Summary
Zirkadiane Rhythmen in freiwilliger Rades verlaufenden Aktivität in Säugetieren sind fest an den molekularen Schwingungen einer Hauptuhr im Gehirn verbunden ist. Als solche können diese täglichen Rhythmen im Verhalten verwendet, um den Einfluss von genetischen, pharmakologischen und Umweltfaktoren auf das Funktionieren dieser circadianen Uhr zu studieren.
Abstract
Wenn Nagetieren freien Zugang zu einem Laufrad in ihrem gewohnten Käfig haben, werden freiwilligen Verwendung dieses Rades auf der Tageszeit 1-5 abhängen. Nachtaktiven Nager, darunter Ratten, Hamster und Mäuse sind in der Nacht aktiv und relativ inaktiv während des Tages. Viele andere Verhaltens-und physiologische Messungen zeigen auch Tagesrhythmus, aber bei Nagetieren, dient laufenden Rad-Aktivität als ein besonders zuverlässiges und bequemes Maß der Ausgang des Master zirkadianen Uhr, das suprachiasmatischen Kern (SCN) des Hypothalamus. Im Allgemeinen durch einen Prozess namens Entrainment, wird die tägliche Muster laufen-Rad Aktivität natürlich mit der Umwelt Hell-Dunkel-Zyklus (;: 12 hr-dark zB 12 hr-light LD-Zyklus) auszurichten. Allerdings zirkadianen Rhythmen endogen Mustern im Verhalten, die eine ~ 24 Stunden Zeit zeigen, und in konstanter Dunkelheit andauern generiert. Somit wird in der Abwesenheit eines LD Zyklus können die Aufzeichnung und Analyse der Laufradachse Aktivitätverwendet, um die subjektive Zeit der Tageszeit zu bestimmen. Da diese Rhythmen durch die circadiane Uhr gerichtet sind die subjektive time-of-Tag wird als circadiane Zeit (CT) bezeichnet. Wenn im Gegensatz dazu ein LD-Zyklus vorhanden ist, wird die Zeit der Tageszeit, die von der Umwelt LD Zyklus bestimmt wird als Zeitgeber Zeit (ZT).
Obwohl zirkadianen Rhythmen in Laufradbremsteil Tätigkeit typischerweise mit dem SCN Uhr 6-8 verbunden sind, könnte circadianen Oszillatoren in vielen anderen Regionen des Gehirns und des Körpers 9-14 auch an der Regulation der täglichen Aktivität Rhythmen beteiligt werden. Zum Beispiel müssen Tagesrhythmus in lebensmittelverarbeitenden antizipatorische Aktivität nicht erforderlich, die SCN 15,16 und stattdessen mit Veränderungen in der Aktivität der zusätzlichen SCN-Oszillatoren 17-20 korreliert. Somit kann Laufradachse Aktivität Aufzeichnungen liefern wichtige Verhaltensinformation nicht nur über den Ausgang des Master Clock SCN, sondern auch auf die Aktivität der zusätzlichen SCN-Oszillatoren. Im Folgenden descrIBE die Geräte und Methoden zur Erfassung, Analyse und Darstellung zirkadianen Bewegungsaktivität Rhythmen in Labornagern.
Protocol
Ein. Tierhaltung
- Cage: Um die Laufradbremsteil Aktivität eines individuellen Nager aufnehmen, jeder Käfig sollte ein einzelnes Nagetier und Laufradbremsteil unterzubringen. Da Laufräder kann als eine Form der Bereicherung, sollten alle Nager in keiner Studie haben ähnliche Zugang zu einem Laufrad.
- Bedding Veränderungen: Animal Handling sowie Änderungen in Käfigen oder Bettwäsche haben alle nicht-photic Auswirkungen auf circadiane Rhythmen 21-23, so sind Käfige mit Mesh-Belag ideal, weil sie Kontakt mit dem Tier zu minimieren. Ungeachtet der Verfügbarkeit eines solchen Fach-System, sollten Bettwäsche Veränderungen während der kritischen Phasen eines Experiments vermieden werden. Alternativen umfassen die Verwendung langlebiger Bettzeug, das für weitere seltene Käfig Veränderungen erlauben würde, oder das Ändern Käfige auf einer pseudo-zufälligen Zeitplan.
- Isolation Boxes: Käfige sollten in Isolation Boxen, schallgedämpften, Licht-co sind gehalten werdenntrolled und gut belüftet sein. Je nach Größe und Ausgestaltung der Isolation Boxen, wird die Anzahl von Käfigen in jedem Kasten typischerweise 1-8 liegen. Bei Unterbringung mehrerer Käfige in einem einzigen Isolation Box, sollte man sich bewusst sein, dass verschiedene Gerüche und Geräusche von anderen Tieren können verwirrende Effekte auf das circadiane Verhalten der einzelnen Tiere haben. Um diese Probleme zu vermeiden, sollte man versuchen, ein Käfig pro Isolierbox unterzubringen.
- Ventilation: Angemessene Luftstrom unbedingt machen die Boxen ein komfortables Wohnumfeld für Nager. Der Ventilator in jedem Kasten sollte Kapuze, um Licht von außerhalb des Kastens verhindern vom Erreichen der Innenseite. Auch die Fans in der Regel entfernen, Luft aus der Box und blasen sie in den Raum. Kleine lichtdichte Öffnungen ermöglichen eine Luftzirkulation, um die Trennung Boxen von mehreren Punkten geben und helfen, unangenehme Brise zu vermeiden. Um zu verifizieren, dass es eine ausreichende Belüftung, die Temperatur im Inneren der Isolation Box (wenngeschlossen für mehrere Stunden, mit eingeschalteter Beleuchtung) sollte praktisch identisch mit der Temperatur in dem Raum, in dem es untergebracht ist.
- Beleuchtung: Environmental Lichtintensität sollten die gleichen sein in allen Käfigen. Vereinbaren Sie einen einzigen Licht an einer ähnlichen Stelle übereinander Käfig, und verwenden Sie immer die gleiche Marke / Typ der Glühbirne. Verwenden moderate Beleuchtungsintensität (100-300 Lux) bei Käfig-Ebene. Vermeiden Sie zu hohe Beleuchtungsstärke, die eher direkte Änderungen auf das Verhalten auf die Licht statt des circadianen Systems, per se (zB Maskierung) produzieren.
- Darkness / Dim roter Beleuchtung: Wenn es notwendig zu handhaben oder zu behandeln Tiere im Dunkeln (zB in konstanter Dunkelheit oder Nacht) ist, Nachtsichtgeräte verwendet werden soll. Alternativ, da das circadiane System ist relativ unempfindlich gegenüber der roten Wellenlängen können schwach rot Beleuchtung verwendet werden. Die spezifische rote Licht, das Sie verwenden sollten getestet, um sicherzustellen, dass nicht Alte werdenr Laufradbremsteil Aktivität (zB Maskierung) oder stellen Sie die circadianen Uhr (zB eine Phasenverschiebung).
2. Data Collection (siehe Abbildung 1 - Vitalview Hardware-Konfiguration)
- Laufräder: Der Durchmesser und die Ergonomie des Laufrades wird sich ändern die Menge der Nutzung 24. So verwenden kleinere und leichtere Räder für Mäuse und größeren schwereren Räder für Ratten. Beim Waschen und neu zu installieren Räder, sicherzustellen, dass die Räder in der Lage, freie, nicht "wackeln", und dass die Aufnahme Mikro-Schalter werden von jeder Umdrehung des Rades aktiviert Spin sind.
- Mikroschalter: Jede Umdrehung des Laufrades sollte eine magnetische oder mechanische Mikroschalter zu aktivieren. Informationen aus dem Mikro-Schalter über einen einzigen Kanal übertragen werden und von einem Computer, der die Daten können Behälter über die Zeit (zB alle 2, 5, 6 oder 10 min).
- Computer-Hardware: Unsere Running-Rad-Aufnahmen sind mit Vitalview, eine Hard-und Softwareplattform von Mini Mitter (entwickelt aus http://www.minimitter.com/vitalview_software.cfm ). Es gibt jedoch andere Aufnahme Plattformen wie ClockLab durch Actimetrics (entwickelt http://www.actimetrics.com/ClockLab/ ). Beide Plattformen zusammenbringen Daten aus vielen einkanaligen Quellen (zB ein einzelnes Mikroschalter durch eine einzige Laufrad aktiviert) in einer einzigen Computerdatei. Daten von einzelnen Kanäle können dann grafisch dargestellt und separat zu einem späteren Zeitpunkt analysiert.
3. Daten Recordings
- Files: Die oben genannten Software-Plattformen verwendet zu trennen einzelnen Kanäle, so dass einzelne Dateien für jeden Lauf-Rad-Datensatz erstellt werden. Solche Daten sind am besten visualisiert und grafisch mit speziell designed Programmen wie ActiView (Minimitter, Bend, OR), Circadia oder Clocklab (Actimetrics, Wilmette, IL), die alle produzieren kann Periodogramme und actograms. Allerdings kann Einkanal-Dateien auch geöffnet und analysiert werden mit allgemeinen Tabellenkalkulationsprogramme wie Excel (Microsoft, Redmond, WA).
- Berechnung Circadian Time (CT): CT 12 ist, per Definition, der Beginn der Lauf-Rad-Aktivität in nachtaktiven Nager. Parallel mit dem 24-Stunden-Tag, durch Vereinbarung, ein circadianen Tages in 24 zirkadianen hr gebrochen. Wenn demgemäß die freilaufende circadiane beträgt 24 h 30 min, wie durch die Wand Uhr gemessen wird CT 0 ca. 12 Std. 15 min nach CT12 auftreten.
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Representative Results
- Computerprogramme: Spezialisierte Computerprogramme werden typischerweise bei der Erzeugung von actograms und die Berechnung des zirkadianen Periode verwendet. Diese Programme umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt ActiView (Minimitter, Bend, OR) und Circadia.
- Actograms: Actograms eine grafische Darstellung der täglichen Muster Laufradbremsteil Aktivität. Es gibt Einzel-aufgetragen (x-Achse = 24 Stunden), und doppelklicken aufgetragen (x-Achse = 48 hr) actograms. Beide Methoden Grundstück aufeinander folgenden Tagen von oben nach unten, sondern doppelt aufgetragen actograms Grundstück zwei Tage auf jede horizontale Linie. Insbesondere doppelt aufgetragen actograms zeigen die "zweite Tag" auf der rechten Seite jeder Zeile sowie am Beginn der zweiten horizontalen Zeile, und so weiter. Double-Plotten ist besonders hilfreich, um nicht-24 h Rhythmus zu visualisieren.
- Periodogramm: A Periodogramm aus einer Spektralanalyse des Laufrades Aktivität über die Zeit konstruiert. Periodogramme zeigen die relative power für eine Reihe von voreingestellten Zeiten und werden häufig verwendet, um die freilaufenden Zeitraum zu bestimmen.
- Ergebnisse: In dem Labor, Nagetiere sind in der Regel im Rahmen einer 24-Stunden-LD-Zyklus untergebracht. Unter diesen Bedingungen der Rhythmus der Aktivität ist mitgerissenen, so daß das tägliche Muster des Laufradachse Aktivität mit der präzisen 24 hr LD Zyklus ausgerichtet ist. In 2A, das Doppel-aufgetragen Aktogramm auf der linken Seite zeigt den Lauf-Rad-Aktivität von einer Ratte, die aktiv zur gleichen Zeit wurde jeden Tag, kurz nachdem die ökologischen Lichter ausgeschaltet wurden ausgeschaltet. Das Periodogramm auf der rechten Seite zeigt einen starken Peak bei 24 Stunden, im Einklang mit Mitnahme einer präzisen 24-Stunden-LD-Zyklus. 2B zeigt das Laufrad Verwendung einer Ratte, die in konstanter Dunkelheit untergebracht war. In diesem Fall trat die tägliche Einsetzen der Laufradachse Aktivität geringfügig später jeden Tag, die Schaffung eines nach rechts "Drift". Diese nach rechts "Drift" zeigt an, dass die endogene circadiane Periode größer tha istn 24 Stunden, aber es ist der Höhepunkt in der Periodogramm, die diesen Zeitraum quantifiziert. Gemäß der Periodogramm, wird die maximale Leistung bei 24,33 h beobachtet. Im Gegensatz zu den automatisierten Periodogrammanalyse zeigt Abbildung 3 eine Methode zur manuellen Berechnung der freilaufenden Zeitraum mit dem Zeitpunkt des Beginns der Laufradbremsteil Aktivität. Es ist wichtig zu erkennen, dass die Berechnung des Zeitraums von Hand und Berechnen es mit einem Periodogramm kann leicht unterschiedlichen Ergebnissen führen.
Die täglichen Muster der Laufradachse Aktivität kann auf verschiedene Weise gestört werden. 4 veranschaulicht ein Muster von arrhythmischen laufenden Rad-Aktivität, durch ein elektrolytisches Läsion des SCN hergestellt. Diese Art von Experiment lieferte einige der ersten Anzeichen dafür, dass der SCN den "Master" circadiane Uhr 7,8 enthalten. Das Periodogramm auf der rechten Seite bestätigt diese arrhythmic Muster der Aktivität zeigt äquivalent Low-Power für alle Perioden im circadianen Bereich (20-30 h). Die circadian Muster Laufradbremsteil Nutzung kann auch durch das Gehäuse Ratten in konstantes Licht gestört werden. Abbildung 5 zeigt ein Aktogramm von einer Ratte nacheinander auf mehrere von den Lichtverhältnissen bereits beschrieben ausgesetzt. Zuerst wurde die Ratte in Dauerdunkel untergebracht und zeigte ein Laufrad Aktivitätsrhythmus von etwa 24,33 hr. Zweitens wurde das Umgebungslicht auf gehalten und die Ratte wurde in einem konstanten Licht Umgebung untergebracht. Konstantes Licht ist bekannt, die SCN-basierte Taktgeber stören und produzieren arrhythmischen Muster der Laufradachse Aktivität, ähnlich einer SCN Läsion. Diese Unterbrechung durch Licht tritt jedoch allmählich im Verlauf von 2-3 Wochen. Wenn daher die Laufradachse Datensatz nach den ersten 3 Wochen im konstantes Licht analysiert wird, wird der Periodogramm nicht zu einem Spitzenwert. Schließlich wird in der dritten Phase die Ratte wurde auf eine 12 Stunden ausgedrückt: 12 Stunden-Zyklus und die LD Laufrad Aktivitätsrhythmen erholen fast sofort.
Die Menge an läuft, und die Tageszeit es ocKöter, kann auch durch Umweltfaktoren manipuliert werden. Zum Beispiel, wenn Nagetiere gefastet werden und mit einer zeitlich begrenzten Mahlzeit pro Tag, wird diese eingeschränkte Fütterung Zeitplan zu induzieren einen täglichen Kampf der Lebensmittel-antizipatorische Aktivität. Es wird als "vorausschauende", weil es vor der Ankunft des täglichen Mahlzeit auftritt, und ist besonders augenfällig, wenn das Essen in der Mitte des Tages gegeben wird, eine Zeit, wenn nächtlichen Nagetieren relativ inaktiv sind. Zum Beispiel, wenn ein Versuch stellt eine einzelne Mahlzeit 2 Stunden pro Tag, können die Lebensmittel an den Käfig an ZT 4 (4 h nach Lichter eingeschaltet) hinzugefügt und entfernt werden bei ZT 6 (2 h später). Außerdem ist Drahtgeflecht Bodenbelag in den Käfigen auch vorteilhaft für diese Art von Experiment, weil es unmöglich die Ratten auf Nahrung verstecken und zu speichern für eine spätere, wodurch sichergestellt wird, dass die Ratte tatsächlich verbraucht alle Lebensmittel innerhalb der vorgeschriebenen mealtime macht. Schließlich ist eine der wichtigsten Vorteile von einem genauen Laufradachse Leistungserfassung dass es zur Korrelation ermöglichts zwischen Laufradachse täglichen Aktivität und Oszillationen in der Expression von zirkadianen Uhr Genexpression werden im gesamten Gehirn und Körper. - Häufige Fehlerquellen:
- Viele Software-Plattformen automatisch für Änderungen der Sommerzeit einstellen. Bei der Durchführung eines Experiments zum Zeitpunkt der jährlichen Zeit ändert, sollten Sie diese Option ausgeschaltet ist, in der Recording-Software als auch das Betriebssystem des Computers Software aktiviert. Diese Maßnahme sollte zur Vermeidung von Diskrepanzen zwischen der Aufnahme und dem externen Licht-Zyklus.
- In der Lage sein, auf Unstimmigkeiten in den Daten oder unerwartete Veränderungen im Verhalten zu überprüfen, halten Sie eine Textdatei mit der genauen Uhrzeit und Datum jeder Box Öffnung, Füttern und Tränken, Bettwäsche Veränderungen, experimentelle Manipulationen und andere Störungen, die auftreten könnten. Die genaue Start-und Endzeiten des Datenaufzeichnungsbereichs sollte ebenfalls in dieser Datei zu vermerken.
- Es ist wichtig, regelmäßig zu überprüfen, dass die Lichter ein-und ausschalten eine Wendet die erwarteten Zeiten. Viele Probleme können auftreten, einschließlich Stromausfälle und ausgebrannte Glühbirnen. Einige Lauf-Rad-Plattformen werden mit Licht-Sensoren ausgestattet, aber andere nicht zu überprüfen Lichtverhältnissen.
Abbildung 1. Die Vitalview Hardwarekonfiguration beginnt mit einem Nagetier Laufrad, deren Gestaltung das Mikroschalter mit jeder Umdrehung zu aktivieren. Diese Information wandert dann auf die QA4 Module und ist mit dem Datenanschluss DP24 weitergeleitet und schließlich wird durch die Vitalview ausgestatteten Computer aufgezeichnet. Der Computer bringt running-Radumdrehungen von jedem Kanal alle 10 min; diese Daten können später als Aktogramm oder Periodogramm angesehen werden. Je nachdem, wie die Lichter gesetzt sind, können sie aus der Ferne entweder von der gleichen Vitalview gesteuert werdenAusgestatteten Computer oder durch eine Wand Timer von jedem Elektronik-Geschäft gekauft.
Abbildung 2 Repräsentative actograms und Periodogramme für männliche Wistarratten in einer 12-stündigen untergebracht:. 12 hr LD Zyklus (A) und in konstanter Dunkelheit (B). Double-aufgetragen actograms (linke Spalte) zeigen die Lichtverhältnisse an der Oberseite, 48 h Lauf-Rad-Aktivität entlang der X-Achse und Grundstück aufeinander folgenden Tagen von oben nach unten. Periodogramme (rechte Spalte) führen eine Spektralanalyse an den Laufrad Daten in den actograms veranschaulicht. 1A stellt das Verhalten einer Ratte, die unter einem 24 Stunden-LD-Zyklus untergebracht war. Unter diesen Bedingungen die Ratte wird zur gleichen Zeit jeden Tag aktiv, zeigt eine exakte 24-Stunden-Gipfel im Periodogramm. 1B zeigt das Verhalten einer Ratte, die in konstanter Dunkelheit untergebracht war. Unter thes e Bedingungen die Ratte aktiv war etwas später jeden Tag, damit das rechts Drift in der Aktogramm und 24,33 h Spitze in der Periodogramm.
Abbildung 3. Zeitraum kann auch von Hand extrapoliert werden. Zuerst ziehen Sie eine Linie von auf der Grundlage des täglichen Wirkungseintritt (rote Linie) am besten passen. Weiter berechnet die Steigung in h / Tag, daran erinnern, dass, wenn der Rhythmus ist <24 h die Steigung wird ein negativer Wert sein, und schließlich fügen 24 Stunden. Dieses Verfahren wird eine Schätzung des zirkadianen Zeitraum für dieses Tier. In diesem Fall schlägt 4 hr/10 Tag, dass das Tier aktiv werden etwa 0,4 Stunden später jeden Tag (Steigung 0,4 h / Tag). Daher ist die circadiane Zeitraum etwa 24,4 Stunden (oder etwa 24 Stunden und 24 min). Jede Manipulation, die nach CT geplant ist erfordert die freilaufenden Zeitraum, um eine genaue Vorhersage des CT machen.
Abbildung 4. Electrolytic Läsionen des SCN produzieren arrhythmic Muster Laufradbremsteil Aktivität. In diesem Fall wird die Ratte unter konstanter Dunkelheit untergebracht ist und, weil der "Master" circadiane Uhr wurde lädierten hat, schlägt die Ratte einen endogenen circadianen Rhythmus in Laufradbremsteil Aktivität zeigen. Die auf der rechten Periodogramm bestätigt, dass es keinen signifikanten Rhythmus im circadianen Bereich.
Abbildung 5. Lichtverhältnisse haben starke Auswirkungen auf die Muster der Laufrad-Aktivität. In dieser Platte wird die Ratte zunächst unter konstanter Dunkelheit (DD) untergebracht, wie durch den schraffierten Bereich des Aufzeichnungsträgers bezeichnet. Unter diesem conditiauf, treibt die circadiane Uhr einen circadianen Rhythmus im laufenden Rad-Aktivität mit einer Periode von 24,33 h, durch die Periodogramm (oben rechts). Als nächstes wird die Ratte unter konstantem Licht (LL) untergebracht ist, wie durch den weißen Teil der Aktogramm bezeichnet. Unter dieser Bedingung die endogenen zirkadianen Uhr wird graduell über 2-3 Wochen aufgeschlossen, und wie durch den Periodogramm (Mitte rechts) wird die Ratte arrhythmischen gezeigt. Schließlich wird die normale 12 Stunden: 12 h LD Zyklus wurde wieder eingesetzt und der Lauf-Rad-Aktivität Rhythmus wurde mit einem präzisen 24-Stunden-Rhythmus wieder wie von der Periodogramm (unten rechts).
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Discussion
Überwachung der täglichen Aktivität Rhythmen mit Laufrädern ist das am häufigsten verwendete und zuverlässige Methode für die Beurteilung der Ausgang des Masters circadianen Uhr in nachtaktiven Nager. Rad andauernde Aktivität, jedoch ist nur eine von vielen Aspekten des Verhaltens und Physiologie, die kontinuierlich überwacht werden kann. Obwohl die überwiegende Mehrheit der Laufradbremsteil Aktivität auftritt während der Nacht auftritt, über 30% des gesamten Wachheit während des Tages 25,26. Weitere Endpunkte können verwendet werden, um zirkadianen Rhythmen, einschließlich der allgemeinen Aktivität, Lebensmittel-bin Ansätze, trinken, schlafen, und die Körpertemperatur zu beurteilen. So können je nach der Art der Untersuchung, können Forscher mehrere Rhythmen gleichzeitig aufzunehmen.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Autoren möchten Gehalt Auszeichnungen, Ausrüstung Zuschüsse und operativen Mitteln aus dem Fonds de la recherche en santé Québec (FRSQ), Canadian Institutes of Health Research (CIHR), dem Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) anerkennen, und der Concordia University Research Chairs-Programm (cruc), sowie die durchdachte Feedback zu diesem Manuskript von Dr. Jane Stewart.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vitalview Card & Software | Mini Mitter | #855-0030-00 | (Bend, OR, USA) |
| DP24 Dataport | Mini Mitter | #840-0024-00 | (Bend, OR, USA) |
| QA4-Module | Mini Mitter | #130-0050-00 | (Bend, OR, USA) |
| Magnetic Switch | Mini Mitter | #130-0015-00 | (Bend, OR, USA) |
| C-50 Cable assembly | Mini Mitter | #060-0045-10 | (Bend, OR, USA) |
| Rat running wheel assembly | Mini Mitter | #640-0700-00 | (Bend, OR, USA) |
| Cage and tray support | Mini Mitter | #640-0400-00 | (Bend, OR, USA) |
| Useable cut away cage | Mini Mitter | #664-2154-00 | (Bend, OR, USA) |
| Grid floor for cage | Mini Mitter | #676-2154-00 | (Bend, OR, USA) |
| Waste tray | Mini Mitter | #684-2154-00 | (Bend, OR, USA) |
| Lamp housing | Microlites Scientific | #R-101 | (Toronto, ON, Canada) |
| 4W Fluorescent lamps | Microlites Scientific | #F4T5/CW | (Toronto, ON, Canada) |
| Isolation chambers | Custom built | 28"H x 20"W x 28"D ½" Black Melamine. |
References
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