Summary
Ritmos circadianos voluntária rodas execução de atividade em mamíferos está intimamente ligado às oscilações moleculares de um relógio mestre no cérebro. Como tal, estes ritmos diários de comportamento pode ser utilizado para estudar a influência dos factores genéticos, farmacológicos e ambientais sobre o funcionamento deste relógio circadiano.
Abstract
Quando os roedores têm acesso livre a uma roda de corrida em sua gaiola, uso voluntário desta roda vai depender da hora do dia 1-5. Roedores noturnos, incluindo ratos, hamsters e ratos, são ativos durante a noite e relativamente inativo durante o dia. Muitas outras medidas comportamentais e fisiológicas também apresentam ritmos diários, mas em roedores, correndo rodas actividade serve como uma medida particularmente fiável e conveniente da saída do relógio circadiano mestre, o núcleo supraquiasmático (SCN) do hipotálamo. De um modo geral, por meio de um processo chamado de arrastamento, o padrão diário de execução rodas actividade irá, naturalmente, se alinham com o ciclo de claro-escuro do ambiente (ciclo LD; por exemplo, 12 horas de luz: 12 h-escuro). No entanto ritmos circadianos são gerados endogenamente padrões de comportamento que apresentam um período de ~ 24 horas, e persistem na escuridão constante. Assim, na ausência de um ciclo LD, a gravação e análise de funcionamento da roda-actividade podeser utilizado para determinar o tempo subjectivo do dia. Porque estes ritmos são dirigidos pelo relógio circadiano no subjectivo da hora do dia, é referido como o tempo circadiano (CT). Em contraste, quando um ciclo LD está presente, a hora do dia, isto é determinado pelo ciclo LD ambiental é chamado o tempo zeitgeber (ZT).
Embora os ritmos circadianos em funcionamento roda-atividade são geralmente ligados ao relógio SCN 6-8, osciladores circadianos em muitas outras regiões do cérebro e do corpo 9-14 também poderiam estar envolvidos na regulação dos ritmos de actividade diária. Por exemplo, ritmos diários de alimentos antecipatória actividade não requerem o SCN 15,16 e em vez disso, estão correlacionadas com alterações na actividade de SCN-extra osciladores 17-20. Assim, as gravações de execução rodas actividade pode fornecer informação comportamental importante, não só sobre a saída do relógio mestre SCN, mas também da actividade de SCN-extra osciladores. Abaixo descrIBE o equipamento e os métodos utilizados para registrar, analisar e exibir ritmos circadianos de atividade locomotora em roedores de laboratório.
Protocol
1. Alojamento dos animais
- Cage: A fim de registrar a atividade corrida rodas de um roedor individual, cada gaiola deve abrigar um roedor e única corrida rodas. Porque rodas de corrida pode ser considerado uma forma de enriquecimento, todos os roedores em qualquer estudo devem ter acesso semelhante a uma roda de corrida.
- Mudanças cama: manejo dos animais, bem como alterações em gaiolas ou roupa de cama todos podem ter não fóticos efeitos sobre os ritmos circadianos 21-23, assim, as gaiolas com malha de piso são ideais porque eles minimizar o contato com o animal. Não obstante a disponibilidade de tal uma bandeja de sistema, mudanças cama devem ser evitados durante fases críticas de um experimento. As alternativas incluem uso da cama mais duradouro, o que permitiria mais mudanças gaiola pouco frequentes, ou gaiolas de mudança em uma programação pseudo-aleatório.
- Caixas de isolamento: gaiolas devem ser guardados em caixas de isolamento de som que são atenuadas, luz co-ntrolled, e bem ventilado. Dependendo do tamanho e configuração das caixas de isolamento, o número de gaiolas dentro de cada caixa variará tipicamente de 1-8. Quando abrigando várias gaiolas em uma caixa de isolamento único, um deve estar ciente de que vários odores e sons vindos de outros animais pode ter efeitos de confusão sobre o comportamento circadiano de animais individuais. Para evitar esses problemas, deve-se tentar abrigar uma gaiola por caixa de isolamento.
- Ventilação: fluxo de ar adequado é fundamental para fazer as caixas de um ambiente confortável casa para roedores. O ventilador em cada caixa deve ser coberto, de modo a evitar que a luz de fora da área de atingir o interior. Além disso, os fãs vão tipicamente retirar o ar da caixa e explodi-lo para o quarto. Pequenas à prova de luz aberturas permitem a entrada de ar nas caixas de isolamento a partir de vários pontos, e ajuda a evitar brisas desconfortáveis. A fim de verificar se há ventilação adequada, a temperatura no interior da caixa de isolamento (quandofechado, durante várias horas, com as luzes acesas) deve ser virtualmente idêntico ao da temperatura da sala em que está inserido.
- Iluminação: a intensidade da luz ambiente deve ser o mesmo em todas as jaulas. Organizar uma única luz em um local semelhante acima de cada gaiola, e use sempre a mesma marca / tipo de lâmpada. Use iluminação de intensidade moderada (100-300 lux) ao nível gaiola. Evite níveis de iluminação excessivamente altas, que são mais susceptíveis de produzir alterações diretas sobre o comportamento atribuíveis à luz em vez de o sistema circadiano, per se (máscara, por exemplo).
- Escuridão / luz vermelha ofuscante: Se é necessário para tratar ou tratar os animais no escuro (por exemplo, na escuridão constante ou noturno), óculos de visão noturna deve ser usado. Alternativamente, porque o sistema circadiano é relativamente insensível ao vermelho-comprimentos de onda, a iluminação vermelha fraca pode ser usado. A luz vermelha específica que você usa deve ser testado para garantir que ele não Alter actividade corrida rodas (mascaramento, por exemplo) ou ajustar o relógio circadiano (por exemplo, produzir uma mudança de fase).
2. Coleta de dados (veja a Figura 1 - Vitalview configuração de hardware)
- Correndo rodas: o diâmetro ea ergonomia da roda de corrida irá mudar a quantidade de uso de 24. Assim, o uso rodas menores e mais leves para ratos, e maiores rodas mais pesadas para ratos. Ao lavar e re-instalar rodas, assegurar que as rodas são capazes de girar sem obstáculos, não "cambalear", e que a gravação micro-interruptores são ativados por cada volta da roda.
- Micro-chaves: cada revolução da roda de corrida deve ativar um magnético ou mecânico micro-interruptor. Informações do micro-interruptor é transmitido através de um canal único e registadas por um computador que pode bin os dados ao longo do tempo (por exemplo, a cada 2, 5, 6, ou 10 minutos).
- Hardware do computador: Nossa running rodas gravações são feitas com Vitalview, uma plataforma de hardware e software desenvolvido pela Mini Mitter ( http://www.minimitter.com/vitalview_software.cfm ). No entanto, existem outras plataformas de gravação, tais como ClockLab, desenvolvido pela Actimetrics ( http://www.actimetrics.com/ClockLab/ ). Ambas as plataformas reunir dados de várias fontes de canal único (por exemplo, um micro-interruptor único ativado por uma única roda em execução) em um arquivo único computador. Os dados de canais individuais pode então ser representada e analisada separadamente numa data posterior.
3. Gravações de dados
- Arquivos: As plataformas de software acima mencionados podem ser usados para separar canais únicos para que os arquivos individuais são criados para cada registro de funcionamento da roda. Esses dados são melhor visualizados e gráficos com especial designeprogramas tais como d ActiView (Minimitter, Bend, OR), Circadia ou Clocklab (Actimetrics, Wilmette, IL), que podem produzir e periodogramas actograms. No entanto, canal único arquivos também podem ser abertos e analisados utilizando programas de planilhas gerais, tais como Excel (Microsoft, Redmond, WA).
- Calculando Tempo Circadiano (TC): CT 12 é, por definição, o início da execução da roda-actividade em roedores noturnos. Em paralelo com o dia 24 hr, por convenção, um dia circadiano é dividido em 24 hr circadiano. Por conseguinte, se o período de funcionamento livre circadiano é 24 hr 30 min, medido pelo relógio de parede, CT 0 ocorrerá aproximadamente 12 h 15 min, depois CT12.
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Representative Results
- Programas de computador: programas de computador especializados são normalmente utilizados na geração de actograms e do cálculo do período circadiano. Estes programas incluem, mas não estão limitados a, ActiView (Minimitter, Bend, OR) e Circadia.
- Actograms: Actograms fornecer uma ilustração gráfica dos padrões diários de funcionamento da roda-actividade. Há um único traçado (eixo x = 24 h) e duplo traçado (eixo x = 48 h) actograms. Ambos os métodos dias enredo seqüenciais de cima para baixo, mas de duplo enredo traçado actograms dois dias em cada linha horizontal. Especificamente, duas vezes plotados actograms mostrar o "segundo dia" na extremidade direita de cada linha, assim como no início da segunda linha horizontal, e assim por diante. Double-plotagem é especialmente útil para visualizar ritmos não-24 hr.
- Periodograma: Um periodograma é construído a partir de uma análise espectral da atividade de roda correndo ao longo do tempo. Periodogramas mostrar a relação power para uma série de períodos pré-definidos, e são comumente usados para determinar o período de free-running.
- Resultados: No laboratório, os roedores são normalmente alojados sob um ciclo de 24 horas LD. Sob estas condições, o ritmo de actividade é arrastada, de modo que o perfil diário de funcionamento da roda-actividade é alinhado com o ciclo de 24 horas LD preciso. Na Figura 2A, o duplo-plotados actogram à esquerda mostra a atividade de corrida rodas de um rato que se tornaram ativos ao mesmo tempo, a cada dia, logo após as luzes ambientais foram desligados. O periodograma à direita mostra um forte pico às 24 horas, de acordo com o arrastamento de um ciclo de 24 horas precisa LD. Figura 2B ilustra o uso roda de corrida de um rato que foi alojado na escuridão constante. Neste caso, o início de funcionamento diário rodas actividade foi ligeiramente mais tarde, cada dia, a criação de um "drift" para a direita. Esse "desvio" para a direita indica que o período circadiano endógeno é maior than 24 horas, mas é o pico no periodograma que quantifica este período. De acordo com o periodograma, a potência máxima é observada a 24,33 hr. Em contraste com a análise periodograma automatizado, a Figura 3 ilustra um método para calcular manualmente o período de funcionamento livre usando o tempo de início de funcionamento da roda-actividade. É importante perceber que o cálculo do período com a mão e calculando-a com um periodograma podem originar resultados ligeiramente diferentes.
Os padrões diários de funcionamento da roda-actividade podem ser rompidas de vários modos. Figura 4 ilustra um padrão de execução arrítmico rodas actividade, produzida por uma lesão electrolítica do SCN. Este tipo de experimento forneceu algumas das primeiras evidências de que o SCN continha o "mestre" relógio circadiano 7,8. O periodograma à direita confirma este padrão arrítmico de atividade, mostrando potência equivalente baixo para todos os períodos na faixa circadiano (20-30 h). O circadian padrão de funcionamento da roda de utilização pode também ser interrompido por ratos habitação em luz constante. Figura 5 mostra um actogram de um rato exposta sequencialmente a várias das condições de iluminação já descritos. Em primeiro lugar, o rato foi alojado na escuridão constante e exibiu uma actividade de corrida roda ritmo de cerca de 24,33 h. Em segundo lugar, a luz ambiente e manteve-se em o rato foi alojado num ambiente de luz constante. Luz constante é conhecida por perturbar o relógio SCN-based e produzem padrões arrítmicos de funcionamento da roda-actividade, semelhante a uma lesão SCN. Esta interrupção pela luz, no entanto, ocorre gradualmente ao longo de 2-3 semanas. Portanto, quando o registo de funcionamento da roda é analisado após as primeiras 3 semanas de luz constante, a periodograma não produzir um pico. Finalmente, na terceira fase, o rato foi colocado de volta em uma hora 12: 12 horas ciclo LD e os ritmos de atividade que executam rodas recuperar quase imediatamente.
A quantidade de correr, e o tempo do dia em que occurs, também pode ser manipulado por factores ambientais. Por exemplo, se os roedores são jejuaram e dada uma refeição temporalmente restrita cada dia, este esquema de alimentação restrita irá induzir um ataque diário de alimentos, actividade antecipatória. Ele é chamado de "antecipação" porque ocorre antes da chegada da refeição diária, e é especialmente evidente quando a refeição é dada no meio do dia, um momento em que os roedores noturnos são relativamente inactivos. Por exemplo, se uma experiência fornece uma refeição única de 2 horas cada dia, o alimento pode ser adicionado ao da gaiola de ZT 4 (4 hr após luzes acesas) e removida a ZT 6 (2 horas depois). Além disso, o revestimento de malha de arame nas gaiolas também é vantajosa para este tipo de experiência, porque faz com que seja impossível para os ratos de esconder alimentos e armazená-las para posterior, assegurando assim que o rato é realmente consumir todo o alimento dentro do mealtime prescrito. Finalmente, uma das principais vantagens de uma gravação de actividade exacta funcionamento da roda, é que ela permite a correlaçãos para ser feita entre o funcionamento da roda de atividade e oscilações diárias na expressão do gene do relógio circadiano expressão através do cérebro e do corpo. - Problemas comuns:
- Muitas plataformas de software ajustar automaticamente para horário de verão mudanças do tempo. Ao realizar uma experiência no momento de mudanças de tempo anuais, ter certeza que esta opção está desativada no software de gravação, bem como o computador o software do sistema operacional. Esta salvaguarda deve ajudar a evitar discrepâncias entre a gravação eo ciclo de luz externa.
- Para ser capaz de verificar as discrepâncias nos dados ou alterações inesperadas no comportamento, manter um arquivo de texto com o tempo preciso e data de cada abertura de caixa, alimentação e abeberamento, mudanças de cama, manipulações experimentais, e qualquer interrupção outro que possa ocorrer. O início preciso e término da gravação de dados também deve ser observado neste arquivo.
- É importante verificar regularmente que as luzes se ligar e desligar umt os tempos esperados. Muitos problemas podem ocorrer, incluindo quedas de energia e queimado lâmpadas. Algumas plataformas de corrida rodas estão equipados com luz-sensores, mas os outros não verificar as condições de iluminação.
Figura 1. A configuração de hardware Vitalview começa com uma roda de roedor em execução, o qual é desenhado para activar uma micro-interruptor com cada revolução. Esta informação, em seguida, viaja para os QA4 módulos e é retransmitida para o dataport DP24 e, finalmente, é registrado pelo computador Vitalview equipado. O computador executando resume rodas rotações de cada canal a cada 10 min, estes dados podem ser vistos mais tarde como um actogram ou periodograma. Dependendo de como as luzes são criados, eles podem ser controlados remotamente, quer pela Vitalview mesmoComputador equipado ou por temporizadores parede comprados em qualquer loja de eletrônicos.
Figura 2 representativos e actograms periodogramas de ratos Wistar machos alojados em um hr 12:. Ciclo LD de 12 horas (A) e no escuro constante (B). Duplo plotados actograms (coluna da esquerda) ilustram as condições de iluminação ao longo da parte superior, 48 hr de correr rodas atividade ao longo do eixo X, e dias enredo seqüenciais de cima para baixo. Periodogramas (coluna da direita) realizar uma análise de espectro sobre os dados da roda de funcionamento ilustrados nas actograms. Figura 1A ilustra o comportamento de um rato que foi alojados sob um ciclo de 24 horas LD. Sob estas condições, o rato torna-se activo, ao mesmo tempo cada dia, mostrando um pico exacto hr 24 no periodograma. Figura 1B ilustra o comportamento de um rato que foi alojado na escuridão constante. Sob thes condições Ê O rato foi ativo um pouco mais tarde a cada dia, portanto, deriva da direita na actogram e 24,33 horas de pico no periodograma.
Período Figura 3. Também pode ser extrapolada com a mão. Primeiro desenhe uma linha de melhor ajuste com base no início diária de atividade (linha vermelha). Em seguida calcular a inclinação em h / dia, lembre-se que, se o ritmo for <24 horas a rampa será um valor negativo, e, finalmente, adicionar 24 hr. Este procedimento irá proporcionar uma estimativa do período circadiano para o animal. Neste caso, 4 dias hr/10 sugere que o animal está a tornar-se activo cerca de 0,4 horas mais tarde todos os dias (declive 0,4 hr / dia). Por conseguinte, o período circadiano é aproximadamente 24,4 horas (ou cerca de 24 horas e 24 min.) Qualquer manipulação que está programado de acordo com a CT exige o período de free-running para fazer uma previsão precisa do CT.
Figura 4. Lesões eletrolíticos do SCN vai produzir padrões rítmicos do funcionamento da roda-atividade. Neste caso, o rato está alojado na escuridão constante e, porque o "mestre" relógio circadiano foi lesionada, o rato não mostra um ritmo circadiano endógeno em funcionamento rodas atividade. O periodograma à direita confirma que não existe qualquer ritmo significante na gama circadiano.
As condições de iluminação Figura 5. Ter fortes efeitos sobre os padrões de funcionamento de atividade roda. Neste disco, o rato é inicialmente alojados em constante escuridão (DD), como indicado pela parte sombreada do registro. Sob esta conditi, o relógio circadiano dirige um ritmo circadiano na execução de roda de atividade com um período de 24,33 h, mostrado pelo periodograma (canto superior direito). Em seguida, o rato é alojado sob luz constante (LL), tal como indicado pela parte branca da actogram. Sob esta condição, o relógio circadiano endógeno é interrompido gradualmente ao longo de 2-3 semanas, e como é mostrado pela periodograma (média direita) o rato torna-se arrítmico. Finalmente, a 12 hr normal: 12 h ciclo LD foi restabelecida eo ritmo de atividade em execução rodas foi restaurado com um ritmo preciso 24 horas como mostra o periodograma (canto inferior direito).
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Discussion
Monitoramento ritmos de actividade diária usando rodas de corrida é o método mais utilizado e confiável para avaliar a saída do relógio circadiano mestre em roedores noturnos. Roda de rodagem de actividade, no entanto, é apenas um dos muitos aspectos do comportamento e fisiologia que pode ser monitorado continuamente. Embora a grande maioria de corrida rodas actividade ocorre durante a noite, ao longo de 30% do total de vigília ocorre durante o dia 25,26. Outros parâmetros podem ser usados para avaliar os ritmos circadianos, incluindo gerais de atividade, alimento-bin abordagens, bebidas, sono e temperatura corporal. Assim, dependendo da natureza do estudo, os investigadores podem gravar vários ritmos simultaneamente.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer prêmios salariais, subsídios de equipamentos e fundos operacionais das Fonds de la recherche en santé Québec (FRSQ), Canadian Institutes of Health Research (CIHR), Ciências Naturais e Pesquisa de Engenharia Council of Canada (NSERC), e da Concordia University Program Research Chairs (Cruc), bem como o feedback pensativo sobre este manuscrito do Dr. Jane Stewart.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vitalview Card & Software | Mini Mitter | #855-0030-00 | (Bend, OR, USA) |
| DP24 Dataport | Mini Mitter | #840-0024-00 | (Bend, OR, USA) |
| QA4-Module | Mini Mitter | #130-0050-00 | (Bend, OR, USA) |
| Magnetic Switch | Mini Mitter | #130-0015-00 | (Bend, OR, USA) |
| C-50 Cable assembly | Mini Mitter | #060-0045-10 | (Bend, OR, USA) |
| Rat running wheel assembly | Mini Mitter | #640-0700-00 | (Bend, OR, USA) |
| Cage and tray support | Mini Mitter | #640-0400-00 | (Bend, OR, USA) |
| Useable cut away cage | Mini Mitter | #664-2154-00 | (Bend, OR, USA) |
| Grid floor for cage | Mini Mitter | #676-2154-00 | (Bend, OR, USA) |
| Waste tray | Mini Mitter | #684-2154-00 | (Bend, OR, USA) |
| Lamp housing | Microlites Scientific | #R-101 | (Toronto, ON, Canada) |
| 4W Fluorescent lamps | Microlites Scientific | #F4T5/CW | (Toronto, ON, Canada) |
| Isolation chambers | Custom built | 28"H x 20"W x 28"D ½" Black Melamine. |
References
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