Summary
Apresentamos um método para isolar as células multipotentes ingênuos precursoras da pele derivada (SKP) de culturas de fibroblastos humanos primários. Mostra-se que estas SKPs derivados a partir de culturas de fibroblastos de células estaminais partilham propriedades semelhantes às derivadas directamente a partir de biópsias de pele humana. Estas células expressam o marcador da crista neural, nestina, para além dos marcadores, tais como OCT4 multipotentes e Nanog.
Abstract
Ao longo da última década, várias populações de células estaminais adultas foram identificadas na pele humana 1-4. O isolamento de precursores dérmicos adultas multipotentes foi primeiramente relatada por F. Miller D laboratório 5, 6. Estes estudos iniciais descreveu uma população de células multipotentes precursor do adulto derme mamíferos 5. Estas células - SKPs denominados precursores, para a pele derivadas - foram isoladas e expandidas do roedor e a pele humana e diferenciar-se em progenitura tanto neural e mesodérmica, incluindo os tipos de células nunca encontradas na pele, tais como os neurónios 5. Estudos imunocitoquímicos sobre SKPs revelou que as células cultivadas expressaram vimentina e nestina, uma proteína de filamento intermédia expresso em precursores neurais do músculo esquelético e, em adição à fibronectina e marcadores de células estaminais multipotentes 6. Até agora, as células estaminais adultas SKPs população têm sido isoladas de recém-coletadas biópsias de pele de mamíferos.
ve_content "> Recentemente, nós estabelecemos e informou que uma população de células precursoras derivadas da pele pode permanecer presente em culturas de fibroblastos primários estabelecidos a partir de biópsias de pele 7. A suposição de que algumas células-tronco somáticas pode residir em culturas de fibroblastos primários em duplicações da população início era baseada nas seguintes observações: (1) SKPs e culturas de fibroblastos primários são derivados a partir da derme, e, por conseguinte, um pequeno número de células SKP podem permanecer presentes em culturas de fibroblastos dérmicos primários e (2) culturas de fibroblastos primários cultivados a partir de alíquotas congeladas que foram submetida à temperatura desfavoráveis durante o armazenamento ou transferência continha um pequeno número de células que permaneceram viáveis 7. Estas raras células foram capazes de se expandir e podem ser passadas várias vezes. Tal observação sugeriu que uma pequena quantidade de células com elevada potência a proliferação e a resistência ao stress Encontravam-se presentes em culturas de fibroblastos humanos 7.Aproveitamos estes resultados para estabelecer um protocolo para o rápido isolamento de células-tronco adultas a partir de culturas de fibroblastos primários que estão prontamente disponíveis a partir de bancos de tecidos ao redor do mundo (Figura 1). Este método tem um significado importante, uma vez que permite o isolamento de células precursoras da pele quando as amostras não estão acessíveis ao culturas de fibroblastos podem estar disponíveis a partir de bancos de tecidos, deste modo, abrindo novas possibilidades para dissecar os mecanismos moleculares subjacentes a doenças genéticas raras, bem como doenças de modelação numa prato.
Protocol
1. Isolamento SKP de culturas primárias de fibroblastos
- Culturas de fibroblastos quer a partir de bancos de células ou directamente obtidos a partir de biópsias de pele são mantidas em cultura em meio de crescimento de fibroblastos DMEM contendo 15% de soro fetal de vitelo, glutamina 2 mM, 10 mg / ml de penicilina e 10 mg / ml de estreptomicina.
Fibroblastos humanos e GMO3349C GMO8398A foram obtidos a partir da Coriell Institute for Medical Research (Camden, NJ) e foram usadas neste estudo.
- Culturas de duplicações da população (PPV) de 20 a 35 foram utilizados para culturas de SKP numa confluência de 80%. Um 10 centímetros de tecido prato de cultura (BD Falcon) contém cerca de 1.5x10 6 células.
- Lavar as células com PBS e incubar com 2 ml de solução de tripsina (0,25%, Invitrogen) durante 1 hora a 37 ° C.
- Recolha de células a partir da placa com 5 ml de PBS e transferir a suspensão de células para um tubo Falcon de 15 ml.
- Incubar as células a 4 ° C durante 24 horas.
- Prepara meio de crescimento SKP consistindo de DMEM-F12, 3:1 (v / v) e 40 ng / mL de FGF2 (BD Biosciences, 20 ng / ml de EGF (BD Biosciences), suplemento B27 livre de soro a 2% (Invitrogen), 1 ug / ml de Fungizone (Invitrogen) e 25 mM / ml de gentamicina (Invitrogen).
- Agregar as células a 1.200 rpm durante 5 min e ressuspender o sedimento de células directamente em 4 ml de meio de crescimento SKP. Transferir a suspensão celular para cm a 25 garrafa de cultura de tecidos 2 (BD Falcon).
- Incubar o balão a 37 ° C e monitorar a cultura para a formação da esfera por dia durante 3 a 4 semanas.
2. Esfera Cultura Condições
- Culturas de células em um balão de 2 25 cm (BD Falcon) a 37 ° C, 5% de CO 2.
- Agitar o frasco vigorosamente diariamente para evitar as células a aderir ao fundo do frasco. Se necessário, pipetar para cima e para baixo com uma pipeta de 2 ml estéril para separar as células aderentes e transferir a cultura para um novo frasco.
- Primeiras esferas começar a construir dentro de 3 tØ 4 dias.
- Deixe esferas sedimento no fundo do frasco e a mudança de metade do meio a cada 3 dias. Para manter a mesma concentração final de factores de crescimento 2X adicionar factores de crescimento ao meio de crescimento SKP preparados.
- Manter o volume constante máximo de 4 ml.
- Quando esferas atingir um tamanho de ~ 200 milímetros devem ser passadas por quebrar as esferas de tamanho menor por vigorosa pipetando para cima e para baixo com uma pipeta 2 ml.
- A cultura é dividida em duas 25 centímetros dois frascos (BD Falcon) e as esferas são culturas de alimentação, tal como descrito na etapa 2.4.)
- Spheres são coletadas para marcadores de células-tronco de triagem por dia 16 a 21.
O procedimento de 2,6) e 2,7) descrevem a propagação das esferas para (1) permite que os nutrientes e factores de crescimento em meio de SKP incluídos para aceder a todas as células dentro de cada esfera e (2) a expansão da cultura esfera SKP antes da utilização.
Normalmente culturas Esfera sob os nossos cucondições LTURE manter a capacidade de crescer durante um período de três meses, e são passadas entre 3 a 4 vezes.
3. Imunocitoquímica para marcadores de células-tronco
- Esfera culturas são colhidas em PBS por dia 16 a 21. As culturas são sedimentados a 1000 rpm durante 5 min.
- As esferas são ressuspensas num pequeno volume de PBS.
- Desenhe dois círculos com uma caneta DAKO de cerca de 0,5 m de diâmetro em lâminas de microscópio (marca Fisher).
- Adicionar 50 ml de suspensão esfera para os círculos.
- Verificar por microscopia de luz para a presença de esferas em cada gota.
- Deixe as gotas seca sob o capô.
- Ou congelar as lâminas a -80 ° C, ou continuar com o protocolo de coloração de imunofluorescência.
- Para coloração por imunofluorescência, fixar as lâminas com metanol pré-arrefecido (100%) a -20 ° C durante 10 min.
- Lavar as lâminas com PBS.
- Bloquear os slides com PBS/10% de soro fetal bovino / 0,02% Triton X100durante pelo menos 1 hr.
- Incubar com anticorpo primário (por exemplo, anti-nestina, anti-Oct4, anti-TG30, os anticorpos anti-Nanog, Tabela 3) diluídos em tampão de bloqueio: PBS/10% de SFB durante 2 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.
- Lavar 3 vezes com tampão de bloqueio e incubar com o anticorpo secundário durante 1 h à temperatura ambiente.
- Lavar 3 vezes com tampão de bloqueio e 3 vezes com PBS.
- Monte slides com Vectashield meio de montagem (Vector Inc.).
- Analisar amostras para a expressão de marcadores de células-tronco por meio de microscopia de imunofluorescência.
4. Análise de PCR em tempo real dos níveis de expressão de marcadores de células-tronco
- Tome cerca de 2-3 ml culturas Esfera do dia 18 a 21.
- Pelota das esferas a 1.200 rpm por 5 min e aspirar todas as médias.
- Isolar RNA a partir das esferas usando o Minikit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA).
- Avaliar a pureza por espectrometria de RNA e de gel de agarose. </ Li>
- Sintetizar cDNA (Omniscript transcriptase reversa (Qiagen)) usando o RNA total de celulares como modelo.
- Validar os marcadores de células estaminais por-PCR em tempo real utilizando iniciadores para os marcadores de células estaminais (mostrados na Tabela 1) numa energia Mastermix SYBR Green PCR (Applied Biosystems), com uma concentração de 375 nM de cada iniciador e 50 ng de modelo em 20 ul volume de reacção. GAPDH é usada como controle endógeno.
- Para a amplificação utilizar uma desnaturação inicial a 95 ° C durante 2,5 min, seguido de 40 ciclos a 95 ° C durante 5 sec e 60 ° C durante 20 seg.
- Analisar a corrida com o método 2 8 (ΔΔCt).
5. Diferenciação direcionado para as células musculares lisas
- Esferas do dia 21-26 foram semeadas em placas de cultura de 6 poços (BD Falcon) em meio SKP.
- As células foram deixadas aderir e de superar as esferas SKP em meio durante 72 horas.
- As células musculares lisas (CML) difeião iniciado iniciada por substituiu o meio com meio de diferenciação SMC consistindo de alta concentração de glicose de Eagle Modificado por Dulbecco (Invitrogen) contendo 5% de FBS, 5 ng / ml de PDGF-BB (Invitrogen), e 2,5 ng / ml de TGF-b1 (Invitrogen) .
- O meio foi mudado a cada 3 dias com meio recém-preparado diferenciação SMC durante um período de 3 a 4 semanas de cultura.
- Rastreio de marcadores SMC foi realizada após 3 a 4 semanas de imuno-histoquímica.
- As células foram fixadas com uma solução de paraformaldeído a 4% em PBS durante 10 min.
- As células foram permeabilizadas com PBS contendo 0,3% de Triton X-100 durante 30 min.
- As células foram incubadas com anticorpos contra αSMA (MO851, Dako, 1:100), ou calponina (M3556, Dako, 1:100) durante 1 hora à temperatura ambiente e ainda processados como descrito no 3,12) a 3,15).
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Representative Results
Mostramos que uma população de células que se expandem para selectivamente gerar esferas SKP sob condição de crescimento controlada constituídos por EGF e FGF2 estão presentes em culturas de fibroblastos dérmicos primários (Figura 1), que relatou recentemente 7.
Culturas de fibroblastos de PPV 15-25 que tipicamente correspondem às estirpes de fibroblastos primários disponíveis em bancos de células foram usadas neste estudo. Culturas de fibroblastos submetidos ao tratamento duplo que consiste em tratamento temperatura fria, juntamente com o esgotamento alimento por 24 horas descrito neste método reprodutível culturas geradas contendo esferas flutuantes (também conhecido como EB corpo embryoid) que compartilham características de crescimento semelhantes à descrita anteriormente para SKPs derivadas diretamente a partir de amostras de pele 7, 9.
Aqui nós mostramos que o uso do método que informou recentemente 7, isolamos uma população de cells a partir de culturas de fibroblastos primários que exibem propriedades semelhantes às das células estaminais / progenitoras neurais multipotentes, isolado e identificado na derme humana e de ratinho, utilizando condições de cultura neurosphere 5, 10, 11. Estes SKP-derivado de culturas de fibroblastos humanos primários mostrar auto-renovação potência como elas podem ser expandidas e várias passagens por pelo menos um período de três meses in vitro (consulte a seção do método). Quando as esferas atingiram um tamanho de 150 a 200 um de diâmetro após 18 a 21 dias em cultura, elas foram quebradas mecanicamente para baixo em uma média de 50 um de diâmetro e deixou-se re-expanda em cultura em suspensão em meio de SKP. Essas esferas discriminadas foram autorizados a crescer até que chegou a 200 mM antes de ser passadas novamente como descrito na seção de métodos. SKP esferas podem ser passadas, pelo menos, três vezes. Esta observação indica que as células dentro das esferas eram capazes de auto-renovação e crescer sob as condições de cultura como o neurosphereutros e nós informamos 5, 7.
Além disso, estas células SKP derivadas a partir de culturas de fibroblastos de expresso na crista neural e neurónio marcador nestina células estaminais, bem como a célula estaminal embrionária factores de transcrição Nanog e Oct4 e o marcador de superfície da célula pluripotente TG30 (Figura 2), similarmente ao SKP derivada directamente a partir da pele biópsias de 5, 7, 10. A imuno-histoquímica em SKP esferas indicado sinal positivo nestina no citoplasma, 04 de outubro exibiu um sinal nuclear pontuado e Nanog mostrou um sinal nuclear mais difusa (Figura 2). Além disso, o marcador de pluripotentes estaminais embrionárias humanas células TG30 superfície celular deu uma coloração da membrana citoplasmática positivo sobre preparações esfera SKP (Figura 2). Utilizando PCR em tempo real, que também confirmou a presença de ARNm que codifica nestina e Oct4 na preparação de RNA isolado a partir de esferas SKP recolhidos por 18 dias em cultura (Figura 3 5,10. Para testar ainda a multipotência do SKP derivada a partir de culturas de fibroblastos, que induziram estas células a diferenciar-se em células de músculo liso (Figura 4). Depois de três semanas de indução em meio contendo os factores de crescimento PDGF-BB e TGF-B1 12, imunocitoquímica confirmaram a expressão dos marcadores de SMC, αSMA, calponina nas SMCs derivados destes SKPs (Figura 4).
Colectivamente, este método e os resultados demonstram que as esferas SKP isolados a partir de culturas de fibroblastos primários partilham propriedades semelhantes aos obtidos a partir de biópsias de pele e devem derivar de uma população de células estaminais adultas que residem no interior da derme da pele humana.
| Nome | Entrez ID | Sequence Primer | Amplicon |
| GAPDH | 2597 | F-CTC TGC TCC TCC TGT TCG AC | 144 bp |
| R-TTA AAA GCA GCC CTG GTG AC | |||
| Nestin | 10763 | F-GCCCTGACCACTCCAGTTTA | 200 pb |
| R-GGAGTCCTGGATTTCCTTCC | |||
| 4-Oct | 5460 | F-GAT GGC GTA CTG TGG GCC C | 195 bp |
| R-TGG GAC TCC TCC GGG TTT TG |
Tabela 1. Lista de primers utilizados para a PCR em tempo real e qPCR.
| Anticorpo | Companhia | Número de catálogo | Comentários |
| anti-nestina | Chemicon | MAB5326 | 1/100 |
| anti-Oct4 | Abcam | ab19857 | 1/400 |
| anti-TG30 | Millipore | TG30 | 1/400 |
| anti-Nanog | Abcam | ab21624 | 1/400 |
| anti-αSMA | Dako | MO851 | 1/100 |
| anti-1 calponina | Dako | M3556 | 1/100 |
| Alexa Fluor, 555 de burro anti-IgG de coelho (H + L) | Invitrogen | A31572 | 1/800 |
| Alexa Fluor, 555 de burro anti-IgG de ratinho (H + L) | Invitrogen | A31570 | 1/800 |
| Alexa Fluor, 488 de burro anti-IgG de ratinho (H + L) | Invitrogen | A21202 | 1/800 |
| Alexa Fluor, 488 de burro anti-IgG de coelho (H + L) | Invitrogen | A21206 | 1/800 |
Tabela 3. Lista de origem anticorpos.
Figura 1. Isolamento de SKPs de culturas de fibroblastos primários. Método para a cultura esfera SKP a partir de culturas de fibroblastos dérmicos primários GMO3349C na passagem 12 é descrito. Dia 0 mostra a suspensão de fibroblastos a partir de meio de crescimento SKP. Dia 4 mostra formação esfera visível. Dia 17 mostra uma esfera típica SKP 3D. Barra de escala: 50 mm e 100 mm, tal como indicado.arge.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver a figura maior.
Figura 2. Coloração por imunofluorescência de esferas SKP derivadas a partir de culturas de fibroblastos primários. Análise de imunofluorescência realizadas em SKPs derivadas a partir de culturas primárias de fibroblastos humanos (GMO3349C). Esfera, desde o dia 16 foram depositados em lâminas de microscópio e coradas com anti-nestina, anti-TG30, anti-Oct4 e anticorpos anti-Nanog como indicado. Núcleos foram contrastadas com um DNA mancha DAPI (azul). Barra de escala:. 20 milímetros Clique aqui para ver a figura maior .
Figura 4. As células musculares lisas derivadas de esferas SKP isolados a partir de culturas de fibroblastos primários. SKP-esferas derivadas de fibroblastos primários foram dirigidos a diferenciar-se em células de músculo liso (SMC). (A) imagem de contraste de fase recapitulando as diferentes etapas da cultura a partir da cultura esfera SKP à diferenciação SMC (painel superior). (B) SMCs derivados SKP esferas foram histoquímica para marcadores SMC indicados, α-Smooth muscular actina (αSMA) e calponina conforme indicado. Clique aqui para ver a figura maior .
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Discussion
Usando o método aqui descrito, células estaminais dérmicos virgens podem ser isolados a partir de culturas de fibroblastos dérmicos primários. Usando essa abordagem, que informou recentemente o isolamento e caracterização de células-tronco adultas a partir de culturas de fibroblastos derivados de pacientes com uma síndrome genética rara, Hutchinson-Gilford Progeria Síndrome 7. Como mostrar aqui as precursoras células expressam marcadores de células-tronco são capazes de auto-renovação e pode ser direcionado para se diferenciarem em diferentes linhagens celulares, incluindo fibroblastos e células musculares lisas (consulte a Figura 4 por Wenzel et al., 2012) 7. Este método proporciona várias vantagens para o método previamente relatados para o isolamento de SKPs a partir de amostras de pele de mamífero 10. SKP podem ser isolados a partir de culturas de fibroblastos primários que são quer acabados estabelecidas a partir de biópsias de pele, ou a partir de culturas de fibroblastos primários que já existem, e podem ser obtidosde bancos de células ao redor do mundo. Esta nova abordagem oferece a possibilidade de estudar a implicação de células estaminais adultas na patogénese de diversas doenças genéticas e raro para os quais as amostras de pele não estão prontamente disponíveis. Finalmente, este método fornece uma janela de oportunidade para explorar a biologia de células-tronco adultas e dissecar o seu impacto durante o estado fisiológico e doença. Em conclusão, esta abordagem oferece uma forma inovadora e rápida para isolar células precursoras derivadas da pele.
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Disclosures
Não temos nada a divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Alexander von Humboldt (5090371), a Kühne Centro de Christine de Alergia Pesquisa e Educação (CK-CARE), eo Bayerischen Staatsministerium (para KD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM high glucose | Invitrogen | 31966-047 | |
| DMEM low glucose | Invitrogen | 21885-108 | |
| fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-106 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-024 | Final conc.: 200 mM |
| Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Final conc.: 10 mg/ml /10 mg /ml |
| trypsin solution (0.25%) | Invitrogen | 25200-056 | |
| F-12 Nutrient Mixture (Ham) | Invitrogen | 21765-029 | |
| FGF2 | BD Biosciences | 4114-TC-01M | Final conc.: 40 ng/ml |
| EGF | BD Biosciences | 236-EG-200 | Final conc.: 20 ng/ml |
| PDGFBB | Invitrogen | PHG0043 | Final conc.: 5 ng/ml |
| TGF-b1 | Invitrogen | PHG9204 | Final conc.: 2.5 ng/ml |
| 25 cm2 flask | Omnilab | FALC353109 | |
| PBS w/o CaMg | Invitrogen | 14190-169 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| Methanol | Roth | 8388.2 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Inc. | H-1200 | |
| RNeasy Minikit | Qiagen, Valencia, CA | 74104 | |
| Omniscript Reverse Transcriptase | Qiagen | 205113 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix | BioRad | 172-5201 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | Final conc.:1 mg/ml |
| Table 2. Specific reagents and equipment. | |||
References
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