Summary
Vi rapporterer en metode for å isolere naive multipotent hud-derived forløper (SKP) celler fra primære humane fibroblastkulturer. Vi viser at disse sKPs avledet fra fibroblastkulturer dele lignende stamcelleegenskaper til de som stammer direkte fra menneskelig hud biopsier. Disse cellene uttrykke neural crest markør, nestin, i tillegg til de multipotent markører som OCT4 og Nanog.
Abstract
I løpet av det siste tiåret har flere voksne stamceller populasjoner blitt identifisert i menneskelig hud 1-4. Isolering av multipotent voksne dermal forløpere ble først rapportert av Miller F. D 5 laboratorium, 6. Disse tidlige studiene beskrev en multipotent forløper celle befolkningen fra voksen pattedyr dermis fem. Disse cellene - kalt sKPs, for hud-deriverte forløpere - ble isolert og utvidet fra gnagere og menneskelig hud og differensiert i både nevrale og mesodermal avkom, inkludert celletyper aldri funnet i huden, slik som nevroner fem. Immuncytokjemisk studier på kultiverte sKPs avdekket at cellene uttrykte vimentin og nestin, en mellomliggende filament protein uttrykt i nevrale og skjelettmuskulatur forløpere, i tillegg til fibronectin og multipotent stamcelle markører seks. Inntil nå har de voksne stamceller befolkningen sKPs vært isolert fra ferske innsamlede pattedyr hud biopsier.
ve_content "> Nylig har vi etablert og rapporterte at en befolkning på hud avledet forløper celler kunne være tilstede i grunnskolen fibroblastkulturer etablert fra hud biopsier 7. Antakelsen om at noen somatiske stamceller kan ligge i grunnskolen fibroblastkulturer på tidlige befolkningen doublings var basert på følgende observasjoner: (1) sKPs og primære fibroblastkulturer er utledet fra dermis, og derfor et lite antall SKP celler kan være tilstede i dermale primære fibroblastkulturer og (2) primære fibroblastkulturer dyrket fra frosne alikvoter som har vært utsettes for ugunstig temperatur under lagring eller overføring inneholdt et lite antall celler som forble levedyktige 7.. disse sjeldne cellene var i stand til å utvide seg og kan passeres flere ganger. Denne observasjon antydet at et lite antall celler med høy spredning potens og resistens mot stress var til stede i menneskelige fibroblastkulturer 7.Vi benyttet av disse funnene for å etablere en protokoll for hurtig isolering av voksne stamceller fra primære fibroblastkulturer som er lett tilgjengelig fra vev bredden over hele verden (se figur 1). Denne metoden har viktig betydning som det lar isolering av forløper celler når huden prøver er ikke tilgjengelig mens fibroblastkulturer kan være tilgjengelig fra vev banker, og dermed åpner nye muligheter til å dissekere de molekylære mekanismene bak sjeldne genetiske sykdommer samt modellering sykdommer i en parabolen.
Protocol
En. SKP Isolasjon fra Primær fibroblastkulturer
- Fibroblastkulturer enten fra celle banker eller direkte oppnådd fra hud biopsier blir opprettholdt i kultur i fibroblastvekstfaktor medium DMEM inneholdende 15% føtalt kalveserum, 2 mM glutamin, 10 mg / ml penicillin og 10 mg / ml streptomycin.
Menneskelige fibroblaster GMO3349C og GMO8398A ble innhentet fra Coriell Institute for Medical Research (Camden, New Jersey), og ble brukt i denne studien.
- Kulturer fra befolkningen doublings (PPD) 20-35 ble brukt for SKP kulturer på en confluency på 80%. En 10 cm vev kultur tallerken (BD Falcon) inneholder ca 1.5x10 6 celler.
- Vask cellene med PBS og inkuberes med 2 ml trypsin-oppløsning (0,25%, Invitrogen) i 1 time ved 37 ° C.
- Samle celler fra den plate med 5 ml PBS og overfør cellesuspensjonen til en 15 ml Falcon-røret.
- Inkuber cellene ved 4 ° C i 24 timer.
- Forbered SKP vekstmedium bestående av DMEM-F12, 03:01 (v / v) og 40 ng / ml FGF2 (BD Biosciences, 20 ng / ml EGF (BD Biosciences), B27 serumfritt supplement 2% (Invitrogen), 1 pg / ml Fungizone (Invitrogen) og 25 pm / ml Gentamycin (Invitrogen).
- Pelletere cellene ved 1200 rpm i 5 min og cellepelleten suspenderes direkte i 4 ml SKP vekstmedium. Overfør cellesuspensjonen til en 25 cm2 vevskultur-kolbe (Falcon BD).
- Inkuber kolben ved 37 ° C og overvåke kulturen for sfære formasjon daglig i 3 til 4 uker.
2. Sphere Kultur betingelser
- Dyrke celler i en 25 cm kolbe 2 (BD Falcon) ved 37 ° C, 5% CO2.
- Rist kolben kraftig daglig for å unngå celler til å følge bunnen av kolben. Om nødvendig, pipetter opp og ned med en 2 ml steril pipette for å løsne adherente celler og overføre kulturen til en ny kolbe.
- Første kuler begynner å bygge innen 3 to 4 dager.
- Let sfærer sediment på bunnen av kolben og endring halvparten av mediet etter 3 dager. Å beholde den samme endelig konsentrasjon av vekstfaktorer legge 2X vekstfaktorer til nylaget SKP vekst medium.
- Hold volumet konstant maksimalt 4 ml.
- Når kulene nå en størrelse på ~ 200 mm, skal de passaged ved å bryte ned kulene til mindre størrelse ved kraftig pipettering opp og ned med en 2 ml pipette.
- Kulturen er delt i to 25 cm to kolber (Falcon BD) og sfærer kulturer er mating som beskrevet i trinn 2.4).
- Kulene er samlet for stamcelle markører screening etter dag 16 til 21.
Fremgangsmåten fra 2.6) og 2.7) beskriver forplantningen av kulene til (1) tillater næringsstoffer og vekstfaktorer som inngår i SKP medium for å få tilgang til alle cellene i hver sfære og (2) for å utvide SKP sfære kulturen før bruk.
Vanligvis Sphere kulturer henhold våre cuLTURE betingelser opprettholder evnen til å vokse over en periode på tre måneder, og passeres mellom 3 til 4 ganger.
3. Immunocytokjemi for Stem Cell Markers
- Sphere kulturer er høstet i PBS etter dag 16 til 21. Kulturer er pelletert ved 1000 rpm i 5 min.
- Kulene er resuspendert i et lite volum av PBS.
- Tegn to sirkler med en DAKO penn på ca 0,5 mikrometer i diameter på objektglass (Fisher merke).
- Tilsett 50 pl av sfære suspensjonen i sirkler.
- Sjekk ved lysmikroskopi for tilstedeværelsen av kuler i hver dråpe.
- La dråpene tørke under panseret.
- Enten fryse objektglassene ved -80 ° C eller fortsette med immunofluoresence farging protokollen.
- For immunfluorescens farging, fikse lysbildene med pre-avkjølte Metanol (100%) ved -20 ° C i 10 min.
- Vask lysbildene med PBS.
- Blokker lysbilder med PBS/10% Fetal bovin serum / 0,02% Triton X100i minst 1 time.
- Inkuber med primært antistoff (for eksempel anti-Nestin, anti-Oct4, anti-TG30, anti-Nanog antistoffer, tabell 3) fortynnet i blokkeringsbuffer: PBS/10% FBS i 2 timer ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° C.
- Vask 3 ganger med blokkerende buffer og inkuberes med sekundært antistoff i 1 time ved romtemperatur.
- Vask 3 ganger med blokkerende buffer og tre ganger med PBS.
- Mount lysbilder med Vectashield montering medium (Vector Inc.).
- Analysere prøver for uttrykk for stamcelle markører ved immunfluorescens mikroskopi.
4. Realtime PCR analyse av uttrykk nivåer av Stem Cell Markers
- Ta ca 2-3 ml Sphere kulturer fra dag 18 til 21 land.
- Pellet kulene på 1200 rpm i 5 min og aspirere alle medium.
- Isolere RNA fra kulene ved hjelp av RNeasy Minikit (Qiagen, Valencia, CA).
- Vurdere RNA renhet ved spektrometri og agarosegel. </ Li>
- Syntetisere cDNA (Omniscript revers transkriptase (Qiagen)) ved hjelp av de totale cellulære RNA som mal.
- Validere stamcelle markører av Realtime-PCR med primere for stamcelle markører (vist i tabell 1) i en Power SYBR Grønn PCR Mastermix (Applied Biosystems) med en konsentrasjon på 375 nM av hver primer og 50 ng av mal i en 20 mL reaksjon volum. GAPDH brukes som endogent kontroll.
- For amplifikasjon bruke en initiell denaturering ved 95 ° C i 2,5 min, etterfulgt av 40 sykluser ved 95 ° C i 5 sek og 60 ° C i 20 sek.
- Analyser løp med to (ΔΔCt)-metoden åtte.
5. Regissert Differensiering i glatte muskelceller
- Kuler fra dag 21 til 26 var belagt i seks vel kultur retter (BD Falcon) i SKP medium.
- Celler fikk lov til å overholde og vokse fra kulene i SKP medium for 72 timer.
- Glatte muskelceller (SMCS) differentiation begynte initiert av erstattes mediet med SMC differensiering medium bestående av høy-glucose Dulbeccos modifiserte Eagle medium (Invitrogen) inneholdende 5% FBS, 5 ng / ml PDGF-BB (Invitrogen), og 2,5 ng / ml TGF-B1 (Invitrogen) .
- Medium ble byttet hver 3. dag med nylaget SMC differensiering medium i en periode på 3 til 4 uker i kulturer.
- Screening for SMC markører ble utført etter 3 til 4 uker ved immunhistokjemi.
- Celler ble fiksert med 4% para-formaldehyd-løsning i PBS i 10 min.
- Celler ble permeabilized med PBS inneholdende 0,3% Triton X-100 i 30 min.
- Celler ble inkubert med antistoffer mot αSMA (MO851, Dako, 1:100), eller calponin (M3556, Dako, 1:100) i 1 time ved romtemperatur og bearbeides videre som beskrevet i 3.12) til 3,15).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi viser at en populasjon av celler som selektivt utvider å generere SKP sfærer under kontrollerte vekst tilstand bestående av EGF og FGF2 er til stede i grunn-dermale fibroblastkulturer (figur 1) som vi nylig rapportert 7..
Fibroblastkulturer fra PPD-er 15 til 25 som vanligvis svarer til de primære fibroblaster stammer er tilgjengelige fra celle banker ble brukt i denne studien. Fibroblastkulturer innsendt til dobbel behandling bestående av kald temperatur behandling sammen med nutriment uttømming for 24 timers beskrevet i denne metoden reproduserbart genererte kulturer som inneholder flytende kuler (også omtalt som embryoid kroppen EB) som deler lignende vekst egenskaper som den er beskrevet tidligere for sKPs avledet direkte fra hudprøver 7, 9.
Her viser vi at du bruker den metoden som vi nylig rapportert syv, vi isolere en populasjon av ceLLS fra primære fibroblastkulturer som viser lignende egenskaper til de multipotent nevrale stamceller / forløper celler, isolert og identifisert i human og mus dermis ved hjelp neurosphere kultur vilkår 5, 10, 11. Disse SKP-avledet fra primære humane fibroblastkulturer viser selv-fornyende kraft som de kan utvides og passaged for minst en periode på tre måneder in vitro (se metode kapittel). Når kulene nådde en størrelse på 150 til 200 pm i diameter etter 18 til 21 dager i kultur, ble de mekanisk separert i et gjennomsnitt på 50 mikron i diameter og tillatt å re-ekspandere i suspensjonskultur i medium SKP. Disse brutt ned sfærer ble tillatt å vokse inntil de nådde 200 pM forutgående passaged blir igjen som beskrevet i metode delen. SKP kuler kunne passeres minst tre ganger. Denne observasjonen indikerer at celler i kulene var i stand til å selv fornye og utvide henhold neurosphere kultur forhold som others og vi rapporterte 5, 7.
Videre uttrykkes disse SKP celler avledet fra fibroblastkulturer neural crest og neuron stamcelle markør nestin samt embryonale stamceller transkripsjonsfaktorer Nanog og Oct4 og pluripotent celleoverflate markør TG30 (figur 2), i likhet med SKP avledet direkte fra huden biopsier 5, 7, 10. Immunhistokjemi på SKP kuler indikert nestin positivt signal i cytoplasma, viste 4 oktober en krydres kjernefysisk signal og Nanog viste en mer diffust kjernefysisk signal (figur 2). I tillegg ga den celleoverflate markør av pluripotente humane embryonale stamceller TG30 en positiv cytoplasmisk farging av membranen på SKP sfære preparater (figur 2). Ved hjelp av sanntids PCR, vi også bekreftet tilstedeværelsen av mRNA koding nestin og Oct4 i RNA forberedelse isolert fra SKP kuler samlet etter dag 18 i kultur (figur 3 5,10. For ytterligere å teste multipotency av SKP avledet fra fibroblastkulturer, indusert vi disse cellene til å differensiere til glatte muskelceller (figur 4). Etter 3 uker induksjon i medium som inneholder de vekstfaktorer PDGF-BB og TGF-B1 12, immunocytokjemi bekreftet ekspresjon av SMC markører, αSMA, calponin i SMCS avledet fra disse sKPs (figur 4).
Kollektivt, denne metoden og funnene viser at SKP kuler isolert fra primære fibroblastkulturer dele lignende eiendommer til de avledet fra hud biopsier og skal komme fra en voksen stamcelle befolkningen bosatt i menneskelig hud dermis.
| Navn | Entrez ID | Primer Sequence | Amplicon |
| GAPDH | 2597 | F-CTC TGC TCC TCC TGT TCG AC | 144 bp |
| R-TTA AAA GCA GCC CTG GTG AC | |||
| Nestin | 10763 | F-GCCCTGACCACTCCAGTTTA | 200 bp |
| R-GGAGTCCTGGATTTCCTTCC | |||
| 4-Oct | 5460 | F-GAT GGC GTA CTG TGG GCC C | 195 bp |
| R-TGG GAC TCC TCC GGG TTT TG |
Tabell 1. Liste over primere brukes for sanntids PCR og qPCR.
| Antistoff | Selskapet | Katalognummer | Kommentarer |
| anti-Nestin | Chemicon | MAB5326 | 1/100 |
| anti-Oct4 | Abcam | ab19857 | 1/400 |
| anti-TG30 | Millipore | TG30 | 1/400 |
| anti-Nanog | Abcam | ab21624 | 1/400 |
| anti-αSMA | Dako | MO851 | 1/100 |
| anti-Calponin 1 | Dako | M3556 | 1/100 |
| Alexa Fluor; 555 esel anti-kanin IgG (H + L) | Invitrogen | A31572 | 1/800 |
| Alexa Fluor; 555 esel anti-mus IgG (H + L) | Invitrogen | A31570 | 1/800 |
| Alexa Fluor; 488 esel anti-mus IgG (H + L) | Invitrogen | A21202 | 1/800 |
| Alexa Fluor; 488 esel anti-kanin IgG (H + L) | Invitrogen | A21206 | 1/800 |
Tabell 3. Liste over antistoffer opprinnelse.
Figur 1. Isolering av sKPs fra primære fibroblastkulturer. Metoden for SKP sfære kultur start fra primære dermal fibroblastkulturer GMO3349C ved passering 12 er skissert. Dag 0 viser starter fibroblast suspensjon i SKP vekst medium. Dag 4 viser synlig sfære formasjon. Dag 17 viser en typisk 3D SKP sfære. Målestokk: 50 mm og 100 mikrometer som angitt.arge.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større figur.
Figur 2. Immunfluorescens farging av SKP kuler avledet fra primære fibroblastkulturer. Immunfluorescens analyse utført på sKPs avledet fra humane primære fibroblastkulturer (GMO3349C). Sphere fra dag 16 ble avsatt på objektglass og farget med anti-Nestin, anti-TG30, anti-Oct4 og anti-Nanog antistoffer som angitt. Kjerner ble kontrafarget med en DNA farge DAPI (blå). Scale bar:. 20 mm Klikk her for å se større figur .
Figur 4. Glatte muskelceller-avledet fra SKP kuler isolert fra primære fibroblastkulturer. SKP-kuler som stammer fra primære fibroblaster ble ledet til å differensiere i glatte muskelceller (SMCS). (A) Fase kontrast bildebehandling rekapitulere de ulike kultur skritt fra SKP sfære kultur til SMCS differensiering (øvre panel). (B) SMCS avledet fra SKP kuler ble immunostained for indikerte SMC markører, α-smooth muskel aktin (αSMA) og calponin som angitt. Klikk her for å se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved å anvende fremgangsmåten beskrevet heri, kan naive dermale stamceller bli isolert fra primære fibroblastkulturer dermale. Ved hjelp av denne tilnærmingen, vi nylig rapporterte isolering og karakterisering av voksne stamceller fra fibroblastkulturer stammer fra pasienter med en sjelden genetisk syndrom, Hutchinson-Gilford progeria syndrom 7. Som viser her de forløper celler uttrykker stamcelle markører er i stand til selvfornyelse og kan rettes til å differensiere i ulike cellulære linjene inkludert fibroblaster og glatte muskelceller (se Figur 4 av Wenzel et al., 2012) 7. Denne metode byr på flere fordeler til metoden tidligere rapportert for isolering av sKPs fra mammalske Hudprøvene 10. SKP kan isoleres fra primære fibroblastkulturer som enten nylig etablert fra hud biopsier eller fra primære fibroblastkulturer som allerede eksisterer og kan fåsfra celle banker rundt om i verden. Denne nye tilnærmingen gir mulighet til å studere implikasjon av voksne stamceller i patogenesen av ulike genetiske og sjeldne sykdommer som huden prøver er ikke lett tilgjengelig. Til slutt denne metoden gir en mulighet til å utforske voksen stilk cellebiologi og dissekere deres innvirkning under fysiologiske og sykdomstilstand. Som konklusjon denne tilnærmingen gir en ny og hurtig måte å isolere huden avledet forløper celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Alexander von Humboldt Foundation (5090371), den Christine Kühne Center for Allergy forskning og utdanning (CK-CARE), og Bayerischen Staatsministerium (til KD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM high glucose | Invitrogen | 31966-047 | |
| DMEM low glucose | Invitrogen | 21885-108 | |
| fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-106 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-024 | Final conc.: 200 mM |
| Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Final conc.: 10 mg/ml /10 mg /ml |
| trypsin solution (0.25%) | Invitrogen | 25200-056 | |
| F-12 Nutrient Mixture (Ham) | Invitrogen | 21765-029 | |
| FGF2 | BD Biosciences | 4114-TC-01M | Final conc.: 40 ng/ml |
| EGF | BD Biosciences | 236-EG-200 | Final conc.: 20 ng/ml |
| PDGFBB | Invitrogen | PHG0043 | Final conc.: 5 ng/ml |
| TGF-b1 | Invitrogen | PHG9204 | Final conc.: 2.5 ng/ml |
| 25 cm2 flask | Omnilab | FALC353109 | |
| PBS w/o CaMg | Invitrogen | 14190-169 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| Methanol | Roth | 8388.2 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Inc. | H-1200 | |
| RNeasy Minikit | Qiagen, Valencia, CA | 74104 | |
| Omniscript Reverse Transcriptase | Qiagen | 205113 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix | BioRad | 172-5201 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | Final conc.:1 mg/ml |
| Table 2. Specific reagents and equipment. | |||
References
- Jahoda, C. A., Whitehouse, J., Reynolds, A. J., Hole, N. Hair follicle dermal cells differentiate into adipogenic and osteogenic lineages. Exp. Dermatol. 12, 849 (2003).
- Watt, F. M., Celso, L. o, C,, Silva-Vargas, V. Epidermal stem cells: an update. Curr. Opin. Genet. Dev. 16, 518 (2006).
- Blanpain, C., Horsley, V., Fuchs, E. Epithelial stem cells: turning over new leaves. Cell. 128, 445 (2007).
- Hunt, D. P., Jahoda, C., Chandran, S. Multipotent skin-derived precursors: from biology to clinical translation. Vurr. Opin. Biotechnol. 20, 522 (2009).
- Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat. Cell Biol. 3, 778 (2001).
- Fernandes, K. J. L., et al. A dermal niche for multipotent adult skin-derived precursor cells. Nat. Cell Biol. 6, 1082 (2004).
- Wenzel, V., et al. Naïve adult stem cells from patients with Hutchinson-Gilford progeria syndrome express low levels of progerin in vivo. Bio. Open. 1, (2012).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402 (2001).
- Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. T., Miller, F. D. Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny. Nature Protocol. 1, 2803 (2006).
- Toma, J. G., McKenzie, I., Bagli, D., Miller, F. D. Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin. Stem Cells. 23, 727 (2005).
- Fernandes, K. J., et al. Analysis of the neurogenic potential of multipotent skin-derived precursors. Electrophoresis. 201, 32 (2006).
- Hill, lK. L., et al. Human embryonic stem cell-derived vascular progenitor cells capable of endothelial and smooth muscle cell function. Exp. Hematol. 38, 246 (2010).
