Summary
우리는 인간의 기본 섬유 아세포 배양에서 순진 능성 피부에서 파생 된 전구체 (SKP) 세포를 분리하는 방법을보고합니다. 우리는 섬유 아세포 문화에서 파생 된 이러한 SKPs은 인간의 피부 생검에서 직접 파생 된 것과 유사한 줄기 세포 특성을 공유하는 것을 보여줍니다. 이러한 세포는 OCT4와 나노 등 능성 마커뿐만 아니라 신경 능선 마커 스틴을 표현한다.
Abstract
지난 십 년간, 여러 성체 줄기 세포 집단은 인간의 피부 1-4에서 발견되었습니다. 능성 성인 피부 전구체의 분리가 처음 밀러 F. D 연구소 5, 6에 의해보고되었다. 이러한 초기 연구는 성인 포유류의 진피 5에서 다 능성 전구 세포 인구를 설명했다. 이러한 세포 -라고 SKPs, 피부 파생 된 전구체는 - 격리와 설치류와 인간의 피부에서 확장하고 뉴런 5와 같은 피부 발견되지 않았다 세포 유형 등 신경과 중배엽 모두 자손,로 분화되었다. 배양 SKPs에 면역 세포 연구는 세포가 피브로넥틴 및 다 능성 줄기 세포 마커 6에 추가 vimentin에와 스틴, 신경과 골격 근육의 전구체로 표현 중간 필라멘트 단백질을 발현 것으로 나타났다. 지금까지 성체 줄기 세포 인구 SKPs 갓 수집 포유류의 피부 생검에서 분리되었다.
ve_content는 "> 최근에, 우리는 설립과 피부 유래 전구 세포의 인구는 피부 생검 7에서 설정된 기본 섬유 아세포 배양에 존재 남아있을 것으로보고있다. 몇 체세포 줄기 세포가 초기 인구 계대에서 차 섬유 아세포 배양에 상주 할 수있는 가정이었다 다음과 같은 관측에 따라 : (1) SKPs 및 기본 섬유 모세포 배양 진피에서 파생 된, 그리고 SKP 세포 따라서 소수의 1 차 피부 섬유 아세포 배양에 존재 남아있을 수 있으며, (2) 주요 섬유 아세포 배양했습니다 냉동 분주에서 성장 7 가능한 남아 세포의 작은 숫자가 포함 된 저장 또는 전송 중에 불리한 온도에 노출.이 드문 세포는 여러 번 확장 및 계대 수있었습니다.이 관찰 제안하는 높은 확산 힘과 스트레스에 대한 저항을 가진 세포의 작은 숫자 인간 섬유 아세포 배양 7 참석했다.우리는 전세계 조직 은행 (그림 1)에서 쉽게 사용할 수있는 기본 섬유 모세포 배양에서 성체 줄기 세포의 빠른 분리를위한 프로토콜을 설정하는 이러한 연구 결과를 이용했습니다. 피부 샘플에 액세스 할 수없는 경우 섬유 아세포 문화의 분자 희귀 유전 질환을 기본 메커니즘뿐만 아니라 모델링 질병을 해부 할 수있는 새로운 기회를 열어, 따라서, 조직 은행에서 구할 수 있지만이 전구 세포의 분리를 허용하는이 방법은 중요한 의미가있다 요리.
Protocol
1. 차 섬유 아세포 배양에서 SKP 분리
- 세포 은행에서 직접 피부 생검에서 얻은 하나 섬유 아세포 배양 섬유 모세포 성장 배지 DMEM 15 % 태아 송아지 혈청, 2 MM의 글루타민, 10 MG / ML 페니실린, 10 MG / ML 스트렙토 마이신을 포함의 문화에 유지됩니다.
인간 섬유 아세포 GMO3349C 및 GMO8398A는 의료 연구를위한 Coriell 연구소 (캠든, NJ)에서 얻은 본 연구에 사용 하였다.
- 인구 계대에서 배양 (PPD가) 20 35 80 %의 confluency에에 SKP 문화를 위해 사용되었다. 한 10cm 조직 문화 접시 (BD 팔콘)는 약 1.5x10 6 셀이 포함되어 있습니다.
- 37 1 시간 2 ML 트립신 용액 (0.25 %, Invitrogen 사) ° C.와 PBS와 부화와 세포를 씻으
- 5 ML PBS와 함께 접시에에서 세포를 수집하고 15 ML 팔콘 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다.
- 24 시간 동안 4 ° C에서 세포를 품어.
- DMEM-F12 3:1 (V / V) 40 NG / ML FGF2 (BD Biosciences는, 20 NG / ML EGF (BD Biosciences의), B27 혈청 보충 2 % (Invitrogen 사), 1 μg으로 구성된 SKP 성장 매체를 준비합니다 / ㎖ Fungizone (Invitrogen 사) 및 25 μm의 / ㎖ 젠타 마이신 (Invitrogen 사).
- 펠릿 5 분 동안 1,200 rpm으로 세포와 4 ML SKP 성장 매체에서 직접 세포 펠렛을 resuspend을. 25cm 2 조직 문화 플라스크 (BD 팔콘)에 세포 현탁액을 전송합니다.
- 37 ° C에서 플라스크 배양하여 3 4 주 동안 매일 구체 형성의 문화를 모니터링합니다.
2. 구 배양 조건
- 37 ° C, 5 % CO 2에서 25cm 2 플라스크 (BD 팔콘)에서 배양 세포.
- 플라스크의 바닥에 부착하는 세포를 방지하기 위해 적극적으로 매일 플라스크를 흔들어. 필요한 경우, 자기편 세포를 분리하고 새 플라스크에 문화를 전송하는 2 ㎖ 멸균 피펫 아래로 피펫.
- 첫 번째 분야는 3t에서 구축 시작오 사일.
- 매체 매 3 일마다의 플라스크 변화의 절반 아래로 분야 침전물을 할 수 있습니다. 성장 인자의 동일한 최종 농도를 유지하려면 갓 준비 SKP 성장 매체에 배 성장 인자를 추가합니다.
- 4 ML 최대 볼륨을 일정하게 유지.
- 분야는 ~ 200mm의 크기에 도달하면 그들은 활발한는 2 ㎖ 피펫 아래로 피펫에 의해 작은 크기로 분야를 세분화하여 계대해야합니다.
- 문화는 2.4 단계)에 설명 된대로 사료 두 25cm 2 플라스크 (BD 팔콘)와 분야 문화로 분할됩니다.
- 분야는 21 일 (16)에 의해 심사 줄기 세포 마커를 수집하고 있습니다.
2.6) 및 2.7)의 절차에 분야의 전파를 설명하는 것은 (1) SKP 매체에 포함 된 영양소와 성장 인자는 각 영역 내의 모든 셀에 액세스 할 수 있습니다 (2) 사전을 사용 SKP 구 문화를 확장 할 수 있습니다.
우리의 세제곱에 따라 일반적으로 구 문화lture 조건은 3 개월 기간을 통해 성장하는 능력을 유지하고 3 - 4 시간 사이 계대 있습니다.
3. 줄기 세포 마커에 대한 면역 세포 화학
- 구 문화는 하루에 16 21에 PBS에 수확된다. 문화는 5 분 1,000 rpm으로 펠렛입니다.
- 분야는 PBS의 작은 볼륨 현탁되어 있습니다.
- 현미경 슬라이드 (피셔 브랜드)에 직경 약 0.5 ㎛의 DAKO 펜으로 두 개의 원을 그립니다.
- 원에 구 현탁액의 50 μl를 추가합니다.
- 각 드롭 분야의 존재를 광학 현미경으로 확인합니다.
- 후드 방울 건조 시키십시오.
- 어느 -80 ° C에서 슬라이드를 정지 또는 immunofluoresence 염색 프로토콜로 진행합니다.
- 면역 염색에 대해, 10 분 -20 ° C에서 미리 냉각 메탄올 (100 %)로 슬라이드를 고정합니다.
- PBS로 슬라이드를 씻으십시오.
- PBS/10 % 태아 소 혈청 / 0.02 % 트리톤의 X100과 함께 슬라이드를 차단최소 1 시간 동안.
- PBS/10 % 4에서 2 상온에서 시간 또는 밤새 FBS ° C. : 버퍼를 차단에 희석 일차 항체 (예 : 안티 스틴, 안티 OCT4, 안티 TG30, 반대로 나노 항체, 표 3)를 품다
- 차단 버퍼로 3 회 세척하고 실온에서 1 시간 동안 차 항체와 함께 배양한다.
- PBS로 버퍼와 3 회를 차단로 3 번 씻으십시오.
- Vectashield 장착 매체 (벡터 주식 회사)와 마운트 슬라이드.
- 면역 형광 현미경으로 줄기 세포 마커의 발현에 대한 샘플을 분석합니다.
4. 줄기 세포 마커의 발현 수준의 실시간 PCR 분석
- 21 일부터 18 약 2-3 ML 구 문화를 가져 가라.
- 펠릿 5 분 동안 1,200 rpm에서 분야와 모든 매체를 대기음.
- RNeasy Minikit (Qiagen의, 발렌시아, CA)를 사용하여 분야에서 RNA를 분리합니다.
- 분광 아가로 오스 겔에 의해 RNA의 순도를 평가합니다. </ 리>
- 템플릿으로 전체 세포 RNA를 사용하여 (Omniscript의 역전사 효소 (Qiagen의)) cDNA를 합성.
- 20 μL의 각 프라이머의 375 nm의 템플릿 50 NG의 농도 전원 SYBR 녹색 PCR Mastermix (적용되는 생물계)에있는 줄기 세포 마커 (표 1 참조)에 대한 실시간-PCR 이용하여 프라이머로 줄기 세포 마커를 검증 반응 볼륨입니다. GAPDH는 내생 컨트롤로 사용됩니다.
- 증폭은 20 초 동안 5 초, 60 ° C에 대한 95 40주기에 따라 2.5 분 ° C에 대해 95에서 초기 변성 ° C를 사용하십시오.
- 2 (ΔΔCT) 메서드를 8로 실행을 분석합니다.
5. 평활근 세포로 직접 분화
- 하루 21 ~ 26 구체 SKP 배지에서 6 잘 배양 접시 (BD 팔콘)로 도금 하였다.
- 세포는 72 시간 동안 SKP 매체 분야에서 준수하고 빨리 성장하는 것이 허용되었다.
- 평활근 세포 (SMCS) differentiat이온은 5 % FBS, 10 NG / ML PDGF-BB (Invitrogen 사), 2.5 ML / NG TGF-B1 (Invitrogen 사)를 포함하는 높은 포도당 Dulbecco의 수정 이글 배지 (Invitrogen 사)로 구성된 SMC 차별화 매체와 매체를 교체하여 시작 시작 .
- 매체는 문화 3-4주의 기간 동안 갓 준비 SMC 분화 배지로 3 일마다 변경되었습니다.
- SMC 마커에 대한 심사는 면역 조직 화학 염색으로 3으로 4 주 후에 시행 하였다.
- 세포는 10 분 동안 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드 용액에 고정 하였다.
- 세포를 PBS는 30 분 동안 0.3 % 트리톤 X-100을 함유 투과 하였다.
- 세포는 실온에서 1 시간 및 추가가 같은 3.15) 3.12에 설명 된 처리)에 대한 αSMA (MO851, DAKO, 1:100) 또는 calponin (M3556, DAKO, 1:100)에 대한 항체와 함께 배양 하였다.
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Representative Results
우리는 우리가 최근 7보고 된 선택적으로 EGF와 FGF2으로 구성된 통제 성장 조건 하에서 SKP 분야를 생성하기 위해 확장 세포의 인구는 기본 피부 섬유 아세포 배양 (그림 1)에 존재하는 것을 보여줍니다.
일반적으로 세포 은행에서 제공하는 기본 섬유 아세포의 변종에 해당하는 PPD가 15 일부터 25 일까지 섬유 아세포 배양 본 연구에 사용 하였다. 이 방법에서 설명하는 24 시간 동안 자양물 고갈과 함께 저온 처리로 구성된 이중 치료에 제출 섬유 아세포 배양 한 것과 유사한 성장 특성을 공유하는 부동 분야를 (또한 배아 몸 EB으로 함)가 포함 재현성 생성 된 문화를 직접 파생 SKPs 이전에 설명 피부 샘플 7, 9에서.
여기에서 우리는 우리가 최근 7보고 한 방법을 사용하는, 우리는 CE의 인구를 분리 표시고립 neurosphere 배양 조건 5, 10, 11을 사용하여 인간과 마우스 진피에서 발견, 다 능성 신경 줄기 / 전구 세포와 유사한 특성을 나타내는 기본 섬유 모세포 배양에서 LLS. 그들은 확장하고 체외에서 3 개월 이상 기간 (방법 섹션을 참조하십시오)에 대한 계대 할 수있는 이러한 기본 인간 섬유 아세포 배양에서 SKP-파생 된 자기 갱신 효능을 보여줍니다. 분야는 문화 18-21일 후 직경 150-200 μM의 크기에 도달하면, 그들은 기계적으로 직경 50 ㎛의 평균으로 나누어 및 SKP 배지에서 현탁 배양에 다시 확장 할 수 있었다. 브로큰 다운 구체들은 200 μM 이전과 같은 방법 섹션에서 설명한 다시 계대중인 도달 할 때까지 성장하는 것이 허용되었다. SKP 분야는 적어도 세 번 계대 수 있습니다. 이 관찰 분야에서 세포가 자기 갱신과 O로 neurosphere 배양 조건에 따라 확장 할 수 있다고 표시기 타 그리고 우리는 5, 7을보고했다.
또한, 섬유 아세포 배양에서 파생 된 이러한 SKP 세포는 신경 능선을 표현하고 비슷하게 피부에서 직접 파생 SKP에뿐만 아니라 배아 줄기 세포 전사 인자 나노와 OCT4와 만능 세포 표면 마커 TG30 (그림 2)와 같은 신경 줄기 세포 마커 스틴, 생검 5, 7, 10. SKP 분야에 대한 면역 조직 화학 염색은 세포질 스틴 긍정적 인 신호를 표시, 10 월 4 구두점 핵 신호를 전시 및 나노은 (그림 2) 더 확산 핵 신호를 보여 주었다. 또한, 만능 인간 배아 줄기 세포 TG30의 세포 표면 마커 SKP 영역 준비 (그림 2)에 긍정적 인 세포질 막 염색을했다. 실시간 PCR을 사용하여, 우리는 또한 문화의 날 (18)에 의해 수집 SKP 분야 (그림 3에서 분리 된 RNA의 준비의 mRNA 인코딩 스틴과 OCT4의 존재를 확인 5,10에서 파생 된 SKPs에 대해보고 다 능성 줄기 세포 마커를 표현 나타냅니다. 또한 섬유 아세포 문화에서 파생 된 SKP의 다 능성을 테스트하기 위해, 우리는 평활근 세포 (그림 4)로 차별화 이러한 세포를 유도. 성장 인자 PDGF-BB와 TGF-B1 12를 포함하는 배지에서 3 주 유도 한 후, 면역 세포는 SMC 마커, αSMA이 SKPs에서 파생 된 SMCS의 calponin (그림 4)의 발현을 확인 하였다.
종합적으로,이 방법 및 결과 1 차 섬유 아세포 배양에서 분리 SKP 분야는 피부 생검에서 파생 된 것과 유사한 특성을 공유하고 인간의 피부 진피 내에 거주 성체 줄기 세포 인구에서 파생해야 보여줍니다.
| 이름 | Entrez의 ID | 프라이머 순서 | amplicon의 |
| GAPDH | 2597 | F-CTC TGC TCC TCC TGT TCG AC | 144 bp의 |
| R-TTA AAA GCA GCC CTG GTG AC | |||
| 스틴 | 10763 | F-GCCCTGACCACTCCAGTTTA | 200 bp의 |
| R-GGAGTCCTGGATTTCCTTCC | |||
| 4 ~ 10 월 | 5460 | F-GAT GGC GTA CTG TGG GCC C | 195 bp의 |
| R-TGG GAC TCC TCC GGG TTT TG |
표 1. 실시간 PCR 및 qPCR에 사용되는 프라이머의 목록입니다.
| 항체 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
| 반 스틴 | Chemicon | MAB5326 | 1 / 100 |
| 안티 OCT4 | abcam | ab19857 | 4백분의 1 |
| 안티 - TG30 | 밀리 포아 | TG30 | 4백분의 1 |
| 안티 - 나노 | abcam | ab21624 | 4백분의 1 |
| 안티 αSMA | DAKO | MO851 | 1 / 100 |
| 안티 Calponin 1 | DAKO | M3556 | 1 / 100 |
| 알렉사 플 루어, 555 당나귀 안티 - 토끼 IgG의 (H + L) | Invitrogen의 | A31572 | 8백분의 1 |
| 알렉사 플 루어, 555 당나귀 안티 - 마우스 IgG의 (H + L) | Invitrogen의 | A31570 | 8백분의 1 |
| 알렉사 플 루어, 488 당나귀 안티 - 마우스 IgG의 (H + L) | Invitrogen의 | A21202 | 8백분의 1 |
| 알렉사 플 루어, 488 당나귀 안티 - 토끼 IgG의 (H + L) | Invitrogen의 | A21206 | 8백분의 1 |
표 3. 항체 근원의 목록입니다.
그림 1. 차 섬유 아세포 배양에서 SKPs의 분리가. 통과 12시 GMO3349C 차 피부 섬유 아세포 배양에서 시작 SKP 구 문화에 대한 방법이 설명되어 있습니다. 일 0 SKP 성장 매체의 시작 fibroblast의 현탁액을 보여줍니다. 하루 4 표시 영역의 형성을 보여줍니다. 하루 17은 일반적인 3D SKP 영역을 보여줍니다. 눈금 막대 : 50mm 지시대로 100 μm의.arge.jpg "대상 ="_blank "> 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 차 섬유 아세포 배양에서 파생 SKP 분야의 면역 염색. 면역 형광 분석은 인간의 기본 섬유 아세포 배양 (GMO3349C)에서 파생 된 SKPs에서 수행. 하루 16 ~ 구체는 현미경 슬라이드에 부착하고 표시된 방지 스틴, 안티 TG30, 안티 OCT4 및 안티 나노 항체로 염색 하였다. 핵은 DNA 얼룩 DAPI (파란색)과 대조 하였다. 스케일 바 :. 20mm는 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 4. 평활근 세포에서 파생 된 기본 섬유 모세포 배양에서 분리 된 SKP 분야에서. 기본 섬유 모세포에서 유래 SKP-구체 평활근 세포 (SMCS)로 분화하도록 지시 하였다. (A) 위상 콘트라스트 이미지는 SMCS 분화 (상단 패널)에 SKP 구 문화에서 다른 문화 단계를 요약표. (B) SKP 분야에서 파생 된 SMCS는 α-스무, 지정된 SMC 마커에 대한 면역 염색했다H 근육의 액틴 (αSMA)와 calponin는 지적했다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
방법을 사용하여 여기에 설명, 순진 피부 줄기 세포는 기본 피부 섬유 아세포 배양에서 분리 할 수 있습니다. 이 방법을 사용하여, 우리는 최근 희귀 유전 증후군, 허친슨 - 길 포드 조로증 증후군 7 명에서 유래 섬유 아세포 배양에서 성체 줄기 세포의 분리 및 특성을보고했다. 로 그 전구체 세포 표현 줄기 세포 마커 자기 갱신 할 수 있으며 (자세한 벤첼 등.에 의해 그림 4 참조, 2012) 섬유 아세포와 평활근 세포 7을 포함한 다양한 세포 계통으로 분화하도록 지시 할 수 있습니다 여기에 표시됩니다. 이 방법은 이전에 포유류의 피부 샘플 10에서 SKPs의 분리에 대해보고하는 방법에 여러 가지 이점을 제공합니다. SKP는 하나 갓 피부 생검이나 이미 존재하는 기본 섬유 모세포 배양에서 설정하는 기본 섬유 모세포 배양에서 분리 할 수 있으며 얻을 수 있습니다세계의 세포 은행.에서 이 새로운 접근 방식은 피부 샘플을 쉽게 사용할 수 없습니다되는 다양한 유전 및 희귀 질환의 병인에 성체 줄기 세포의 의미를 연구 할 수있는 가능성을 제공합니다. 마지막으로이 방법은 성체 줄기 세포 생물학을 탐구하고 생리 및 질병 상태에서 미치는 영향을 해부 할 수있는 기회의 창을 제공합니다. 결론적으로이 방법은 피부 유래 전구 세포를 분리하는 소설과 빠른 방법을 제공합니다.
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Disclosures
우리는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
이 작품은 알렉산더 폰 훔볼트 재단 (5090371), 알레르기 연구 및 교육을위한 크리스틴 KUHNE 센터 (CK-CARE) 및 Bayerischen Staatsministerium (KD까지)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM high glucose | Invitrogen | 31966-047 | |
| DMEM low glucose | Invitrogen | 21885-108 | |
| fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-106 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-024 | Final conc.: 200 mM |
| Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Final conc.: 10 mg/ml /10 mg /ml |
| trypsin solution (0.25%) | Invitrogen | 25200-056 | |
| F-12 Nutrient Mixture (Ham) | Invitrogen | 21765-029 | |
| FGF2 | BD Biosciences | 4114-TC-01M | Final conc.: 40 ng/ml |
| EGF | BD Biosciences | 236-EG-200 | Final conc.: 20 ng/ml |
| PDGFBB | Invitrogen | PHG0043 | Final conc.: 5 ng/ml |
| TGF-b1 | Invitrogen | PHG9204 | Final conc.: 2.5 ng/ml |
| 25 cm2 flask | Omnilab | FALC353109 | |
| PBS w/o CaMg | Invitrogen | 14190-169 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| Methanol | Roth | 8388.2 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Inc. | H-1200 | |
| RNeasy Minikit | Qiagen, Valencia, CA | 74104 | |
| Omniscript Reverse Transcriptase | Qiagen | 205113 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix | BioRad | 172-5201 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | Final conc.:1 mg/ml |
| Table 2. Specific reagents and equipment. | |||
References
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