Summary
哺乳類における自主的なホイールランニング活動の概日リズムはしっかりと脳内のマスタ·クロックの分子振動に結合されている。このように、この動作の生活リズムは、この体内時計の機能に関する遺伝的、薬理学的、および環境要因の影響を研究するために使用することができます。
Abstract
げっ歯類は、ホームケージで実行されているホイールへの無料アクセスを提供していたとき、このホイールの自主的な使用は、一日1-5時間に依存します。ラット、ハムスター、マウスなどの夜行性の齧歯類では、夜の間にアクティブであり、日中は比較的不活性。他の多くの行動や生理的な措置は、生活リズムを示すが、げっ歯類では、実行中の輪活動は視床下部の視交叉上核（SCN）、マスター概日時計の出力は特に信頼性と便利な尺度として役立つ。一般的には、エントレインメントと呼ばれるプロセスを介して、実行中の輪活動の毎日のパターンが自然環境の明暗サイクル（;：12時間-暗例えば 12時間-光LDサイクル）に合わせます。しかし概日リズムは内因性に一定の暗闇の中で〜24時間の期間を示し、持続する行動のパターンを生成されます。このように、LDのサイクルが存在しない場合には、走行輪活動の記録と分析ができます主観的な時間帯を決定するために使用される。これらのリズムが体内時計によって指示されているので、主観的な時刻は概日時間（CT）と呼ばれています。これとは対照的に、LDのサイクルが存在しているとき、環境のLDサイクルによって決定される時刻は、zeitgeberタイム（ZT）と呼ばれています。
走行輪活動の概日リズムは、典型的には、SCNクロック6から8にリンクされているが、脳と身体9-14の他の多くの地域における概日振動子も毎日の活動リズムの調節に関与している可能性があります。例えば、食品先行アクティビティの生活リズムは、SCN 15,16を必要とせず、その代わりに、余分-SCN発振器17から20の活性の変化と相関している。したがって、実行中の輪活動の記録は、マスターSCNクロックの出力についてだけでなく、余分-SCN発振器の活動のみならず重要な行動情報を提供することができる。我々descrを下機器や実験用げっ歯類の概日歩行活動リズムを記録し、分析して表示するために使用されるメソッドをIBE。
Protocol
1。動物ハウジング
- ケージ：個々のげっ歯類の走行輪活動を記録するために、各ケージは単齧歯類とrunning-ホイールを収納する必要があります。走行輪が濃縮の形と考えることができるので、任意の研究ではすべてのげっ歯類では、実行中のホイールに似てアクセスできる必要があります。
- 寝具の変更：彼らは動物との接触を最小限にするため、動物取扱と同様にケージや寝具の変化がすべての概日リズムを21から23に非透光効果を持つことができるので、メッシュ敷きのケージが理想的です。このようなトレイシステムの可用性にもかかわらず、寝具の変更は実験のクリティカルフェーズ中は避けるべきである。選択肢はもっとまれケージの変更を可能にするであろう長持ち寝具、または擬似ランダムなスケジュールで変更ケージを使用する方法があります。
- 隔離ボックス：ケージは光共、音減衰され隔離ボックスに保管してくださいntrolled、した風通しのよい。隔離ボックスのサイズと設定に応じて、各ボックス内のケージの数は、典型的には1から8の範囲であろう。 1つの絶縁ボックスに複数のケージを収容するとき、人は他の動物から来る様々な臭いや音が個々の動物の概日行動上の交絡効果を持つことができることを知っておく必要があります。これらの問題を回避するためには、分離ボックスあたり1ケージを収容するのを試みるべきです。
- 換気：十分に空気の流れは、げっ歯類のための快適な家庭環境ボックスを作るために不可欠です。各ボックス内のファンは内部に到達するボックス外からの光を防ぐために、フード付きでなければなりません。また、ファンは一般的に箱から空気を除去し、部屋に入って、それを爆破する。小さな光を通さない通気孔がいくつかのポイントから隔離ボックスを入力するように空気を可能にし、不快な風を防ぐのに役立ちます。十分な換気、隔離ボックス内の温度が（そこにあることを確認するために、）上のライトで、数時間のため閉鎖、それが収納されている部屋の温度と実質的に同一である必要があります。
- 照明：環境光の強さは、すべてのケージで同じでなければなりません。各ケージ上記と同様の場所にある単一の光をアレンジし、常に同じブランド/電球タイプのものをご使用ください。ケージレベルで適度な強度の照明（100から300ルクス）を使用します。むしろ概日システム、 それ自体 （ 例えばマスキング）よりも光に起因する行動に直接的な変化をもたらす可能性が高い高すぎる照明レベルを控えてください。
- 闇/ DIM赤い照明：それは暗闇の中で動物を（定数暗闇や夜間などで）処理するか、治療する必要がある場合には、暗視ゴーグルを使用する必要があります。概日システムは赤の波長に比較的鈍感であるため、あるいは、薄暗い赤い照明を使用することができます。あなたが使用する特定の赤色光はそれがアルテしないことを確実にするためにテストする必要がありますrは走行輪の活動（ 例えばマスキング）または（ 例えば、位相シフトを生成）体内時計を調整してください。
2。データ収集（図1を参照してください - Vitalviewのハードウェア構成）
- 車輪を実行する：実行中の車輪の直径と人間工学は、使用24の量を変更します。したがって、マウス用の小型·軽量ホイールを使用し、ラットの大きい重いホイール。ホイールを洗浄してから再インストールするときは、車輪は遮るもののない、 "ぐらつき"はありませんし、録音マイクロスイッチは、ホイールの各ターンによって活性化されることをスピンすることができることを確認してください。
- マイクロスイッチ：実行中の車輪の各回転は、磁気的または機械的なマイクロスイッチを有効にする必要があります。マイクロスイッチから得た情報は、単一のチャネルを介して送信することができますし、時間をかけてビンのデータ（ 例えば、すべての2、5,6、または10分）コンピュータによって記録されます。
- コンピュータのハードウェア：当社runningの輪録音はVitalview、ミニマイテル（によって開発されたハードウェアとソフトウェアのプラットフォームで作られていますhttp://www.minimitter.com/vitalview_software.cfm ）。しかし、このようなActimetrics（ClockLabによって開発された、などの他のレコーディング·プラットホームがあるhttp://www.actimetrics.com/ClockLab/は ）。両方のプラットフォームでは、単一のコンピュータのファイルに多くのシングル·チャンネル·ソースからのデータを（ 例えば実行中の1つの車輪によって活性化される単一のマイクロスイッチ）を一緒に持って来る。個々のチャネルからのデータは、その後、グラフ化され、後日、別々に分析することができます。
3。データの録音
- ファイル：上記のソフトウェアプラットフォームは、個々のファイルは、実行中の各輪のレコードに対して作成されるように、単一のチャネルを分離するために使用することができます。このようなデータは特別にdesigneで最高の可視化とグラフ化されそのようなActiview（Minimitter、オレゴン州ベンド）、Circadia、またはすべてのピリオドとactogramsを生成することができますClocklab（Actimetrics、ウィルメット、イリノイ州）などのDプログラム。しかし、シングルチャネルのファイルも開いてこのようなエクセル（マイクロソフト社、レドモンド、ワシントン州）などの一般的な表計算プログラムを用いて分析することができる。
- 概日時間（CT）を計算する：CT 12は、定義によると、夜行性の齧歯類におけるランニングホイール活動の開始です。 24時間の日と並行して、慣例により、1日は24日周期の概日時間に分割されます。サーカディアンフリーランニング期間は壁時計によって測定されるよう24時間30分であればそれに応じて、CT 0 CT12後、約12時間15分を発生します。
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Representative Results
- コンピュータプログラム：専用のコンピュータプログラムは、一般的にactogramsと概日周期の計算の生成に使用されています。これらのプログラムが含まれますが、（Minimitter、オレゴン州ベンド）とCircadia Actiview、これらに限定されない。
- Actograms：Actogramsは、running-ホイール活動の毎日のパターンの写実的な実例を提供します。シングルプロット（x軸= 24時間）とダブルプロット（x軸= 48時間）actogramsがあります。どちらの方法でも、上から下へ順にプロットシーケンシャル日、しかしダブルプロットactogramsプロット各水平ライン上の2日間。具体的には、ダブルプロットactogramsは各行の右端にあるだけでなく、第二の水平行の先頭に "二日目"と表示、というように。ダブルプロットは非24時間のリズムを視覚化するために特に便利です。
- ピリオド：ピリオドグラムは時間をかけて実行しているホイールの活動のスペクトル分析から構築されます。ピリオドは、相対的な捕虜を表示あらかじめ設定された期間の範囲のためのER、とは一般的にフリーランニング期間を決定するために使用されます。
- 結果：研究室では、げっ歯類は、通常24時間LDサイクルの下に収納されている。これらの条件の下での活動のリズムは、走行輪活動の毎日のパターンが正確な24時間LDサイクルと整合するように連行される。 図2Aに 、左のダブルプロットactogramは、環境ライトがオフになった直後に、同時に毎日活発になったラットの走行輪活性を示す。右側のピリオドグラムは正確な24時間LDサイクルに同調と整合性24時間で強いピークを示し、 図2（b）は、一定の闇の中に収容されたラットの走行車輪の使用方法を示しています。この場合、走行輪活動の毎日の発症が右方向に "ドリフト"を作成し、毎日少し後に発生した。この右方向に "ドリフト"は、内因性の概日周期が大きい股関節であることを示し■24時間、それは、この期間を定量化ピリオドグラムのピークです。ピリオドによると、最大電力が24.33時間で観察される。自動化されたピリオドグラム分析とは対照的に、 図3は、手動で実行している輪活動の開始の時間を使って自由継続周期を計算する方法を示す図である。手で期間を計算し、ピリオドとそれを計算すると、わずかに異なる結果をもたらす可能性があることを理解することは重要です。
走行輪活動の毎日のパターンはいくつかの方法で破壊することができる。 図4は、SCNの電解病変によって生成実行輪活動の不整脈のパターンを示している。この種の実験では、SCNが、 "マスター"概日時計7,8が含まれていることを示す最初の証拠の一部を提供した。右側のピリオドは、概日の範囲内のすべての期間（20〜30時間）のための同等の低消費電力を示すことによって、活動のこの不整脈のパターンを確認します。 circadランニングホイール使用のイアンパターンも一定の光の住宅ラットによって破壊することができる。 図5は、既に説明した照明条件のいくつかに順次露光ラットからactogramを示しています。まず、ラットを一定に闇の中に収容されており、約24.33時間のランニングホイール活動リズムを示した。第二に、環境光が上に保持され、ラットは、一定の光環境に収容された。一定の光がSCNベースクロックを破壊し、SCNの病変に類似した走行輪活動の不整脈のパターンを生成することが知られている。光によってこの混乱は、しかし、2〜3週間かけて徐々に発生します。したがって、走行輪レコードが一定の光の中で最初の3週間後に分析されている場合、ピリオドはピークが得られない。最後に、第3段階でラットは12時間に戻されました：12時間LDサイクルと実行されているホイールの活動リズムは、ほぼすぐに回復します。
ランニングの量、一日の時間それOCCURSも、環境要因によって操作することができます。げっ歯類は、絶食と毎日時間的に制限された食事を与えられている場合などに、この制限給餌スケジュールは食物予期活動の毎日の試合を誘導する。それは毎日の食事が到着する前に発生するので、 "先行"と呼ばれ、食事は、一日の途中で夜行性の齧歯類は、比較的非アクティブである時間を与えられている場合に特に明らかである。実験は毎日シングル2時間の食事を提供している場合例えば、、食べ物はZT 4（4時間ライトがオンになった後）にあるケージに追加することができますおよびZT 6（2時間後）で除去。それが不可能なラットは食べ物を隠し、後でのためにそれを保存し、このようにラットが実際に所定の食事時間内のすべての食品を消費していることを保証できるようになりますので、また、ケージ内のワイヤーメッシュ床も、この種の実験のために有利である。最後に、正確な走行輪活動記録の主な利点の一つは、それが相関を可能にすることであるsは、脳や体全体概日時計遺伝子発現の表現で実行されている輪の活動と日常の振動の間で行うことができます。 - 一般的な落とし穴：
- 多くのソフトウェア·プラットフォームは、自動的に時刻の変更を夏時間の調整。毎年時間の変更時に実験を行う場合には、このオプションは録音ソフトだけでなく、コンピュータのオペレーティングシステムソフトウェアでオフになっていることを確認してください。このような安全策は、録音および外部の光サイクルの間の矛盾を回避するために役立つはずです。
- データや行動の予期せぬ変化の矛盾をチェックすることができるように、寝具の変化、実験操作、および発生する可能性のある他の任意の混乱を供給し、水遣り、すべてのボックスの開口部の正確な時刻と日付を記述したテキストファイルを保持します。データ記録の正確な開始時刻と終了時刻は、このファイルにも注意すべきである。
- それはライトがオン·オフされていることを定期的に確認することが重要であるトンと予想倍。多くの問題は、停電の焼損の電球を含め、発生する可能性があります。実行中のいくつかの輪プラットフォームは、光センサーを装備していますが、他のものは、照明条件を確認していません。
図1：Vitalviewのハードウェア構成は、それぞれの革命のマイクロスイッチを作動させるために設計されている齧歯類ランニングホイール、始まります。この情報は、QA4モジュールに移動し、DP24データポートに中継され、最終的にVitalviewを装備したコンピュータによって記録されます。コンピュータが10分ごとに各チャンネルから実行輪回転数を合計し、これらのデータはactogramまたはピリオドとして後で閲覧することができます。ライトが設定されている方法に応じて、それらが同じVitalviewのいずれかによって遠隔制御することができますを装備したコンピュータまたは任意の電気店から購入した壁のタイマーによって。
図2に、12時間内に収容されたWistar系雄性ラットの代表actogramsとピリオド：12時間LDサイクル（A）と定数暗闇の中で（B）である。 actograms（左の列）は、上部に沿ってX軸、プロット上から下へ順次日間に沿って活動輪実行の48時間照明条件を説明ダブルプロット。ピリオドグラム（右列）はactogramsに示す稼働ホイールデータにスペクトル解析を実行します。 図1Aは、24時間LDサイクルで飼育したラットの挙動を示しています。これらの条件下でラットは、ピリオドで正確な24時間のピークを示す、毎日同じ時刻にアクティブになります。 図1Bは、一定の闇の中に収容されたラットの挙動を示しています。テサロニケの下で電子条件はラットは、それゆえ、少し後actogramとピリオドで24.33時間ピークの右方向にドリフト毎日活発であった。
図3。Periodも手で外挿することができる。最初のアクティビティの毎日発症（赤線）に基づいて、最適なフィットのラインを描きます。次に時間/日における傾きを計算し、リズムが<24時間である場合、傾きが負の値になることを覚えて、そして最終的に24時間を追加します。この手順では、その動物のための概日周期の見積もりを提供します。この場合、4 hr/10日は、動物が約0.4時間後に毎日（傾き0.4時間/日）がアクティブになっていることを示唆している。したがって、概日周期は約24.4時間（または約24時間と24分）です。コネチカットに従ってスケジュールされているすべての操作は、CTの正確な予測を行うためのフリーランニング期間を必要とします。
図4 SCNの電解病変は、running-ホイール活動の不整脈のパターンを生成します。 "マスター"概日時計が傷害をされているので、このケースではラットを一定闇と、下に収納されており、ラットは、実行中の輪活動における内因性の概日リズムを示すことに失敗します。右側のピリオドは、概日範囲で有意なリズムがないことを確認します。
図5。照明条件は、ホイールのアクティビティを実行してのパターンに強い影響を及ぼす。このレコードでは、ラットは、最初のレコードの斜線部で示すように、恒暗（DD）の下に収納されている。このconditi下で、概日時計は、ピリオド（右上）で示さ24.33時間周期の実行輪活動の概日リズムを駆動する。 actogramの白い部分で示すように次に、ラットは、定常光（LL）の下に収納されている。この条件では内因性の概日時計は、2〜3週間かけて徐々に破壊される、とのようにラットは不整脈になるピリオド（中央右）で示される。最後に、通常の12時間：12時間LDサイクルが復活したとピリオド（右下）で示すように、走行輪活動リズムは正確な24時間のリズムに合わせて復元されました。
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Discussion
走行輪を使って毎日の活動リズムを監視することは夜行性の齧歯類におけるマスター概日時計の出力を評価するための最も一般的に使用され、信頼性の高い方法です。ホイールランニング活動、しかし、継続的に監視することができる行動や生理機能の多くの側面のひとつに過ぎません。実行中の輪活動の大半は夜間に行われますが、合計覚醒の30％以上が昼25,26中に発生します。他のエンドポイントは、一般的な活動、食品ビンアプローチ、飲酒、睡眠、体温など、概日リズムを評価するために使用することができます。したがって、研究の性質に応じて、研究者は、同時にいくつかのリズムを記録することができる。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
著者らは、デ·ラ·RECHERCHE専用サンテケベック（FRSQ）、カナダ衛生研究所（CIHR）、自然科学やカナダ工学研究会議（NSERC）フォンから給料賞、設備補助金、運転資金を承認したいと思いますコンコルディア大学研究チェアプログラム（CRUC）、ならびに博士ジェーン·スチュワートから本稿で思慮深いフィードバック。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vitalview Card & Software | Mini Mitter | #855-0030-00 | (Bend, OR, USA) |
| DP24 Dataport | Mini Mitter | #840-0024-00 | (Bend, OR, USA) |
| QA4-Module | Mini Mitter | #130-0050-00 | (Bend, OR, USA) |
| Magnetic Switch | Mini Mitter | #130-0015-00 | (Bend, OR, USA) |
| C-50 Cable assembly | Mini Mitter | #060-0045-10 | (Bend, OR, USA) |
| Rat running wheel assembly | Mini Mitter | #640-0700-00 | (Bend, OR, USA) |
| Cage and tray support | Mini Mitter | #640-0400-00 | (Bend, OR, USA) |
| Useable cut away cage | Mini Mitter | #664-2154-00 | (Bend, OR, USA) |
| Grid floor for cage | Mini Mitter | #676-2154-00 | (Bend, OR, USA) |
| Waste tray | Mini Mitter | #684-2154-00 | (Bend, OR, USA) |
| Lamp housing | Microlites Scientific | #R-101 | (Toronto, ON, Canada) |
| 4W Fluorescent lamps | Microlites Scientific | #F4T5/CW | (Toronto, ON, Canada) |
| Isolation chambers | Custom built | 28"H x 20"W x 28"D ½" Black Melamine. |
References
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