAPI (синий). Шкала бар:. 20 мм Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 4. Клетки гладких мышц-полученные от SKP сферы изолированы от первичных культурах фибробластов. SKP-сфер, полученных из первичных фибробластов были направлены к дифференцировке в клетки гладких мышц (ГМК). (A) изображений фазового контраста сводный различные этапы культуры от SKP сферы культуры к дифференциации ГМК (верхняя панель). (B) ГМК, полученных из сферы SKP подвергали иммунному для указанных SMC маркеры, α-Смутач мышц актин (αSMA) и calponin как указано. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
С помощью способа, описанного здесь, наивных кожные стволовые клетки могут быть выделены из первичных культур кожных фибробластов. Используя этот подход, мы недавно сообщали выделение и характеристика взрослых стволовых клеток из культуры фибробластов, взятых от пациентов с редким генетическим синдромом Хатчинсона-Гилфорда прогерией синдром 7. Как показывают здесь эти клетки-предшественники экспресс-маркеров стволовых клеток способны к самообновлению и могут быть направлены к дифференцировке в различные клеточные линий, включая фибробласты и клетки гладких мышц (см. рисунок 4 по Венцель и соавт., 2012) 7. Этот метод имеет ряд преимуществ метода сообщалось ранее для выделения SKPs млекопитающих, образцы кожи 10. СКП может быть выделен из первичных культур фибробластов, которые либо только что установленный с биопсии кожи или из первичных культур фибробластов, которые уже существуют и могут быть полученыиз клеточных банков по всему миру. Этот новый подход дает возможность изучить последствия взрослых стволовых клеток в патогенезе различных генетических и редких заболеваний, для которых образцы кожи не являются легкодоступными. Наконец этот метод обеспечивает окно возможностей для изучения биологии взрослых стволовых клеток и анализировать их влияние во время физиологических и болезненное состояние. В заключение этот подход предлагает новый и быстрый способ изолировать кожу производные клеток-предшественников.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа выполнена при поддержке Фонда Александра фон Гумбольдта (5090371), Кристин Кюне Центра исследований аллергии и образования (CK-CARE) и Баварской Staatsministerium (в КД).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM high glucose | Invitrogen | 31966-047 | |
| DMEM low glucose | Invitrogen | 21885-108 | |
| fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-106 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-024 | Final conc.: 200 mM |
| Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Final conc.: 10 mg/ml /10 mg /ml |
| trypsin solution (0.25%) | Invitrogen | 25200-056 | |
| F-12 Nutrient Mixture (Ham) | Invitrogen | 21765-029 | |
| FGF2 | BD Biosciences | 4114-TC-01M | Final conc.: 40 ng/ml |
| EGF | BD Biosciences | 236-EG-200 | Final conc.: 20 ng/ml |
| PDGFBB | Invitrogen | PHG0043 | Final conc.: 5 ng/ml |
| TGF-b1 | Invitrogen | PHG9204 | Final conc.: 2.5 ng/ml |
| 25 cm2 flask | Omnilab | FALC353109 | |
| PBS w/o CaMg | Invitrogen | 14190-169 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| Methanol | Roth | 8388.2 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Inc. | H-1200 | |
| RNeasy Minikit | Qiagen, Valencia, CA | 74104 | |
| Omniscript Reverse Transcriptase | Qiagen | 205113 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix | BioRad | 172-5201 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | Final conc.:1 mg/ml |
| Table 2. Specific reagents and equipment. | |||
References
- Jahoda, C. A., Whitehouse, J., Reynolds, A. J., Hole, N. Hair follicle dermal cells differentiate into adipogenic and osteogenic lineages. Exp. Dermatol. 12, 849 (2003).
- Watt, F. M., Celso, L. o, C,, Silva-Vargas, V. Epidermal stem cells: an update. Curr. Opin. Genet. Dev. 16, 518 (2006).
- Blanpain, C., Horsley, V., Fuchs, E. Epithelial stem cells: turning over new leaves. Cell. 128, 445 (2007).
- Hunt, D. P., Jahoda, C., Chandran, S. Multipotent skin-derived precursors: from biology to clinical translation. Vurr. Opin. Biotechnol. 20, 522 (2009).
- Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat. Cell Biol. 3, 778 (2001).
- Fernandes, K. J. L., et al. A dermal niche for multipotent adult skin-derived precursor cells. Nat. Cell Biol. 6, 1082 (2004).
- Wenzel, V., et al. Naïve adult stem cells from patients with Hutchinson-Gilford progeria syndrome express low levels of progerin in vivo. Bio. Open. 1, (2012).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402 (2001).
- Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. T., Miller, F. D. Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny. Nature Protocol. 1, 2803 (2006).
- Toma, J. G., McKenzie, I., Bagli, D., Miller, F. D. Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin. Stem Cells. 23, 727 (2005).
- Fernandes, K. J., et al. Analysis of the neurogenic potential of multipotent skin-derived precursors. Electrophoresis. 201, 32 (2006).
- Hill, lK. L., et al. Human embryonic stem cell-derived vascular progenitor cells capable of endothelial and smooth muscle cell function. Exp. Hematol. 38, 246 (2010).
