Summary
Vi rapporterar en metod för att isolera naiva multipotenta hud-derived prekursorer (SKP) celler från primära humana fibroblastkulturer. Vi visar att dessa SKPs härrör från fibroblastkulturer delar liknande egenskaper stamceller till de som härrör direkt från mänsklig hud biopsier. Dessa celler uttrycker neurallisten markör, nestin, förutom de multipotenta markörer såsom Oct4 och Nanog.
Abstract
Under det senaste decenniet har flera vuxna stamceller har identifierats i human hud 1-4. Isoleringen av multipotenta vuxna dermal prekursorer rapporterades först av Miller F. D laboratoriet 5, 6. Dessa tidiga studier beskrivs en multipotent befolkning prekursorcell från vuxna däggdjur dermis 5. Dessa celler - kallade SKPs, för hud-härledda prekursorer - isolerades och expanderades från gnagare och mänsklig hud och differentieras till både neurala och mesodermal avkomma, inklusive celltyper aldrig hittats i huden, till exempel nervceller 5. Immunocytokemiska studier på odlade SKPs avslöjade att celler uttryckte vimentin och nestin, ett mellanliggande filament protein uttryckt i neurala och skelettmuskel prekursorer, förutom fibronektin och multipotenta stamceller markörer cellen 6. Hittills har de adulta stamceller befolkningen SKPs isolerats från nyuppsamlade däggdjur hudbiopsier.
ve_content "> Nyligen har vi etablerat och rapporterade att en population av hud härledda prekursorceller kan finnas kvar i primära fibroblastkulturer etablerade från hudbiopsier 7. Antagandet att några somatiska stamceller kan bosätta sig i primära fibroblastkulturer vid tidiga populationsfördubblingar var bygger på följande iakttagelser: (1) SKPs och primära kulturer fibroblaster härstammar från dermis, och därmed ett litet antal SKP celler kan finnas kvar i primära dermala fibroblastkulturer och (2) primära fibroblastkulturer vuxit från frysta portioner som har varit utsätts för ogynnsamma temperatur under lagring eller överföring innehöll ett litet antal celler som förblev lönsamt 7. Dessa sällsynta celler kunde expandera och kunde passera flera gånger. Denna observation föreslog att ett litet antal celler med hög spridning potens och motståndskraft mot stress var närvarande i humana fibroblastkulturer 7.Vi drog fördel av dessa resultat att upprätta ett protokoll för snabb isolering av adulta stamceller från primära fibroblastkulturer som är lätt tillgängliga från vävnad banker runt om i världen (figur 1). Denna metod har viktig betydelse eftersom den möjliggör isolering av prekursorceller när hudprover är inte tillgängliga när fibroblastkulturer kan vara tillgängliga från vävnadsbanker, alltså, öppnar nya möjligheter för att dissekera de molekylära mekanismerna bakom sällsynta genetiska sjukdomar samt sjukdomar modellering i en skålen.
Protocol
Ett. SKP Isolering från Primär fibroblastkulturer
- Fibroblastkulturer antingen från cellbanker eller direkt erhållen från hudbiopsier hålls i kultur i fibroblast tillväxtmedium DMEM innehållande 15% fetalt kalvserum, 2 mM glutamin, 10 mg / ml penicillin och 10 mg / ml streptomycin.
Humanfibroblaster GMO3349C och GMO8398A erhölls från Coriell Institutet för Medicinsk forskning (Camden, NJ) och användes i denna studie.
- Kulturer från populationsfördubblingar (PPD) var 20 till 35 används för SKP kulturer vid en sammanflytning av 80%. En 10 cm vävnadsodlingsskål (BD Falcon) innehåller ca 1.5x10 6 celler.
- Tvätta cellerna med PBS och inkubera med 2 ml trypsinlösning (0,25%, Invitrogen) under 1 timme vid 37 ° C.
- Samla cellerna från plattan med 5 ml PBS och överför cellsuspensionen till ett 15 ml Falcon rör.
- Inkubera cellerna vid 4 ° C under 24 timmar.
- Förbered SKP tillväxt medium bestående av DMEM-F12, 03:01 (volym / volym) och 40 ng / ml FGF2 (BD Biosciences, 20 ng / ml EGF (BD Biosciences), B27 serum gratisbilaga 2% (Invitrogen), 1 ^ g / ml Fungizone (Invitrogen) och 25 um / ml Gentamycin (Invitrogen).
- Pellets cellerna vid 1200 rpm under 5 minuter och resuspendera cellpelleten direkt i 4 ml SKP tillväxtmedium. Överför cellsuspensionen till en 25 cm 2 vävnadsodlingskolv (BD Falcon).
- Inkubera kolven vid 37 ° C och övervaka kultur för sfär bildning dagligen i 3 till 4 veckor.
2. Sphere odlingsbetingelser
- Kultur celler i en 25 cm 2 kolv (BD Falcon) vid 37 ° C, 5% CO2.
- Skaka kolven kraftigt dagligen för att undvika celler att vidhäfta till botten av kolven. Om det behövs, pipettera upp och ned med en 2 ml steril pipett för att lösgöra vidhäftande celler och överför kulturen till en ny kolv.
- Första sfärer börja bygga inom 3 to 4 dagar.
- Låt sfärer sediment till botten av kolven och förändring hälften av mediet var 3 dagar. För att hålla samma slutkoncentration av tillväxtfaktorer lägga 2X tillväxtfaktorer till nyberedd SKP tillväxtmedium.
- Håll volymen konstant maximalt 4 ml.
- När kloten nå en storlek på ~ 200 mm bör de passeras genom att bryta ner sfärerna till mindre storlek genom kraftig pipettera upp och ned med en 2 ml pipett.
- Kulturen är uppdelad i två 25 cm 2 kolvar (BD Falcon) och sfärer kulturer är foder som beskrivs i steg 2.4).
- Sfärer samlas för markörer stamceller screening med dag 16 till 21.
Proceduren från 2,6) och 2,7) beskriver utbredningen av sfärerna till (1) tillåter näringsämnen och tillväxtfaktorer som ingår i SKP medium för att få tillgång till alla celler i varje sfär och (2) för att expandera SKP sfären kulturen före användning.
Typiskt Sphere kulturer enligt våra culture förhållanden upprätthålla förmågan att växa under en period av tre månader och passera mellan 3 till 4 gånger.
Tre. Immunocytokemi för markörer stamceller
- Sphere kulturer skördas i PBS vid dag 16 till 21. Kulturer är pelleterades vid 1000 rpm under 5 min.
- Spheres återsuspenderas i en liten volym PBS.
- Rita två cirklar med en DAKO penna på ungefär 0,5 mikrometer i diameter på objektglas (Fisher märke).
- Tillsätt 50 l av sfär suspension i cirklarna.
- Kontrollera med Ijusmikroskopi med avseende på närvaro av sfärer i varje droppe.
- Låt dropparna torka under huven.
- Antingen frysa objektglasen vid -80 ° C eller fortsätta med immunofluoresence färgningsprotokollet.
- För immunofluorescensfärgning, fixa glasen med förkyld Metanol (100%) vid -20 ° C under 10 min.
- Tvätta objektglasen med PBS.
- Blockera objektglasen med PBS/10% fetalt bovint serum / 0,02% Triton X 100under minst 1 timme.
- Inkubera med primär antikropp (t ex anti-Nestin, anti-Oct4, anti-TG30, anti-Nanog antikroppar, Tabell 3) utspätt i blockerande buffert: PBS/10% FBS under 2 h vid rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C.
- Tvätta tre gånger med blockerande buffert och inkubera med sekundär antikropp under 1 timme vid rumstemperatur.
- Tvätta tre gånger med blockerande buffert och tre gånger med PBS.
- Mount diabilder med Vectashield monteringsmedium (Vector Inc.).
- Analysera prover för uttryck av markörer stamceller genom immunofluorescens mikroskopi.
4. Realtime PCR-analys av uttryck nivåer av markörer stamceller
- Ta ca 2-3 kulturer ml Sphere från dag 18 till 21.
- Pellets sfärerna vid 1200 rpm i 5 minuter och aspirera alla medium.
- Isolera RNA från sfärerna med hjälp av RNeasy Minikit (Qiagen, Valencia, CA).
- Bedöm RNA renhet genom spektrometri och agarosgel. </ Li>
- Syntetisera cDNA (Omniscript omvänt transkriptas (Qiagen)) med det totala cellulära RNA som mall.
- Validera markörer stamceller från Realtime-PCR med primers för markörer stamceller (visas i tabell 1) i en Power SYBR Grön PCR Mastermix (Applied Biosystems) med en koncentration av 375 nM av varje primer och 50 ng templat i en 20 pl reaktionsvolym. GAPDH användes som endogen kontroll.
- För amplifieringen använda en initial denaturering vid 95 ° C under 2,5 min följt av 40 cykler vid 95 ° C under 5 sekunder och 60 ° C under 20 sek.
- Analysera körningen med 2 (ΔΔCt) metoden 8.
Fem. Riktad differentiering in i glatta muskelceller
- Sfärer från dag 21 till 26 ströks i 6 brunnars odlingsplattor (BD Falcon) i SKP mediet.
- Cellerna fick vidhäfta och växa ur från sfärer i SKP medium under 72 timmar.
- Glatta muskelceller (SMC) differentiation började initieras av ersatte mediet med SMC differentiering medium bestående av hög-glukos modifierad Dulbeccos Eagle-medium (Invitrogen) innehållande 5% FBS, 5 ng / ml PDGF-BB (Invitrogen), och 2,5 ng / ml TGF-b1 (Invitrogen) .
- Medium byttes var 3 dagar med nylagade SMC differentiering medium för en period på 3 till 4 veckor i kulturer.
- Screening för SMC markörer utfördes efter 3 till 4 veckor genom immunhistokemi.
- Cellerna fixerades med 4% paraformaldehyd-lösning i PBS under 10 min.
- Cellerna permeabiliserades med PBS innehållande 0,3% Triton X-100 i 30 min.
- Celler inkuberades med antikroppar mot αSMA (MO851, Dako, 1:100), eller Calponin (M3556, Dako, 1:100) under en timme vid rumstemperatur och ytterligare bearbetades enligt beskrivning i 3,12) till 3,15).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi visar att en population av celler som selektivt expandera generera SKP sfärer under kontrollerade tillväxt tillstånd bestående av EGF och FGF2 finns i primära dermala fibroblastkulturer (figur 1) som vi nyligen rapporterat 7.
Fibroblastkulturer från PPD: 15-25 som typiskt motsvarar de primära fibroblaster stammar tillgängliga från cellbanker användes i denna studie. Fibroblastkulturer inkommit till dubbel behandling bestående av kall temperatur behandling tillsammans med näring utarmning under 24 timmar som beskrivs i denna metod reproducerbart genererade kulturer innehållande flytande sfärer (även kallat embryoid kropp EB) delar liknande tillväxt egenskaper som den tidigare beskrivits för SKPs härrör direkt från hudprover 7, 9.
Här visar vi att använda den metod som vi nyligen rapporterat 7, vi isolera en population av ceLLS från primära fibroblastkulturer som uppvisar liknande egenskaper som de multipotenta neurala stam / prekursor-celler, isoleras och identifieras i human och mus dermis användning neurosfärceller odlingsbetingelser 5, 10, 11. Dessa SKP-härledda från primära humana fibroblastkulturer visar självförnyande potens som de kan utökas och passerades under åtminstone en period av tre månader in vitro (se metoddel). När sfärer nådde en storlek av 150 till 200 ^ M i diameter efter 18 till 21 dagar i odling, de mekaniskt delas upp i ett genomsnitt av 50 pm i diameter och tilläts att åter-expandera i suspensionsodling i SKP medium. Dessa uppdelade sfärerna fick växa tills de nådde 200 iM innan som passerades igen enligt beskrivningen i metod avsnittet. SKP sfärer kunde passera minst tre gånger. Denna observation tyder på att celler inom sfärerna var kapabla att själv förnya och expandera under neurosfärceller odlingsbetingelser som others och vi rapporterade 5, 7.
Dessutom uttryckte dessa SKP celler härledda från fibroblastkulturer neurallisten och neuron stamceller markören nestin liksom den embryonala stamcellen transkriptionsfaktorer NANOG och Oct4 och den pluripotenta cellytmarkör TG30 (figur 2), på liknande sätt som SKP härleds direkt från huden biopsier 5, 7, 10. Immunohistokemi på SKP sfärer indikerade nestin positiv signal i cytoplasman, uppvisade 4 oktober en punctuated nukleär signal och Nanog uppvisade en mer diffus nukleär signal (Figur 2). Dessutom gav cellytan markör för pluripotenta mänskliga embryonala stamceller TG30 en positiv cytoplasmamembranet färgning på SKP sphere preparat (Figur 2). Använda realtid PCR, bekräftade vi också förekomsten av mRNA som kodar för nestin och Oct4 i RNA-beredning isolerades från SKP sfärer som samlats vid dag 18 i kulturen (Figur 3 5,10. För att ytterligare testa multipotens av SKP härrör från fibroblastkulturer, framkallade vi dessa celler att differentiera till glatta muskelceller (Figur 4). Efter tre veckors induktion i medium innehållande tillväxtfaktorerna PDGF-BB och TGF-b1 12 bekräftade immunocytokemi uttrycket av de SMC markörer, αSMA, Calponin i SMC härledda från dessa SKPs (Figur 4).
Kollektivt denna metod och resultat visar att SKP sfärer isolerade från primära fibroblastkulturer delar liknande egenskaper som de som härrör från hudbiopsier och måste härröra från en vuxen stamceller befolkningen bor i den mänskliga huden dermis.
| Namn | Entrez ID | Primer Sekvens | Amplikon |
| GAPDH | 2597 | F-CTC TGC TCC TCC TGT TCG AC | 144 bp |
| R-TTA AAA GCA GCC CTG GTG AC | |||
| Nestin | 10763 | F-GCCCTGACCACTCCAGTTTA | 200 bp |
| R-GGAGTCCTGGATTTCCTTCC | |||
| 4-Oct | 5460 | F-GAT GGC GTA CTG TGG GCC C | 195 bp |
| R-TGG GAC TCC TCC GGG TTT TG |
Tabell 1. Lista av primers som används för realtids PCR och qPCR.
| Antikropp | Company | Katalognummer | Kommentarer |
| anti-Nestin | Chemicon | MAB5326 | 1/100 |
| anti-Oct4 | Abcam | ab19857 | 1/400 |
| anti-TG30 | Millipore | TG30 | 1/400 |
| anti-Nanog | Abcam | ab21624 | 1/400 |
| anti-αSMA | Dako | MO851 | 1/100 |
| anti-Calponin en | Dako | M3556 | 1/100 |
| Alexa Fluor, 555 åsna anti-kanin IgG (H + L) | Invitrogen | A31572 | 1/800 |
| Alexa Fluor; 555 åsne-anti-mus IgG (H + L) | Invitrogen | A31570 | 1/800 |
| Alexa Fluor, 488 åsne-anti-mus IgG (H + L) | Invitrogen | A21202 | 1/800 |
| Alexa Fluor, 488 åsne-anti-kanin-IgG (H + L) | Invitrogen | A21206 | 1/800 |
Tabell 3. Lista av antikroppar ursprung.
Figur 1. Isolering av SKPs från primära fibroblastkulturer. Metoden för SKP sfär kultur från primära dermala fibroblastkulturer GMO3349C vid passage 12 skisseras. Dag 0 visar start fibroblast suspension i SKP odlingsmedium. Dag 4 visar synliga sfär bildas. Dag 17 visar en typisk 3D SKP sfär. Skala bar: 50 mm och 100 nm som anges.arge.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.
Figur 2. Immunofluorescensfärgning av SKP sfärer härstammar från primära fibroblastkulturer. Immunfluorescensanalys utförs på SKPs härledda från humana primära fibroblastkulturer (GMO3349C). Sphere från dag 16 deponerades på objektglas och färgades med anti-Nestin, anti-TG30, anti-Oct4 och anti-nanog antikroppar som anges. Kärnor motfärgades med en DNA-färgen DAPI (blå). Skala bar:. 20 mm Klicka här för att visa en större bild .
Figur 4. Glatta muskelceller-härledda från SKP sfärer isolerade från primära fibroblastkulturer. SKP-sfärer som härrör från primära fibroblaster riktades att differentiera till glatta muskelceller (SMC). (A) Faskontrast avbildning rekapitulera de olika kultur steg från SKP sfären kulturen till SMC differentiering (övre panelen). (B) SMC härledda från SKP sfärer immunofärgades för angivna SMC markörer, α-smooth muskelaktin (αSMA) och Calponin anges som. Klicka här för att visa en större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med användning av metoden som beskrivs häri, kan naiva dermala stamceller isoleras från primära dermala fibroblastkulturer. Med hjälp av denna metod, rapporterade vi nyligen isolering och karaktärisering av adulta stamceller från fibroblastkulturer härledda från patienter med en sällsynt genetisk syndrom, Hutchinson-Gilford progeria syndrom 7. Som visar här de precursorceller uttryckliga stamceller markörer klarar av själv-förnyande och kan riktas för att differentiera till olika cellulära härstamningar bland andra fibroblaster och glatta muskelceller (se Figur 4 av Wenzel et al., 2012) 7. Denna metod erbjuder flera fördelar med att den metod som tidigare rapporterats för isoleringen av SKPs från däggdjurs hudprover 10. SKP kan isoleras från primära fibroblastkulturer som antingen är nyligen etablerade från hudbiopsier eller från primära fibroblastkulturer som redan existerar och kan erhållasfrån cell banker runt om i världen. Denna nya metod ger möjlighet att studera konsekvenserna av adulta stamceller i patogenesen av olika genetiska och sällsynta sjukdomar för vilka hudprover inte är lätt tillgängliga. Slutligen denna metod ger ett gyllene tillfälle att utforska vuxna biologi stamceller och dissekera deras påverkan under fysiologiska och sjukdomstillstånd. Sammanfattningsvis detta tillvägagångssätt erbjuder ett nytt och snabbt sätt att isolera huden härledda prekursorceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Alexander von Humboldt-stiftelsen (5090371), den Christine Kühne Centrum för allergiforskning och utbildning (CK-CARE), och Bayerischen Staatsministerium (KD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM high glucose | Invitrogen | 31966-047 | |
| DMEM low glucose | Invitrogen | 21885-108 | |
| fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-106 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-024 | Final conc.: 200 mM |
| Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Final conc.: 10 mg/ml /10 mg /ml |
| trypsin solution (0.25%) | Invitrogen | 25200-056 | |
| F-12 Nutrient Mixture (Ham) | Invitrogen | 21765-029 | |
| FGF2 | BD Biosciences | 4114-TC-01M | Final conc.: 40 ng/ml |
| EGF | BD Biosciences | 236-EG-200 | Final conc.: 20 ng/ml |
| PDGFBB | Invitrogen | PHG0043 | Final conc.: 5 ng/ml |
| TGF-b1 | Invitrogen | PHG9204 | Final conc.: 2.5 ng/ml |
| 25 cm2 flask | Omnilab | FALC353109 | |
| PBS w/o CaMg | Invitrogen | 14190-169 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| Methanol | Roth | 8388.2 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Inc. | H-1200 | |
| RNeasy Minikit | Qiagen, Valencia, CA | 74104 | |
| Omniscript Reverse Transcriptase | Qiagen | 205113 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix | BioRad | 172-5201 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | Final conc.:1 mg/ml |
| Table 2. Specific reagents and equipment. | |||
References
- Jahoda, C. A., Whitehouse, J., Reynolds, A. J., Hole, N. Hair follicle dermal cells differentiate into adipogenic and osteogenic lineages. Exp. Dermatol. 12, 849 (2003).
- Watt, F. M., Celso, L. o, C,, Silva-Vargas, V. Epidermal stem cells: an update. Curr. Opin. Genet. Dev. 16, 518 (2006).
- Blanpain, C., Horsley, V., Fuchs, E. Epithelial stem cells: turning over new leaves. Cell. 128, 445 (2007).
- Hunt, D. P., Jahoda, C., Chandran, S. Multipotent skin-derived precursors: from biology to clinical translation. Vurr. Opin. Biotechnol. 20, 522 (2009).
- Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat. Cell Biol. 3, 778 (2001).
- Fernandes, K. J. L., et al. A dermal niche for multipotent adult skin-derived precursor cells. Nat. Cell Biol. 6, 1082 (2004).
- Wenzel, V., et al. Naïve adult stem cells from patients with Hutchinson-Gilford progeria syndrome express low levels of progerin in vivo. Bio. Open. 1, (2012).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402 (2001).
- Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. T., Miller, F. D. Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny. Nature Protocol. 1, 2803 (2006).
- Toma, J. G., McKenzie, I., Bagli, D., Miller, F. D. Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin. Stem Cells. 23, 727 (2005).
- Fernandes, K. J., et al. Analysis of the neurogenic potential of multipotent skin-derived precursors. Electrophoresis. 201, 32 (2006).
- Hill, lK. L., et al. Human embryonic stem cell-derived vascular progenitor cells capable of endothelial and smooth muscle cell function. Exp. Hematol. 38, 246 (2010).
