Summary
Dygnsrytmen i frivillig hjul-running aktivitet i däggdjur är tätt kopplade till de molekylära svängningar hos en huvudklocka i hjärnan. Som sådana kan dessa dagliga rytmer i beteende kan användas för att studera inverkan av genetiska, farmakologiska och miljömässiga faktorer på hur detta dygnsrytm klocka.
Abstract
När gnagare har fri tillgång till en löpande hjul i deras hem bur, kommer frivillig användning av detta hjul beroende på vilken tid på dagen 1-5. Nattliga gnagare, däribland råttor, hamstrar och möss, är aktiva under natten och relativt inaktiva under dagen. Många andra beteendemässiga och fysiologiska åtgärder uppvisar också dygnsrytm, men i gnagare, serverar kör-hjul verksamhet som särskilt pålitlig och bekväm mått på produktionen av befälhavaren dygnsrytm klocka, den suprachiasmatiska kärnan (SCN) i hypothalamus. I allmänhet genom en process som kallas ångan, kommer den dagliga mönstret att köra hjul aktivitet anpassa naturligt med miljö ljus-mörkercykel (LD cykel, t.ex. 12 hr-ljus: 12 h-mörker). Men dygnsrytm är endogent genererade mönster i beteende som uppvisar en ~ 24 timmarsperiod, och kvarstår i ständigt mörker. Således, i avsaknad av en LD cykel, registrering och analys av drift-hjul aktivitet kananvändas för att bestämma den subjektiva tiden av dagen. Eftersom dessa rytmer styrs av den cirkadiska klockan engelska tid-på-dagen kallas den cirkadiska tid (CT). Däremot när en LD cykel är närvarande tid av dagen som bestäms av miljön LD cykeln kallas zeitgeber tid (ZT).
Även dygnsrytmen i kör-hjul aktivitet vanligtvis kopplade till SCN klockan 6-8, kan dygnsrytm oscillatorer i många andra delar av hjärnan och kroppen 9-14 också vara inblandade i regleringen av daglig verksamhet rytmer. Till exempel kräver dagliga rytmer i livsmedel föregripande verksamhet inte SCN 15,16 och i stället är korrelerade med förändringar i aktiviteten av extra SCN oscillatorer 17-20. Således kan köra-wheel aktivitet inspelningar ge viktig beteendemässiga information inte bara om utgången av befälhavaren SCN klockan, men även på aktiviteten av extra-SCN oscillatorer. Nedan vi descrIBE utrustning och metoder som används för att registrera, analysera och visa dygnsrytm rörelseaktivitet rytmer i smågnagare.
Protocol
1. Djurstallar
- Cage: För att spela in driften hjul aktivitet av en individuell gnagare bör varje bur hysa en enda gnagare och inkörning hjulet. Eftersom löphjulen kan betraktas som en form av berikning, bör alla gnagare i någon studie har liknande tillgång till en löpande hjul.
- Sängkläder förändringar: djurhantering samt förändringar i burar eller strö alla kan ha icke-fotiska effekter på dygnsrytmen 21-23, så burar med nät-golv är idealiska eftersom de minimerar kontakt med djuret. Trots att det finns ett sådant fack-systemet skall sängkläder ändras undvikas under kritiska faser av ett experiment. Alternativ inkluderar användning långvarig sängkläder, vilket skulle möjliggöra mer sällan bur eller bytt burar på en pseudo-slumpmässig schema.
- Isolering Lådor: ska Burar hållas isolerade lådor som är ljud-dämpad, ljus-controlled och väl ventilerad. Beroende på storleken och utformningen av isolering rutorna, kommer antalet burar i varje låda sträcker sig typiskt från 1-8. När bostäder flera burar i en enda isolering låda, bör man vara medveten om att olika lukter och ljud från andra djur kan ha störande effekter på dygnsrytm beteende enskilda djur. För att undvika dessa problem bör man försöka att hysa en bur per isolering låda.
- Ventilation: tillräckligt luftflöde är absolut nödvändigt att göra lådorna ett bekvämt hem miljö för gnagare. Fläkten i varje låda bör vara maskerade, för att förhindra ljus från utanför boxen från att nå insidan. Dessutom kommer fansen bort typiskt luft från lådan och blåser in i rummet. Små ljustät kanaler kan luft komma in i isolering lådor från flera punkter, och hjälpa till att undvika obehagliga vindar. För att kontrollera att det finns tillräcklig ventilation, temperaturen inuti isoleringen rutan (närstängd under flera timmar, med lampor på) bör vara praktiskt taget identisk med temperaturen i rummet där den är inrymd.
- Ljussättning: Miljö ljusintensiteten bör vara densamma i alla burar. Ordna en enda ljus vid en liknande plats ovanför varje bur, och använd alltid samma märke / typ av lampa. Använd måttlig intensitet belysning (100-300 lux) på buren nivå. Undvika överdrivet höga belysningsnivåer, som är mer benägna att producera direkta förändringar på beteendet tillskrivas ljus snarare än det cirkadiska systemet, per se (t.ex. maskning).
- Mörker / Dim röd belysning: Om det är nödvändigt att hantera eller behandla djur i mörker (t.ex. i ständigt mörker eller nattetid) bör mörkerseende glasögon användas. Alternativt, eftersom det cirkadiska systemet är relativt okänsligt för rött-våglängder, kan svagt rött ljus användas. Den specifika rött ljus du använder bör testas för att säkerställa att det inte alteR kör hjul aktivitet (t.ex. maskering) eller justera dygnsrytm klockan (t.ex. producera en fasförskjutning).
2. Datainsamling (se figur 1 - Vitalview hårdvarukonfiguration)
- Köra hjul: Diametern och ergonomi den löpande hjulet kommer att ändra storleken på användningen 24. Således använda mindre och lättare hjul för möss och större tyngre hjul för råttor. Vid tvätt och åter installera hjul, se till att hjulen kan snurra obehindrat, inte "vinglar" och att inspelningen mikrobrytare aktiveras av varje varv av hjulet.
- Micro-switchar: Varje revolution löphjul bör aktivera en magnetisk eller mekanisk mikrobrytare. Information från mikrobrytaren överförs via en enda kanal och registreras av en dator som kan bin data över tid (t.ex. varje 2, 5, 6, eller 10 min).
- Datorhårdvara: Vår Running-hjul inspelningar görs med Vitalview, en hård-och mjukvaruplattform utvecklad av Mini Mitter ( http://www.minimitter.com/vitalview_software.cfm ). Det finns dock andra inspelning plattformar som ClockLab, som utvecklats av Actimetrics ( http://www.actimetrics.com/ClockLab/ ). Båda plattformarna samlar data från många enkanaliga källor (t.ex. en enda mikrobrytare aktiveras av en enda löpande hjul) till en enda datafil. Data från enskilda kanaler kan sedan plottas och analyseras separat vid ett senare tillfälle.
3. Data Inspelningar
- Filer: Ovannämnda mjukvaruplattformar kan användas för att skilja ut enskilda kanaler så att enskilda filer skapas för varje gång-hjul rekord. Sådana data är bäst visualiseras och visas med speciellt designed program som ActiView (Minimitter, Bend, OR), Circadia eller Clocklab (Actimetrics, Wilmette, IL) som alla kan producera periodograms och actograms. Däremot kan en enda kanal filer också öppnas och analyseras med hjälp av generella kalkylprogram som Excel (Microsoft, Redmond, WA).
- Beräkning Circadian tid (CT): CT 12 är, per definition, uppkomsten av att köra hjul aktivitet i nattliga gnagare. Parallellt med 24 hr dagen, enligt konvention, är en dygnsrytm dag uppdelat i 24 dygnsrytm hr. Följaktligen om dygnsrytm frigående period är 24 timmar 30 minuter mätt med väggklocka, kommer CT 0 inträffar cirka 12 tim 15 min efter CT12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
- Datorprogram: Specialiserade datorprogram används vanligen i uppkomsten av actograms och beräkning av dygnsrytm period. Dessa program inkluderar, men är inte begränsade till, ActiView (Minimitter, Bend, OR) och Circadia.
- Actograms: Actograms ger en grafisk illustration av de dagliga mönster löpning hjul aktivitet. Det finns en enda ritas (x-axeln = 24 tim) och dubbelklicka ritas (x-axeln = 48 timmar) actograms. Båda metoderna plot sekventiella dagar från topp till botten, men dubbla ritas actograms tomt två dagar på varje horisontell linje. Specifikt dubbel-ritas actograms visar "andra dagen" längst till höger på varje rad, samt i början av den andra horisontella linjen, och så vidare. Dubbelklicka plottning är särskilt användbart för att visualisera icke-24 hr rytmer.
- Periodogram: En periodogram konstrueras från en spektralanalys av löphjul aktivitet över tiden. Periodograms visar den relativa powre för en rad förinställda perioder, och används ofta för att bestämma den frilöpande perioden.
- Resultat: I laboratoriet är gnagare vanligtvis inrymda under en 24 timmar LD cykel. Under dessa förhållanden rytmen i verksamheten är infångad, så att den dagliga mönstret av drift-hjul aktivitet är i linje med den exakta 24 timmar LD cykel. I figur 2A, dubbel-ritas actogram till vänster visar driften hjul aktiviteten hos en råtta som blev aktiv vid samma tidpunkt varje dag, strax efter de miljömässiga lamporna var avstängd. Periodogrammet till höger visar en kraftig topp vid 24 timmar, vilket överensstämmer med ångan till en exakt 24 timmar LD cykel. Figur 2B visar löphjul användning av en råtta som var inrymt i ständigt mörker. I detta fall skedde den dagliga starten av driften hjul aktivitet något senare varje dag, skapar en åt höger "drift". Denna åt höger "drift" indikerar att den endogena cirkadiska perioden är större THAN 24 h, men det är toppen i periodogrammet som kvantifierar denna period. Enligt periodogrammet den maximala effekten observerades vid 24,33 timmar. I motsats till den automatiserade periodogram analysen visar figur 3 en metod för att manuellt beräkna frigående period med tiden för starten av löpning hjul aktivitet. Det är viktigt att inse att beräkna tiden för hand och beräknar den med en periodogram kan ge något olika resultat.
De dagliga mönster löpning hjul aktivitet kan störas på flera sätt. Figur 4 illustrerar en arytmisk mönster av inkörnings-hjul aktivitet, som produceras av en elektrolytisk lesion av SCN. Denna typ av experiment som några av de första bevis på att SCN innehöll "master" dygnsrytm klocka 7,8. Periodogrammet till höger bekräftar denna arytmisk mönster av aktivitet genom att visa ekvivalent låg effekt för alla perioder i dygnsrytm området (20-30 timmar). Den circadian mönster av löpning hjul användning kan också störas av bostäder råttor i konstant ljus. Figur 5 visar ett actogram från en råtta utsatt sekventiellt till flera av de ljusförhållandena redan beskrivits. Först råttan inrymt i ständigt mörker och uppvisade en löpande rytm hjul aktivitet av cirka 24,33 timmar. Andra var det omgivande ljuset hålls på och råttan var inrymt i en konstant ljus miljö. Konstant ljus är känt för att störa SCN-baserade klocka och producera arytmiska mönster löpning hjul aktivitet, liknande en SCN lesion. Denna störning av ljus sker emellertid gradvis under loppet av 2-3 veckor. Därför, när driften hjul register analyseras efter de första 3 veckor i konstant ljus, inte ger periodogrammet inte en topp. Slutligen, i den tredje fasen råttan sattes tillbaka på en 12 timmen: 12 tim LD cykel och de löpande hjul aktivitet rytmer återhämta nästan omedelbart.
Mängden igång och tid på dagen det occurs, kan också manipuleras genom miljöfaktorer. Till exempel, om gnagare får fasta och ges en tidsmässigt fritt måltid varje dag, kommer denna restriktiv utfodring schema framkalla en daglig anfall av livsmedel föregripande aktivitet. Det kallas "föregripande" eftersom det inträffar före ankomsten av dagliga måltiden, och är särskilt tydligt när måltiden ges i mitten av dagen, en tid då nattliga gnagare är relativt inaktiva. Till exempel, om ett experiment ger en enda 2 tim måltid varje dag, kan mat sättas till buren vid ZT 4 (4 h efter ljus påslagen) och avlägsnades vid ZT 6 (2 timmar senare). Dessutom är trådnät golv i burarna också fördelaktigt för denna typ av experiment eftersom det gör det omöjligt för råttorna att dölja mat och lagra den för senare och därmed säkerställa att råttan faktiskt konsumerar all mat inom den föreskrivna måltid. Slutligen är en av de största fördelarna med en korrekt körning hjul aktivitet inspelning som det möjliggör korrelations göras mellan löpning hjul aktivitet och dagliga svängningar i uttrycket av dygnsrytm klocka genuttryck i hela hjärnan och kroppen. - Vanliga fallgropar:
- Många mjukvaruplattformar justeras automatiskt för ändringar av sommartid. Vid genomförande ett experiment vid årliga ändrade tider, vara säker på att detta alternativ är avstängd i inspelningsprogrammet och datorns operativsystem programvara. Detta skydd bör bidra till att undvika skillnader mellan inspelningen och den externa ljus cykel.
- För att kunna kontrollera avvikelser i data eller oväntade förändringar i beteende, hålla en textfil med exakt tid och datum för varje låda öppnas, utfodring och vattning, sängkläder förändringar, experimentella manipulationer och andra störningar som kan uppstå. Den exakta start-och sluttider för datainsamling bör också noteras i denna fil.
- Det är viktigt att regelbundet kontrollera att lamporna slår på och av ent de förväntade tider. Många problem kan uppstå, inklusive strömavbrott och brända glödlampor. Vissa kör hjul plattformar är utrustade med ljus-sensorer, men andra inte verifiera ljusförhållanden.
Figur 1. Vitalview hårdvarukonfiguration börjar med en gnagare löphjul, som är utformad för att aktivera en mikrobrytare med varje varv. Denna information färdas sedan till QA4 moduler och förmedlas till DP24 dataport och slutligen registreras av Vitalview-utrustad dator. Datorn summerar kör-hjul varv från varje kanal varje 10 min, dessa data kan ses senare som en actogram eller periodogram. Beroende på hur ljuset sätts upp, kan de fjärrstyras antingen av samma Vitalview-Utrustad dator eller vägg timers köpta från någon elektronik butik.
Figur 2 Representativa actograms och periodograms för manliga Wistarråttor inrymt i en 12 timmen:. 12 timmar LD cycle (A) och i konstant mörker (B). Dubbelklicka plottade actograms (vänster kolumn) visar ljusförhållandena längst upp, 48 h att köra hjul aktivitet längs X-axeln, och rita sekventiella dagar från topp till botten. Periodograms (höger kolumn) utföra en spektralanalys på de löpande hjulet uppgifter illustreras i actograms. Figur 1A visar beteendet hos en råtta som var inrymt i en 24 hr LD cykel. Under dessa förhållanden råttan blir aktiv vid samma tidpunkt varje dag, visar en exakt 24 timmar topp i periodogrammet. Figur 1B visar beteendet hos en råtta som var inrymt i ständigt mörker. Enligt Thes e förhållanden råtta var aktiv något senare varje dag, därav åt höger drift i actogram och 24,33 HR topp i periodogrammet.
Figur 3. Period kan också extrapoleras för hand. Först rita en linje av bästa plats utifrån dagliga insättande effekt (röd linje). Nästa beräkna lutningen i h / dag, kom ihåg att om rytmen är <24 timmar lutningen blir ett negativt värde, och slutligen lägga 24 timmar. Detta förfarande kommer att ge en uppskattning av den dygnsrytm perioden för detta djur. I det här fallet föreslår 4 hr/10 dagar att djuret blir aktiv ungefär 0,4 timmar senare varje dag (lutning 0,4 tim / dag). Därför är den cirkadiska perioden ungefär 24,4 timmar (eller ca 24 timmar och 24 minuter). Varje manipulation som är planerad enligt CT kräver frilöpande period för att göra en korrekt förutsägelse av CT.
Figur 4. Elektrolytiska skador på SCN kommer att producera arytmiska mönster löpning hjul aktivitet. I detta fall råttan är inrymt under konstant mörker och eftersom "master" dygnsrytm klocka har skadade, inte råttan att visa en endogen dygnsrytm i kör-wheel-aktivitet. Periodogrammet till höger bekräftar att det inte finns någon signifikant rytm i den cirkadiska intervallet.
Figur 5. Ljusförhållanden har starka effekter på mönster löphjul aktivitet. I denna post är råttan ursprungligen inrymt under konstant mörker (DD), som anges med den streckade delen av posten. Inom ramen för detta conditipå, driver dygnsrytm klockan ett dygnsrytmen i kör-hjul aktivitet med en period av 24,33 timmar, framgår av periodogrammet (uppe till höger). Därefter råttan inrymt under konstant ljus (LL), som betecknas med vita delen av actogram. Enligt detta tillstånd den endogena cirkadiska klockan avbryts gradvis under 2-3 veckor, och såsom framgår av periodogrammet (mitten till höger) råttan blir arytmiska. Slutligen, den normala 12 timmen: 12 tim LD cykel återinfördes och driften hjul aktivitet rytm återställdes med en exakt 24 timmar rytm vilket framgår av periodogrammet (nederst till höger).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Övervakning dagliga verksamheten rytmer med löpande hjul är den mest använda och tillförlitlig metod för att bedöma utgången av befälhavaren dygnsrytm klockan i nattliga gnagare. Hjul-running aktivitet är dock bara en av många aspekter av beteende och fysiologi som kan övervakas kontinuerligt. Även om de flesta av löpning hjul aktivitet sker under natten, sker över 30% av den totala vakenhet under dagtid 25,26. Andra effektmått kan användas för att bedöma dygnsrytmen, inklusive allmänna aktivitet, mat-bin metoder, dricka, sömn och kroppstemperatur. Således, beroende på naturen av studien, kan forskarna spela in flera rytmer samtidigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna lön utmärkelser, stipendier utrustning och operativa medel från de Fonds de la Recherche en Santé Québec (FRSQ), kanadensiska Institutes of Health Research (CIHR), den naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada (NSERC) och Concordia University Research Chairs Program (CRUC), samt tankeväckande synpunkter på detta manuskript från Dr Jane Stewart.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vitalview Card & Software | Mini Mitter | #855-0030-00 | (Bend, OR, USA) |
| DP24 Dataport | Mini Mitter | #840-0024-00 | (Bend, OR, USA) |
| QA4-Module | Mini Mitter | #130-0050-00 | (Bend, OR, USA) |
| Magnetic Switch | Mini Mitter | #130-0015-00 | (Bend, OR, USA) |
| C-50 Cable assembly | Mini Mitter | #060-0045-10 | (Bend, OR, USA) |
| Rat running wheel assembly | Mini Mitter | #640-0700-00 | (Bend, OR, USA) |
| Cage and tray support | Mini Mitter | #640-0400-00 | (Bend, OR, USA) |
| Useable cut away cage | Mini Mitter | #664-2154-00 | (Bend, OR, USA) |
| Grid floor for cage | Mini Mitter | #676-2154-00 | (Bend, OR, USA) |
| Waste tray | Mini Mitter | #684-2154-00 | (Bend, OR, USA) |
| Lamp housing | Microlites Scientific | #R-101 | (Toronto, ON, Canada) |
| 4W Fluorescent lamps | Microlites Scientific | #F4T5/CW | (Toronto, ON, Canada) |
| Isolation chambers | Custom built | 28"H x 20"W x 28"D ½" Black Melamine. |
References
- Pittendrigh, C. S., Daan, S. A Functional Analysis of Circadian Pacemakers in Nocturnal Rodents. V. Pacemaker Structure: A Clock for All Seasons. J. Comp. Physiol. 106, 333-355 (1976).
- Pittendrigh, C. S., Daan, S. A Functional Analysis of Circadian Pacemakers in Nocturnal Rodents. IV. Entrainment: Pacemaker as Clock. J. Comp. Physiol. 106, 291-331 (1976).
- Pittendrigh, C. S., Daan, S. A Functional Analysis of Circadian Pacemakers in Nocturnal Rodents. III. Heavy Water and Constant Light: Homeostasis of Frequency? J. Comp. Physiol. 106, 267-290 (1976).
- Pittendrigh, C. S., Daan, S. A Functional Analysis of Circadian Pacemakers in Nocturnal Rodents. II. The Variability of Phase Response Curves. J. Comp. Physiol. 106, 253-266 (1976).
- Pittendrigh, C. S., Daan, S. A Functional Analysis of Circadian Pacemakers in Nocturnal Rodents. I. The Stability and Lability of Spontaneous Frequency. J. Comp. Physiol. 106, 223-252 (1976).
- Ralph, M. R., Foster, R. G., Davis, F. C., Menaker, M. Transplanted suprachiasmatic nucleus determines circadian period. Science. 247, 975-978 (1990).
- Moore, R. Y., Eichler, V. B. Loss of a circadian adrenal corticosterone rhythm following suprachiasmatic lesions in the rat. Brain Res. 42, 201-206 (1972).
- Stephan, F. K., Zucker, I. Circadian rhythms in drinking behavior and locomotor activity of rats are eliminated by hypothalamic lesions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 1583-1586 (1972).
- Abe, M., et al. Circadian rhythms in isolated brain regions. J. Neurosci. 22, 350-356 (2002).
- Yamazaki, S., et al. Resetting central and peripheral circadian oscillators in transgenic rats. Science. 288, 682-685 (2000).
- Lamont, E. W., Robinson, B., Stewart, J., Amir, S. The central and basolateral nuclei of the amygdala exhibit opposite diurnal rhythms of expression of the clock protein Period2. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 4180-4184 (2005).
- Amir, S., Lamont, E. W., Robinson, B., Stewart, J. A circadian rhythm in the expression of PERIOD2 protein reveals a novel SCN-controlled oscillator in the oval nucleus of the bed nucleus of the stria terminalis. J. Neurosci. 24, 781-790 (2004).
- Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 5339-5346 (2004).
- Guilding, C., Piggins, H. D. Challenging the omnipotence of the suprachiasmatic timekeeper: are circadian oscillators present throughout the mammalian brain? Eur. J. Neurosci. 25, 3195-3216 (2007).
- Boulos, Z., Terman, M. Food availability and daily biological rhythms. Neurosci. Biobehav. Rev. 4, 119-131 (1980).
- Boulos, Z., Rosenwasser, A. M., Terman, M. Feeding schedules and the circadian organization of behavior in the rat. Behav. Brain Res. 1, 39-65 (1980).
- Verwey, M., Amir, S. Food-entrainable circadian oscillators in the brain. Eur. J. Neurosci. 30, 1650-1657 (2009).
- Davidson, A. J., Poole, A. S., Yamazaki, S., Menaker, M. Is the food-entrainable circadian oscillator in the digestive system? Genes Brain Behav. 2, 32-39 (2003).
- Hara, R., et al. Restricted feeding entrains liver clock without participation of the suprachiasmatic nucleus. Genes Cells. 6, 269-278 (2001).
- Damiola, F., et al. Restricted feeding uncouples circadian oscillators in peripheral tissues from the central pacemaker in the suprachiasmatic nucleus. Genes Dev. 14, 2950-2961 (2000).
- Mrosovsky, N. Phase response curves for social entrainment. J. Comp. Physiol. A. 162, 35-46 (1988).
- Cain, S. W., et al. Reward and aversive stimuli produce similar nonphotic phase shifts. Behav. Neurosci. 118, 131-137 (2004).
- Antle, M. C., Mistlberger, R. E. Circadian clock resetting by sleep deprivation without exercise in the Syrian hamster. J. Neurosci. 20, 9326-9332 (2000).
- Banjanin, S., Mrosovsky, N. Preferences of mice, Mus musculus, for different types of running wheel. Lab Anim. 34, 313-318 (2000).
- Verwey, M., Lam, G. Y., Amir, S. Circadian rhythms of PERIOD1 expression in the dorsomedial hypothalamic nucleus in the absence of entrained food-anticipatory activity rhythms in rats. Eur. J. Neurosci. 29, 2217-2222 (2009).
- Gooley, J. J., Schomer, A., Saper, C. B. The dorsomedial hypothalamic nucleus is critical for the expression of food-entrainable circadian rhythms. Nat. Neurosci. 9, 398-407 (2006).
