Summary
Büyük tespit nöronlar (ile hayvanlarda
Abstract
Büyük tespit nöronlar (örneğin yumuşakçalar), motor havuzları analizi ile hayvanlarda intraselüler teknikleri 1,2,3,4 kullanılarak yapılır. Son zamanlarda, biz ekstraselüler uyarmak ve Aplysia'nın californica 5 bireysel nöronların kaydetmek için bir teknik geliştirdi. Biz şimdi benzersiz bir şekilde tanımlamak ve motor havuzu içindeki motor nöronlar karakterize etmek için bu tekniği kullanmak için bir protokol açıklar.
Bu ekstraselüler teknik avantajları vardır. İlk olarak, hücre dışı elektrotlar uyarmak ve kaydetmek nöronlar kılıf ile 5 arasındaki, bu nedenle kaldırılması gerekli değildir olabilir. Böylece, nöronların hücre içi olanlardan daha hücre dışı deneylerde sağlıklı olacaktır. İkinci olarak, eğer ganglion kılıf bağlantılarını uygun göre döndürülür, hücre dışı elektrodlar daha kolay ve daha verimli aynı hazırlanmasında birden nöron tespit edilmesini sağlar gangliyon, her iki tarafına da nöronlar erişebilir. Üçüncü olarak, ekstraselülerlar elektrotlar hücreleri nüfuz gerek yok, ve böylece onları kolayca daha az zarar, nöronlar arasında ileri ve geri hareket ettirilebilir. Bir tek dakika sürebilir motor desenleri yinelenen sırasında birden nöronların kaydetmek için çalıştığında bu özellikle yararlıdır. Dördüncü olarak, ekstraselüler elektrotlar kas hareketleri sırasında intrasellüler olanlardan daha esnektir. Hücre içi elektrotlar çekin ve kas kasılmaları sırasında nöronlara zarar verebilir. Hücre dışı elektrotlar yavaşça nöronlar üzerinde kılıf üzerine basıldığında bu yana Buna zıt olarak, genellikle kas kasılmaları sırasında aynı nöron üzerinde kalmak ve böylece daha sağlam preparatlar da kullanılabilir.
Soma büyüklüğü ve yeri, aksonal yansıtma, ve kas innervasyon 4: benzersiz bir hücre dışı elektrotlar kullanılarak bir motor havuzu (özellikle, Aplysia olarak I1/I3 kas) için motor nöronlar belirlemek için, bir kriter olarak hücre içi ölçüm gerektirmezler özelliklerini kullanarak6,7. Tekniğin göstermek için kullanılan özel motor havuz için, aksonal projeksiyonlar ölçmek için bukkal sinirlerden 2 ve 3 kaydedilir ve tek tek motor nöronlar, kas innervasyonunun model belirlemek için I1/I3 kas kasılması güçler ölçülür.
Daha sonra hızlı bir tanımlama için basitleştirilmiş bir tanı yöntemi oluşturarak, motor desenleri sırasında zamanlama karakterize, kas innervasyonu kullanarak ilk tanımlayan motor nöronların tam işlem gösterilmektedir. Basitleştirilmiş ve daha hızlı tanı yöntemi askıya bukkal kütle hazırlama 8 veya in vivo 9 örneğin, daha sağlam hazırlıkları için üstündür. Bu işlem, aynı zamanda 2,3,13,14 Aplysia ya da diğer hayvan sistemleri içinde 10,11,12 diğer motorlu havuzlarda uygulanabilir.
Protocol
1. Kayıt Bulaşık hazırlanması
- Kuvvet dönüştürücü deneyleri sırasında, bukkal ganglionlar, serebral ganglion ve bukkal toplu kuvvet çalışmaları için uzmanlaşmış bir yuvarlak borcam tepsiye yerleştirilir.
- Deneylerde ingestive gibi desenler indüklemek için, serebral ganglion 15 non-kolinerjik hidrolizlenebilir karbakol uygulamak gerekir. Bukkal ganglia ve bukkal kitle üzerine karbakol doğrudan temas önlemek için, ayrı odaları bukkal ganglia ve bukkal kütlesi (Şekil 1) serebral ganglion yalıtmak için gereklidir.
- Bukkal kitle bukkal ganglionlar daha kalın olduğu için, onlar aynı düzeyde yer olmayacak. Bu nedenle, bu kap (bölge D, (alan Şekil 1 A), bukkal gangliya (Şekil 1 'de C alanı) ve bukkal kütlesi için daha derin bir ön bölme için bir platformun orta serebral ganglion için bir arka bölümüne sahip olmalıdır
- Bu yemeğin oluşturmak için, bir yuvarlak 100x15 borcami (yüksek 15 mm, çapı 100 mm) ile başlar. Yemeğin İnşaat birkaç Sylgard pours gerektirecektir. Sylgard ürün ile birlikte verilen talimatları izleyin. Sylgard farklı döküyor arasında ayarlamak için izin verilmelidir.
- Birinci dökmek orta platform ve arka bölme duvarı arasında kap (Şekil 1 'de B alanı) içinde Sylgard en yüksek düzeyde oluşturmaktır.
- Sylgard duvarın (Şekil 1 'de alan B) için alan izole etmek için iki hamuru taşıyıcılı kullanın. Onlar kolay çıkarılması için Sylgard irtibata geçecektir plastik wrap ile kaplayın modelleme kil telaları. Kil modelleme kaçağı en aza indirmek için, çanak irtibata geçecektir nerede, kenarları sıkı mühürler olun.
- Neredeyse kadar yemeğin üstüne iki kil modelleme telaları arasındaki kısmına Sylgard dökün. Tam gecede ayarlamak Sylgard edelim. Ilık bir yerde çanak tutulması neden olacaktırhızlı ayarı. Kil modelleme telaları çıkarın ve Sylgard herhangi kil tortuyu temizlemek.
- Daha sonra, arka bölme (alanı Şekil 1 A) ve orta platformu (Şekil 1 'de C alanı) dökülür olmalıdır.
- Uzakta platformun orta bölümü (C alanı) için Sylgard ön yüzeyinden yaklaşık 5 mm bir hamuru destek yerleştirin.
- Geri odasındaki (alan A) ve yukarı olanlar Sylgard duvar (B alanı) üst kotundan yaklaşık 3-5 mm'lik bir yüksekliğe orta platformu (C alanı) için bölümlere Sylgard dökün. Arka odasının Sylgard yüzey orta platforma karbakol içeren arka odasından gelen sızıntıyı önlemek için orta platformun göre biraz daha düşük olmalıdır. Yine, Sylgard tam gecede belirlemenize olanak sağlar ve daha sonra kil modelleme desteğini çıkarın.
- Nihai adım gitmek için serebral-bukkal bağlayıcılar için bir kanal (CBCs) sağlamak için Sylgard duvarının ortasında bir çentik kesmek içinorta platform ve arka odası arasında aracılığıyla. Bu çentik bölgesinin genişliği yeterince geniş CBCs için yaklaşık 3-4 mm olması gerekmektedir. Çentiğin alt sızmasını önlemek için orta platformun Sylgard yüzeyinden daha düşük olmamalıdır. Bistüri çentik kesmek için kullanılabilir.
2. Elektrot Hazırlama
- Bölüm 3.1 'deki gibi McManus ve ark tarafından tanımlanan Flaming-Brown mikropipet çektirmesi. 8 kullanarak tek namlulu kapiller camından ekstrasellüler cam elektrotlar çekin. Çekiciye FT345B filament ile, tipik program ayarları Isı 480, Pull 50, Hız 13 ve Zaman 20, ancak ayarları farklı filamentler için farklı olacağını unutmayın. Bu program hiçbir yangın parlatma kademesi ile, tek bir çekme içinde elektrotlar oluşturur. Elektrot uç boyutu hücre gövdelerinin boyutu daha küçük olması gerekir. 50 um dan soma çapı, iç Diamete 400 mikron arasında değişen motor nöronlar içinEkstraselüler cam elektrot sc yaklaşık 40 um olmalı ve Aplysia tuzlu su ile dolu olduğunda bunların dirençleri MΩ yaklaşık 0.1 olması gerekir.
- Bir Bunsen beki kullanarak polietilen boru emme elektrot çekin. Yaklaşık 10 cm uzunluğunda polietilen boru bir parça kesin. Her iki ucundaki hortumu tutun ve ısı yumuşak olana kadar tüpü dönerken çok Bunsen beki tarafından üretilen aleve yakın yerleştirin. Ateşten uzak taşırken uzunluğu boyunca dikkatle tüp gerin. Borunun uzunlamasına orta kısmı ve boru çekilir olarak daralır.
- Iki emme elektrot oluşturmak için yarım boru kesin. Bazen geçerken en uygulanabilir olsa da emme elektrodu genellikle, sinir ve kas kesme uçları uygulanır.
- 3,2-3,13 bölümler içinde McManus ve ark 8 tarafından tarif edilen protokol takip sinir kayıtlar için kanca elektrotlar oluşturun. Bu elektrotlar especi vardırBir sinir veya kas kesilmez kullanışlıdır müttefiki.
3. Kanca Elektrot Eklenti
- Hayvan teşrih ve McManus ve ark tarif edilen protokol takip bukkal kütle çıkarın. 8 bölüm 4.
- Kayıt ve stimülasyonu için, kanca elektrotların farklı bir sinir sayıda takılabilir.
- Cullins ve Chiel 9 in vivo olarak yapıldı desenleri karakterize etmek, kayıtları gıda kapatılması grasper 17, bukkal gösteren 16 beslenme protraksiyon aşaması, radular sinir (RN) gösterir I2 sinir ve kas alınmalıdır retraksiyon faz 17,18 göstermektedir sinir 2 (BN2) ve bukkal sinir 3 (BN3). Kanca elektrotların Ek McManus ve diğerleri 8, Bölüm 5 tarafından tarif edilene benzer bir prosedür takip eder.
- Bu sinirlerin konumlarında gösterilen Aplysia besleme aygıtının şematik bakınızMcManus ve ark 8 Şekil 2. Not dalları yanal oluk de I1 kas altına gitmeden önce a, b ve c içine BN2 e ayrılır. Bir ana gövdeden ayırmak için birinci dal ve BN3 bitişik Branch.
- Dalları adlandırılması, b ve c Warman ve Chiel 18 tarafından kullanılmıştır. Dallar a, b, c ve Nargeot ve diğerleri tarafından kullanılan isimlendirme, sırasıyla, dallar 3, 2 karşılık gelir ve 1. 19. Ayrıca, RN, BN1, BN2 ve BN3 Kandel 20 ve Scott ve ark tarafından kullanılan isimlendirme, sırası ile, sinirler 1, 6, 5 karşılık gelir ve 4. 21
- I1/I3 kas kas innervasyonu incelemek için, bukkal sinirler dışındaki tüm sinirler 2 deneyler sırasında bukkal kütleden kesilecek. Böylece, BN2 gelen kaydetmek için bir kanca elektrodu kullanılmıştır. <li> I2 sinir ve RN bukkal kütle eklenmiş ve bu kanca elektrotlar kullanılarak ulaşmak çok zor olan olmayacak olduğundan, onların yerine kayıt yapmak emme elektrodu uygulamak tercih edilir. Biz 7. bölümünde emme elektrot uygulaması anlatacağız.
- Bu elektrot iki tür kullanarak erişmek kolaydır, çünkü BN3 gelen kaydetmek için bir kanca elektrodu veya bir emme elektrot birini kullanın. Biz emme elektrot tutmak için manipülatörlerin sayısını en aza indirmek için, ve diğer manipülatörler veya ekipman için yer kazanmak için BN3 kayıtlar için bir kanca elektrodu kullanmayı seçti.
- BN2 bir (BN2-a) Deneyler sırasında ret benzeri desenler başlatmak için şube bir kanca elektrodu takın. Bazı nöronlar ipsilateral vs kontralateral BN2-a uyarım farklı tepki, çünkü, diğer tarafta BN2-a için bir ek kanca elektrodu bağlamak için yararlıdır.
- Unilateral vs ikili projeksiyonlar nöronların ayırt yardımcı olmak için,bukkal gangliyonların diğer tarafında BN2 ve BN3 için kanca takmak için elektrotlar de yararlıdır.
4. Ganglion ve Kas Hazırlama
- Bukkal gangliyon, serebral gangliyon ve bukkal kütle serebral ganglion tek BN2s üzerinden CBCs ve bukkal kütle bukkal gangliyon bağlı üzerinden bukkal gangliyon bağlanmış olduğu, söz konusu güç dönüştürücü deney için hazır edilir.
- Kancalı elektrotlar takılarak sonra bukkal kütleye eki noktada kesim, bukkal sinir 1 (BN1) ve bilateral özofagus sinir (TR) kesti.
- I2 kas onu yolun dışına taşımak için ileri serebral ganglion çekin. Radular kese üzerindeki I2 kas içine bir kesim olun, her iki yönde yanal ve anteriorda kesim genişletmek ve radular sinir maruz ileri I2 kas flep çekin. İki RN dalları kesin ve dalları emme elektrot eki için yeterince uzun olduğundan emin olun.
- Cbukkal ganglia ve I2 kas ekli kısmı tamamen bukkal kitle ayrılabilir kadar bukkal ganglionlar etrafında geniş bir daire içinde I2 kesim, BN2s veya BN3s kesmek için dikkatli olmak, Devam et. Kanca elektrodu eki ötesinde, bukkal kütleye eki noktada ikili BN3s kesin.
- Vakum gres glob pick up ve çentik üzerine yaymak için bir pipet kullanarak, arka kamara ve orta platformu bağlandığı yukarıda açıklanan kayıt çanak çentik vakum gres ince bir tabaka uygulayın.
- Sadece orta platformun Sylgard baz önünde, bukkal kütle yerleştirilir ön odasının cam alt hızlı-Jel süper yapıştırıcı ince bir tabaka uygulanır.
- Dikkatle kanca elektrotların hiçbiri sinirleri hasar verebilecek sıkıca çekilir emin, Bölüm 2'de açıklanan kayıt çanak (Şekil 1) serebral ganglion, bukkal ganglionlar ve bukkal kütle transferi.
- Dikkatli bir şekilde ventral yüzeyi çanak tabanına yapıştırılır emin olmak için, kayıt çanak ön bölme içinde yapıştırıcı üzerinde bukkal kütle yerleştirin. Tutkal dokunmadan ganglia ve elektrotlar tutmak için emin olun. Tutkal neden olur ki, çanak Aplysia tuzlu 8 (460 mM NaCI, 10 mM KCI, 22 mM MgCl2, 33 mM MgSO4, 10 mM CaCl2, 10 mM glikoz, 10 mM MOPS, pH 7.4-7.5) ekleyin ayarlamak için kullanılır.
- Çanak ekstraselüler soma kayıtları için bukkal ganglionlar hazırlamak için başka bir mikroskop aktarılması gerekiyorsa, kancalı elektrotlar ile çok dikkatli olun. Grup birlikte bukkal kütle bir tarafında elektrodları, ve aynı zamanda bir arada bukkal kütle diğer tarafında grup elektrotlar. Dikkatlice tekrar elektrotların hiçbiri sıkıca çekilir emin, konektör pimleri kapsayan laboratuvar bant tutarak elektrotlar tutun.
- Çanak mikroskop, elektrot altına konumlandırılmış olduğundas yemeğin yanındaki platformda çanak ve dinlenme taraf üzerinde hafifçe kaplanması gerektiğine.
- Sonları sırasında ve deney kademeleri arasında, bir akvaryum airstone kullanılarak bukkal boşluk içinde kütle tuzlu havalandırır.
- Serebral ganglion kılıf kapmak ve CBCs çentik aracılığıyla çalıştırmak sağlayarak, arka kamara içine çekmek için forseps kullanın. Sağlam CBCs zarar görmesini önlemek için CBCs dışındaki sinirleri kullanarak serebral ganglion Pin.
- CBCs üzerinde daha fazla yağ vakum uygulanır ve daha sonra ganglionlar tamamen daldırılmış böylece, her iki çanak odalarına daha Aplysia tuzlu ekleyin. Hiçbir sızıntı odaları arasında oluşacak şekilde vakum gres üst Sylgard duvara biraz daha olduğundan emin olun.
- Bukkal gangliyonların stabilize etmek için, ilk önce BN3s, orta platformu (Şekil 2) Sylgard taban üzerinde BN1s ve lerin uçları pin. BN3s kanca elektrodu kullanılarak kaydedilmiş olacağındans, pimleri kanca elektrotların bağlanma noktalarına göre daha distal yerleşimli olmalıdır.
- CBCs (Şekil 2) hasar olmayacak, böylece CBCs esneme ve çapa kanca gibi, 90 derece eğildi, iki iğne kullanın.
- Geri odasındaki ve bukkal ganglionlar arasındaki RN dalları aşağı Pin. Sonra I2 kas RNS üstünde olacak. I2 sinir göstermek için, I2 kas kapmak ve bukkal ganglionlar üzerine çekmek için forseps kullanabilir. I2 sinire zarar vermemek için I2 kasının iki köşe Pin.
- Onun iki şube I2 kas içine birleştirme hangi noktaya distal I2 sinir Sever. Kas hala vivo kayıtları ile karşılaştırılabilir olduğu innerve olduğundan emin olun. I2 kas kalanı uzak kesin ve I2 sinir geri çevirmek ve (Şekil 2, inset bakınız) iki RN dalları arasına sıkıştırmak.
- Bir sinir çok gevşek ise germek ve gerginlik eklemek için pinlerini ayarlayın veya nerv eğer gerginliği boşaltmak içine çok sıkı. Daha bukkal ganglionlar stabilize etmek, sinirler arasındaki kılıf daha işaretçilerine ekleyin.
- Bukkal ganglion kaudal tarafı yukarı yerleştirilir beri ilgi nöronlar rostral tarafında ise, bukkal ganglionlarda döndürün. İki bukkal gangliyonların birini döndürmek için, bukkal ganglionlar yakın olduğu CBC bazı aşırı kılıf kapmak için ince forseps kullanın ve BN2 ve BN3 arasındaki aşağı pin. Bazı gangliyon, bu CBC ve BN3 arasına aşağı pin daha uygun olabilir.
- Bukkal ganglion hareketini en aza indirmek için, ön bölme yakın yan üzerinde bukkal ganglion kılıf üzerinde ek bir pim ekleyin.
- Bukkal gangliyon kapsayan kılıf kırpmak için, arka odaya tarafında yakın üzerindeki kılıf kapmak için ince forseps kullanın ve sonra hücre gövdeleri maruz kalmadan ince makas ile aşırı kılıf kesip. Zararı en aza indirmek için, sadece hücre gövdeleri görmek için gerekli kılıf en az miktarda çıkarın.
- T sonraO bukkal gangliyonların kılıf bukkal ganglionlar üzerinde I2 sinir ve RNS çekin ve daha bukkal ganglionlar döndürmek için bukkal ganglionlarda ve ön kamara arasında onları aşağı pin, düzeltilebilir. (Bakınız Şekil 2).
- Diseksiyon öncesi hayvan uyutmak için kullanılan kalan magnezyum klorür 8 yıkamak için taze Aplysia'nın salinle çanak Aplysia'nın salin değiştirin.
5. Elektrikle Kanca Elektrotlar bağlanması
- Ganglionlar ve kas hazırlandıktan sonra, deneyler için titreşim izolasyonu masaya çanak dikkatle aktarın.
- Amplifikatörler (AM Sistemleri model 1700 amplifikatör) bağlanmak BNC kablolar yuvalarına tüm elektrot pimleri takın. Yine, bunu yaparken elektrotlar sıkıca çekilmiş değil emin olun. Elektrotların doğru şekilde uygun kabloların bağlı ve kutupları doğru olduğundan emin olun. 6. Soma Kayıtlar için Ekstrasellüler Cam elektrotlar kurma
- Yaklaşık 15-20 cm uzunluğundaki polietilen boru parçasına bağlanmış bir şırınga kullanılarak Aplysia tuzlu su ile elektrot doldurun. Cam elektrot sonuna kadar polietilen hortumun serbest ucunu. Aplysia'nın salin ile elektrot doldurmak için şırınga pistonunu geri çekin.
- Manipülatör üzerinde sahibinin çentik dolu ekstraselüler cam elektrot yerleştirin. Bukkal ganglion içeren Aplysia'nın salin içine elektrot ucu yerleştirin manipülatör kullanın.
- Kayıt tel olarak hizmet elektrot bir erkek altın konektörü pin lehimlenmiştir bir gümüş / gümüş klorür tel yerleştirin. Referans teli gibi davranmaya bukkal ganglionlar içeren kayıt yemeğin bölümünde Aplysia'nın salin doğrudan bir erkek altın konektörü pin lehimlenmiştir başka bir gümüş / gümüş klorür tel yerleştirin. Th bağlayınamplifikatör bağlanır BNC kablosunun e kayıt ve başvuru teller.
- Daha manipülatörleri için yeterli yer olması durumunda, ilave ekstraselüler cam elektrot aynı anda birden fazla nöronlar kaydetmek için ilave edilebilir.
- Sinirin çapına uygun ucu emme elektrot dar sonunu kesin. Elektrot ucunun iç çapına benzer ya da sıkı bir emme sağlamak için en sinir çapından biraz daha küçük olması gerekir.
- I2 sinir ve RN birbirine çok yakın olduğundan, onların elektrotlar yer kazanmak için aynı manipülatör tarafından tutulabilir. Aynı tutucunun iki çentik iki elektrot yerleştirin. Iki elektrot döndürün ve kendi ipuçları bir diğer yakın olduğundan emin olun. I2 sinir kayıt için bir tanesi, RN kayıt için diğer bir seçin.
- Recordin içindeki Aplysia'nın salin içinde elektrot ucu yerleştirinbukkal ganglion içeren g çanak. Emme elektrodu için şırınga polietilen hortumun serbest ucunu. Aplysia tuzlu su ile elektrot doldurmak için şırınga kullanarak. Yakınında hedef sinir ucuna uç elektrot hareket ettirin, I2 sinir yani, ve elektrot içine sinir emmek için şırınga kullanın. Elektrot içindeki sinir uzunluğu sıkı bir sızdırmazlık sağlamak için 0.5-1.0 mm olmalıdır.
- RN eklenir elektrot için emme tekrarlayın.
- Bölüm 6.3 'de tarif edildiği gibi, karşılık gelen BNC kablolara elektrodu bağlayın.
- Kas kuvvet dönüştürücüleri takmak için, ipek dikişlerle kullanın. Her sütür kavisli iğne bükün ve kuvvet dönüştürücü için dikiş atılmalıdır. Yavaşça kapmak ve asansör kas küçük bir miktar forseps ile ve, forseps başka bir set içinde iğne tutan, insertyukarı iğne içinde eğilmiş noktası (Şekil 1) ile iğne kas içinden.
- Transdüserler I1/I3 kas ya dorsal veya yanal takılabilir. Dorsal eki kas sol ya da sağ tarafına aktivasyonu tarafından uyarılmış kasılmaların ölçümünü sağlar. Yanal eki nöronların çoğunluğu için güçlü kuvvetler gösterecektir, ancak dönüştürücü bağlı olduğu tarafta daralma ölçüm sadece sağlayacaktır.
- I1/I3 ön, arka veya her ikisi bölgeleri aktive olabilir nöronlar belirlemenize yardımcı olmak için, faringeal dokuya sadece anterior kas arka kısmına bir kuvvet dönüştürücü takın ve ön kısmına bir başka kuvvet dönüştürücü takmak kas, çeneler (Şekil 1; not kancalar) at.
- Sütür gergin çekti kadar kuvvet dönüştürücüleri kaldırın ama overstretch yok. Sütür i biraz rahat olduğunda Bunu kontrol etmek için, kuvvet dönüştürücü gelen ölçüm görüntüleÖlçüm hafifçe bu taban seviyesine kadar t, sonra dönüştürücü kaldırın.
- Bu protokol, ekstraselüler bir motor havuzu içinde motor nöronlar belirlenmesi için bir işlemi tarif etmektedir. Biz bireysel nöronlar, birden sinirler ve kas (EMG sinyali veya kasılma kuvvetleri) aktivitesini izlemek için AxoGraph yazılımını kullanmıştır. Bu protokol, biz motor nöronların belirleme işlemi için bir örnek olarak kas kasılması kuvvetleri kullanılır; diğer deneylerde, biz de EMG kullanılır ve bu tür deneyler için kurulum (Tartışma bakın) çok benzer.
- Bir aday nöron bulmak için, hafifçe uyarılması ve kayıt seçicilik 5 için en iyi yerdir nöron soma 5 (Şekil 3), merkezi üzerinde kılıf üzerine ekstraselüler cam elektrot ucu aşağı doğru basın manipülatör kullanın. Yana eşik akımı fveya bir nöron aktive elektrot-to-soma mesafe 5 ile doğrusal olarak arttığını, stimülasyon seçicilik kötü elektrot bir komşu nöronun doğru hedef nöronun merkezinden uzağa taşındığında olacak.
- Bir motor nöron belirlemek için, öncelikle doğrudan sadece bu nöron ateşleme sağlamak için ekstraselüler cam elektrot kullanılarak nöron uyarmak ve kas innervates olmadığını incelemektir. Sonra, ekstraselüler bu nörondan rekor kurmak için bir-biri için ekstraselüler soma kayıt ve aynı zamanda nöron tanımlanması için büyük önem sinir kayıtları arasındaki ilişki.
- Çoğu ekstraselüler amplifikatörler bir kanal eşzamanlı uyarılması ve kayıt izin vermez bu yana, uyarmak ve kayıt soma (soma kanal) stimülasyon modu ve kısa bir akım anodik (Aplysia'nın nöronlar 5 örneğin 6 msn) uygulamak için kullanılan kanalı ayarlamak soma (Şekil 4A, 5A; not okları 1 in iki figür), (örneğin 200 uA) bir düşük akım başlayarak, yavaş yavaş nöron patlayana kadar geçerli artmaktadır.
- Nöron patlamaya aktive edildiğinde, biri hemen uyarılması modundan kayıt moduna (; not oklar 2 hem rakamları Şekil 4A, 5A) soma kanal geçmelisiniz. Ancak, yine de, çünkü insan tepkisi gecikmeler soma uyarılması ve kayıt arasındaki gecikme olmayacağını.
- Zaman makul miktarda nöron patlarsa, bunu gözlemlemek mümkün olmalıdır tek-için-bir soma kayıt gelen ve sinir (ler) ile ilgili gelen aksiyon potansiyelleri hangi aracılığıyla nöron projeleri (Şekil 4B, 5B; not kesikli çizgiler ), nöron (Şekil 4A, 5A tarafından oluşturulan hem de kuvvetleri; not mavi kutu). Nöron soma kayıt başlamadan önce ateş durursa, daha uzun bir süre için etkinleştirmek için geçerli artırın.
- Ekstraselüler sinyal-gürültü oranıkayıtları elektrot konumu ve soma boyutuna bağlıdır. Ekstraselüler kayıt soma boyutu artış ve elektrot-to-soma mesafe azaldıkça daha büyük olacak. Gürültü sadece dar bir aralıkta değişir bu yana, sinyal-gürültü oranı da soma boyutu artar ve elektrot-to-soma mesafe azaldıkça artacaktır. Sinyal-gürültü oranının en yaygın dizi 4:1 ila 8:1 olan.
- Motor nöronların bu tür soma konumu, sinir ve kas projeksiyon innervasyon 4,6,7 özelliklerini de esas tespit edilebilir. Sadece iki BN2s BN2s üzerinde faaliyet izlenerek, bukkal kütle bağlı oldukları için, bir kas kasılma gücünün sadece hücre dışı uyarım ile aktive nöron tarafından neden olduğu sağlayabilir.
- Örneğin, B3 bukkal ganglion rostral tarafında bulunan I1/I3 kas için büyük bir motor nöron (200-350 gr ağırlığında olan hayvanlarda soma çap olarak 300-400 mikron), (Şekil 3 '
- Bir nöron belirlendikten sonra, bu etkinlik aşağıda açıklandığı gibi ortaya çıkarılan olan hücre dışı cam elektrot (Şekil 4 ve 5), farklı besleme yolu ile benzer davranış kaydedilebilir. Soma üzerindeki hücre dışı kayıt çok daha spesifik pek çok farklı nöronların aktiviteyi sinir kayıtları, kısa olacaktır.
- Egestive benzeri motorlu programları teşvik etmek, bakliyat 19 1-2 dk (2Hz her darbenin 1 msn) sahip olan BN2-bir teşvik. Bu uyarım güvenilir bu ortamda egestive desenler oluşturur. Yeterli akımı ile (örn. 300 uA), desenler stimülasyon süresi boyunca devam edebilir. Bazen kısa bir süre sonra ortaya çıkar bir tane daha model olacakstimülasyon biter.
- Ingestive gibi motorlu programları indüklemek için, doğrudan serebral ganglion 15 kılıf üzerine katı karbakol bir kaç kristaller yerleştirin. Biri karbakol maruziyet düzeyini kontrol etmek istiyorsa, Aplysia'nın salin içinde 1 ile 10 mM karbakol bir çözümü kullanın. Yüksek konsantrasyonlarda yanıtları uyardığı olasılığı daha yüksektir. Tekrarlayan desenler genellikle beş dakika içinde başlar ve koşmak başlamadan önce yaklaşık on-onbeş dakika sürebilir.
- Karbakol birkaç kez yıkanması ve en az 30 dakika beklettikten sonra, karbakol bir sonraki uygulama daha ingestive gibi motor desenleri indüklemek için serebral ganglion için ilave edilebilir.
- Özellikle motor havuzu için birden fazla motor nöronlar belirlendi ve motor programları sırasında karakterize edildikten sonra, bir hızla gelecekteki çalışmalarında bu nöronların (Şekil 6 tanımlanması için çok az bilgi gerektiren bir ölçüde basitleştirilmiş bir tanı yöntemi gelişebilir </ Strong>), örneğin askıya bukkal kitle preparatları veya in vivo. Kriterleri soma büyüklüğü ve konumu, sinir projeksiyon, sinirler üzerindeki birim boyutunu ve motor desenleri sırasında aktivite zamanlaması içerebilir.
7. Sinir Kayıtlar için Emici elektrotlar ayarlama
8. I1/I3 kas kasılması Tedbir Kuvvet Dönüştürücü ayarlama
9. Bir Motor Pool içinde Motor Nöronlar belirlenmesi
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekiller 4 ve 5, iki I1/I3 motor nöronlar tanımlamak için kullanılan tipik sonuçları göstermektedir. Şekil 4 egestive gibi ingestive ve benzeri örnekler (Şekil 4C, 4D) ve bir geniş motor nöron, B3 ve soma kayıtları gösterir. Birebir için soma kanal ve B3 soma kayıt özgüllüğü desenleri sırasında sürdürüldüğü anlamına ipsilateral BN2 kanalı (Şekil 4E) show gelen ani. B3 desen orta-geç retraksiyon aşamasında patlar. Şekil 4 ve diğer sonuçlar (gösterilmemiştir), biz B3 BN2 birimi her zaman büyük BN2 birim olduğu bulunmuştur. Böylece, aynı zamanda BN2 kayıtları doğrudan tespit edilebilir.
Şekil 5 egestive benzeri ve ingestive benzeri desenler (Şekil 5C, 5D) sırasında küçük bir nöron, B43, ve soma kayıtları gösterir. Birebir için soma kanalda gelen anive ipsilateral BN2 kanal (Şekil 5E) de B43 soma kayıt özgüllüğünü desenleri boyunca muhafaza edildiğini göstermektedir. Desen sırasında geri çekme aşamasının sonunda, Neuron B43 patlamaları. B43 ve BN2 birim küçük olduğundan, soma kayıt olmadan BN2 kayıtlarından tanımlamak için zor olur, çünkü BN2 motorun kalıp sonunda, en çok yoğun bir şekilde harekete çünkü ancak, B43 en burst sonuna henüz tespit edilebilir yalnız gelen BN2 kayıtları.
Şekil 6, çok daha kolay ekstraselüler asılı kütle hazırlama bukkal ya da in vivo I1/I3 motor nöronlar belirlemek mümkün kılan bir kriter olarak kas innervasyon gerektirmez iyileştirilmiş bir teşhis ağacını göstermektedir. Tanılayıcı dallanmış ağaç kuvvet ve EMG ölçümleri kullanılarak, ancak, gelişmiş ve böylece bu protokolde teknikleri aerodinamik motor nöron tanımlama nasıl yol açabileceğini göstermektedir edildi.
Şekil 1. Genel kurulum ve kuvvet çalışmalar için çanak şematik. Üst görüntü bir üst görünüşünü göstermektedir. Alt resim bir yan görünümü (üstten görünüm ortasında kesikli çizgi tekabül eden) göstermektedir. Serebral ganglion (bölge A) arka odasında Sylgard tutturulmuştur. Bukkal ganglion orta platformu (C alanı) üzerinde Sylgard tutturulmuş edilmektedir. Geri odasındaki ve orta platformu yükselmiş Sylgard duvar (B alanı) ile ayrılır. Serebral-bukkal bağlaçlar (CBCs) vakum gres ile mühürlenir, Sylgard duvara bir çentik geçer. Bukkal kütle ön odasının cam alt (bölge D) yapıştırılmıştır. Bukkal sinirler 2 (BN2s) bukkal kütle eklenir. Ipek dikişlerle bağlı iki kanca I1/I3 kasın anterior ve posterior bölgeler sokulur. TO ipek dikişlerle sonra kuvvet dönüştürücü bağlanmıştır. Şekil alanları A, B, C, ve D koyu renk, yüksek gelen yüzey yüzeyleri göstermek için koyu gri, açık gri ve beyaz kullanır. Şekil çanak önemli boyut belirtmek için a, b, c, ve d kullanır. Uzunluk 3-4 mm, arka kamara ve orta platformu bağlayan çentik genişliği. Uzunluk b 3-5 mm, orta platformu (C alanı) ve Sylgard duvar (alan B) yüzeyleri arasındaki yükseklik farkı ile ilgilidir. Uzunluk c yaklaşık 5 mm olan çentik uzunluğunu belirtir. Uzunluk d yaklaşık 5 mm olan orta platformu (C alanı), ve genişlik göstermektedir.
Şekil 2. Bukkal gangliyon şematikve elektrotlar kurulumu. Şekil bukkal sinirler 1, 2, ve 3 (BN1, BN2 ve BN3), özofagus sinir (TR), radular sinir (RN), I2 sinir ve kas dahil olmak üzere önemli sinirlerin yerleri gösterilmektedir ve serebral bukkal bağ (CBC). BN2s (bkz. Şekil 1) bukkal kütlesine bağlı olduğunu unutmayın. CBCs Sylgard duvarın çentik geçerek serebral ganglion eklenir ve (bkz. Şekil 1) vakum gres ile mühürlenir. RN ve I2 sinir ve kas ganglionlar üzerinde çekti ve bukkal kütlesi (ön yönü) proksimal sabitlenir. Mavi çizgiler işaretçilerine yerini gösterir. İki eğilmiş pinler (kırmızı çizgiler 1 etiketli) CBCs demirlemek için kullanılır. Sol tarafta CBC kılıf bir flep katlanmış ve sol yanak ganglion (kırmızı çizgi 2 etiketli) döndürmek için BN2 ve BN3 arasında aşağı sabitlenmiş unutmayın. Bazı gangliyon, bu CBC ve BN3 arasındaki kılıfı aşağı pin daha uygun olabilir. Ek pim t ilave edilirEN fazla rotasyon ve istikrar için (kırmızı çizgi 3 etiketli) proksimal ganglion tarafı o. Hücre dışı cam elektrot hücre dışı uyarım ve kaydı için soma yukarıda kılıf üzerine yerleştirilir. Kanca elektrotlar BN3s bağlı olan ve yerinde tutan, bu sinir işaretçilerini, bu kanca elektrot bağlama noktaları daha distal yerleşimli olmalıdır. İki emme elektrot RN ve I2 sinir ve kas (I2 sinir ve kas daha net bir görünüm için içerden bakın) bağlıdır. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 3,. I1/I3 motor ekstraselüler tanımlanması için nöron haritası bir resmi ve şematikAplysia'nın bukkal ganglion nöronlar. Üstteki resim bir sağ yanak ganglion gösterir, yukarı kaudal tarafında tutturulmuş. Bukkal gangliyon, RN ve I2 sinir / kas döndürmek için bukkal ganglionlar üzerinde çekti ve EN tarafına proksimal sabitlenir. CBC kılıf bir kapak da rostral tarafında veya kaudal / rostral sınırda nöronların görülebilir, böylece katlanmış ve (bkz. Şekil 2) dönüş için tutturulmuştur. Alt şematik üst resim esas alınarak hazırlanmıştır. Tablo ve şematik bir arada I1/I3 motor nöronlar B3, B6, B9, B10, B38, B39, B43 ve B82 6,7 22,23 yanı sıra, bazı diğer nöron konumları göstermektedir. Nöronlar B8a ve B8b RN üzerindeki en büyük birimi sorumludur ve grasper 6,17 kontrol kas I4 innerve. B4 ve B5 Nöronlar BN3 18 büyük birimi sorumludur. I1/I3 motor nöronların boyutları ve konumları hayvan t değişken olmasına rağmeno hayvan, göreceli boyutları ve konumları en nöronlar için oldukça güvenilir: B3, B6, B9, B38, B43, B82 ve. Özellikle I1/I3 motor nöronlar, benzersiz B10 ve B39 tanımlamanın bazı zorlukları hakkında daha fazla ayrıntı için tartışma bakın.
Şekil 4'e. I1/I3 motor nöron B3 tanımlanması ve karakterize edilmesi. A) Hücre dışı B3 stimülasyonu (ok 1) ve B3 soma (ok 2 den başlayarak) yanı sıra, karşılık gelen sinir ve kas bölgelerden kayıt. Yukarıdan aşağıya, kanallar B3 soma, kontralateral BN2, ipsilateral BN2, ipsilateral BN3, I1/I3 kasın anterior bölge kasılma kuvveti ve en posterior bölgenin kasılma kuvveti kayıtları vardır I1/I3 kas.mavi kutu I1/I3 kasın anterior ve posterior bölgelerde güçlerinin süresini vurgular. Bu özel durumda, arka güç ön kuvveti daha büyüktür. A1 kırmızı kutu tarafından açıklanan alan B) genişletilmiş görünümü. Tek-için-bir B3 soma ve iBN2 kanallarda gelen aksiyon potansiyelleri olduğunu ipsilateral BN2 B3 sadece proje. C) Ekstrasellüler B3 soma gelen kayıt ve bir egestive benzeri motorlu desen sinirler. D) Ekstrasellüler kayıt göstermek arasından B3 soma ve ingestive benzeri motorlu desen sinirler. C ve D olarak, yukarıdan aşağıya doğru, kanallar B3 soma, I2 sinir, RN, ipsilateral BN2 ve ipsilateral BN3 kayıtları vardır. Mavi kutular desen protraksiyon ve retraksiyon aşamaları gösterir. C ve D her ikisi de B3 soma kanal içinde kırmızı çubukları hareket kap vurgulamakentials B3 soma kaydedildi. B3 beslenme motor desenleri sırasında ipsilateral BN2 pişirim zaman C ve D hem iBN2 kanalda kırmızı çubuklar ilgili zamanlamasını gösterir. E) Genişletilmiş B3 soma görünümü ve kırmızı çubuklarla işaretlenir iBN2 kanalları. Kesikli çizgiler gösteren bir-biri için B3 soma içinde aksiyon potansiyelleri ve iBN2 kanallar arasındaki ilişki. B3 BN2 ünitesi tüm birimlerin büyük olduğunu unutmayın. Böylece, biz de soma kayıtları olmadan BN2 kayıtları doğrudan B3 BN2 birimleri algılayabilir. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 5,. Belirlenmesi veI1/I3 motor nöron, B43 karakterize edilmesi. B43 A arasında) Hücre dışı uyarım (ok 1) ve soma dan kaydı (ok 2 ile başlayan) yanı sıra, karşılık gelen sinir ve kas bölgelerden. Yukarıdan aşağıya, kanallar B43 soma, kontralateral BN2, ipsilateral BN2, ipsilateral BN3, I1/I3 kasın anterior bölge kasılma kuvveti ve en posterior bölgenin kasılma kuvveti kayıtları vardır I1/I3 kas. Kutu mavi B43 aktivite sırasında I1/I3 kas gücü ölçümleri vurgulamaktadır. Aktifleştirici B43 küçük posterior kuvvet üretir, ama hiçbir ön kuvvet. B) alan Genişletilmiş görünüm A kırmızı bir kutuyla sıraladı. Kesikli çizgiler gösteren bir-biri için ipsilateral BN2 sadece. C B43 projeler) Ekstrasellüler kaydı gösterir B43 soma içinde aksiyon potansiyelleri ve iBN2 kanalları arasındaki ilişkiBir egestive-gibi motor desen B43 soma ve sinirlerden. B43 soma ve ingestive benzeri motorlu desen sinirler D) Ekstraselüler kayıt. C ve D olarak, yukarıdan aşağıya doğru, kanallar B43 soma, I2 sinir, RN, ipsilateral BN2 ve ipsilateral BN3 kayıtları vardır. Mavi kutular desen protraksiyon ve retraksiyon aşamaları gösterir. C ve D her ikisi de B43 soma kanal içinde kırmızı çubuklar B43 soma kaydedilen aksiyon potansiyelleri vurgulamaktadır. B43 bu desenler ipsilateral BN2 pişirim zaman C ve D hem iBN2 kanalda kırmızı çubuklar ilgili zamanlamasını gösterir. E) Expanded B43 soma görünümü ve D kırmızı bar ile işaretlenmiş iBN2 kanalları. Kesikli çizgiler B43 soma içinde aksiyon potansiyelleri arasındaki tek-için-bir ilişkiyi gösterir E alt panelinde gösterilen büyük bir birim bir başka ekstraselüler ünitesi ile B43 soma birimin bir çarpışma olduğunu da unutmayın. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 6. Ekstraselüler soma ve sinir kayıtları kullanarak I1/I3 motor nöronların bazı belirlenmesi için iyileştirilmiş tanısal ağacı. Bu tanı yöntemi tanımladı çok daha kolay hale I1/I3 motor nöronları tanımlanması için çok az bilgi gerektirirasma bukkal kütle hazırlama ya da in vivo fy motor nöronları. B3 tespit I1/I3 motor nöronları arasında en büyük BN2 ünitesine sahiptir. Motor nöronlar, B6 ve B9 geri kalanında olduğu sadece iki nöron vardır BN2 ve BN3 hem proje. B9 B6 daha yanal olduğunu. Sadece BN2 üzerinde çıkıntı nöronların geri kalanı da iki gruba ayrılabilir. B10 ve B39 ve bilinmeyen bazı nöronlar içerir bilateral BN2s aracılığıyla nöronlar projelerinden biri grup. Nöronların diğer grup B38, B43 ve B82 içeren, yalnızca BN2 ilgili Tortikollis hedefleniyor. B38 B3 ve B9 yakındır. B82 B8 (bkz. Şekil 3) yakındır. B43 B6 yakındır. Bu beslenmenin BN2 birim desen sonunda küçük ve patlamaları olup.
Şekil 7. Nöron i başarı oranlarının karşılaştırılmasıekstraselüler tekniği veya intrasellüler tekniği kullanarak kuvvet denemeleri sırasında dentification. aynı kuvvet dönüştürücü kurulumu ile, tanımlamak için konvansiyonel intrasellüler tekniği (büyük mor nokta) kullanarak ekstraselüler tekniği (küçük mavi nokta) ve 27 deneyleri kullanarak 35 deneyler yaptım I1/I3 motor nöronlar. X-ekseni deney her tür tespit edilmiştir I1/I3 kas için motor nöronların en sayısını gösterir. Y-ekseni deney her tür yüzdesini başarı oranı gösterir. Örneğin, hücre dışı deneyler 35 19 üzerinden (% 54) halinde, en azından beş farklı I1/I3 motor nöronlar belirlemek mümkün olmuştur. Sadece 1 tanesi intrasellüler deneylerin 27 (% 4), biz en az beş I1/I3 motor nöronlar tespit başardık. Bu nöronların belirlenmesinde başarı oranı hücre dışı tekniği kullanılarak nöron herhangi bir sayı için çok daha yüksek olduğu açıktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu tür yumuşakçalar (örneğin, Lymnaea, Helix, ve Aplysia), motor havuzları analizi gibi büyük tespit nöronları ile hayvanlarda tipik olarak hücre içi kayıt 1,2,3,4 kullanılarak yapılır. Bu protokol, benzersiz bir hücre dışı tekniği kullanılarak bir motor havuzu için motor nöronlarının belirlenmesi için bir işlem açıklanmaktadır. Bu sürecin bir örneği olarak kuvvet ölçümleri kullanılmıştır. Bir de kas innervasyonu ölçmek için EMG kullanabilirsiniz. Kısaca, bunu yapmak için, protokol EMG kayıtlar için I1/I3 kas farklı bölgelerine kanca takmak için elektrotlar değiştirilmiş gerekmektedir.
Hücre dışı teknik yukarıda tarif edilmiş bazı hücre içi teknikleri, üzerinde bazı avantajlara sahiptir. İlk olarak, ekstraselüler tekniği daha az zaman ve deneyler için ganglionlar hazırlamak ve nöronlar daha az hasara neden olacak bir çaba gerektirir. Genellikle, BUC hazırlamak için 20-30 dk sürerintraselüler deneyler için bukkal kütleye bağlı bukkal ganglionlar hazırlamak cal ekstraselüler deneyler için ganglionlar ve yaklaşık 1.5 saat. Zaman geçtikçe kaslar daha az aktif hale gelecektir yana, ganglion hücre dışı deneyler için hazırlıklar ve intraselüler olanlar arasındaki zaman farkı deneylerin başarısı için kritik bir faktör olabilir. Şekil 7 I1 / için motor nöronların belirlenmesi için başarı oranları karşılaştırmasını göstermektedir I3 kas kuvveti çalışmalarda ekstraselüler veya intraselüler tekniği kullanarak. 35 hücre dışı kuvvet deneylerinde (% 100), bu I1/I3 kas için en az bir motor nöron tespit etmek mümkün olmuştur. 35 (% 89) hücre dışı deneyler 31 üzerinden olarak, en azından üç I1/I3 motor nöronlar tespit etmek mümkün olmuştur. Hücre dışı deneyler 35 (% 54) üzerinden 19 olarak, en azından beş farklı I1/I3 motor nöronlar belirlemek mümkün olmuştur. Bunun aksine, hücre içi deneyler ile başarı oranı ile samE kuvvet dönüştürücü kurulum düşüktü. 27 (% 85), hücre içi deneyler 23 üzerinden olarak, en az bir motor nöron I1/I3 tespit etmek mümkün olmuştur. 27 (% 30) hücre içi deney dışarı 8, en az üç I1/I3 motor nöronlar tespit etmek mümkün olmuştur. Intrasellüler deneyler sadece 1 üzerinden 27 (% 4), biz beş I1/I3 motor nöronlar tespit başardık. Bu nedenle, birden fazla aynı ganglion nöronlarının tanımlanması olasılığını daha yüksek hücre içi tekniklerinin tersine ekstraselüler teknikleri kullanılarak edilir.
Buna ek olarak, hücre dışı teknik aynı deney süresince gangliyon her iki tarafında da çok nöronları erişebilir. Genellikle, desheathing sonra, hücre içi elektrotlar desheathed edilmiş ganglion nöronlarının tarafında erişebilir. Hücre içi elektrotları üzerinde nöronlar ulaşmak için Örneğin, iki yanak gangliya (sol tarafta hemiganglion gibi) bir yan kuyruk kadar tutturulmuş olduğu zaman, kolay olacaktırganglion, örneğin B6, B9, B10, B39, B43 ve ancak böyle B4, B5, B8a, B8b, B38 ve B82 gibi ganglion rostral tarafında nöronlar, erişilmesi zor tarafı. Bunun aksine, hücre dışı elektrot ganglion uygun rotasyonu ile aynı bukkal ganglion her iki tarafında da çok nöronları erişebilir. Dönme derecesi ayarlanabilen ve geri dönüşümlüdür. Bu aynı zamanda, birden çok ganglion nöronlarının tanımlanması olasılığını arttırır.
Ekstraselüler elektrotlar yavaşça nöronlar kapsayan kılıf üzerine basıldığında olduğundan, bu elektrotlar zarında büyük delikler oluşturabilir ve hasara neden olabilir, hangi nöronların çıkardı olmayacak gibi kas hareketleri sırasında intrasellüler elektrot ile oluşur. Sinyal büyüklüğü kas hareketleri sırasında ganglion hareket olarak değişecektir. Bazen büyük kas hareketleri sırasında, ekstraselüler soma kayıt sinyalleri azalacak hatta kayıp unutmayın. Ancak, biz mo kolayca yapabilirsiniznöron üzerine ekstraselüler elektrot geri ettik ve orijinal sinyalleri kurtarabilirsiniz. Bu hazırlık farklı davranışsal tepkiler üretir gibi kasları büyük kasılmalar oluşturabilir sırasında davranışsal çalışmalar için askıya bukkal kütle hazırlama 8 ekstraselüler tekniği uygulamak için bu mümkün kılar. Örneğin, 48 asma bukkal kütle deneyleri (% 98) 47 üzerinden, biz I1/I3 kas için, en az bir motor nöron tespit etmek mümkün olmuştur. 48 (% 48) askıya bukkal kütle deneyleri 23 üzerinden, biz en az üç I1/I3 motor nöronlar tespit başardık. 48 (% 23) askıya bukkal kitlesel deneyler üzerinden 11, biz bukkal toplu beslenme gibi davranışlara performans gibi motor desenleri süresince onlardan I1/I3 kas ve kayıt için en az beş motor nöronlar tespit başardık. Hücre dışı tekniği, aynı zamanda, t içerir izole kafa besleme preparatları gibi başka daha karmaşık yarı bozulmamış müstahzarlar için geçerlidirO Tentacles, dudaklar, çene, yanak kütlesi, bukkal ganglionlar ve serebral ganglion 12,24,25,26. Duyusal girdiyi gibi hazırlıklar içinde beslenme davranışları ortaya çıkarmak için çok önemli olduğundan, ekstraselüler tekniği nedeniyle basitlik ve daha az zarar verici özellikler özellikle yararlı olacaktır. Önceki çalışmalarda da bunu tanımlamak ve kronik in vivo 18 B4/B5 kaydetmek mümkün olduğunu göstermektedir. Daha önceki bu deneylerde, araştırmacılar B4/B5 seçici olarak harekete geçirmek için alçak akım (10-20 uA)-BN2 bir uyarım kullanılmış ve kaydı için B4/B5 yukarıda kılıf için kısa bir polietilen tüp yapıştırılmış, içine bükülmüş bir çift yerleştirildi paslanmaz çelik teller. Böylece, bu tespit ve gangliya (Chestek ve Chiel, yayınlanmamış sonuçlar) kaplama kılıf üzerine yapıştırılmış olan polietilen tüp elektrot kullanarak in vivo olarak motor nöronlar kayıt yapmak da mümkündür.
Ekstraselüler tekniği de bazı limitat variyonlar. İlk olarak, ekstraselüler elektrotlar çok küçük veya ganglion içinde çok derin nöronları uyarmak veya kaydetmek için zor olacaktır. Bu hücre dışı uyarım yolu ile, yüzeyde olmayan nöronların aktive etmek için yine de mümkün olduğunu not edin. Ancak, bizim model 5 hedef nöronun komşu nöronlardan daha derin olduğunda stimülasyon özgüllüğü kaybedebilir olduğunu gösterdi. Nöron derin olduğunda, elektrot-to-soma mesafesi mevcut yakındaki diğer yüzey nöronlar aktive kadar yüksek olabilir Bu nöron, etkinleştirmek için gerekli olacak daha fazla ve daha yüksek olacaktır. Bir nöron çok fazla akım ile ekstraselüler uyarılır İkincisi, zarar görebilir ve artık cevap; çok küçük akımlar intraselüler stimülasyon kullanılır, ama çok fazla akım hücre içinde de nöronlar zarar verebilir. Bazen soma kayıt intracel daha az spesifik hedef nöron ve komşu nöronlar, hem çoklu birimler içerecektirlular kaydı. Buna ek olarak, hücre dışı elektrot uyarmak ve eşzamanlı olarak aynı kayıt nöron çünkü kesin olarak kontrol etmek ve daha çok hücre içi tekniğe göre ekstraselüler kullanarak tek bir nöronun ateşleme frekansını izlemek için daha fazla zor olabilir. Ayrıca, ekstraselüler tekniği Premotor nöronlardan sinaptik giriş kaydetmek mümkün olmayacaktır. Buna ek olarak, bunun kılıf 27 çıkarmadan karbakol ile bir ganglion uyarmak için mümkün olduğunu göstermiştir rağmen ganglion, desheathed sürece, belirli bir nöron için iontophoretically nörotransmitter uygulamak için zor olabilir.
Ekstrasellüler tanımlama teknikleri sınırlamaları tespit etmek zordur motor havuzu bazı nöronlar yaptı. O göre B3, B6, B9, B38, B43, ve B82: Bu özel örnekte, hücre dışı teknik güvenilir Aplysia içinde I1/I3 kas için motor nöron en tespitn soma büyüklüğü ve konumu, sinir projeksiyon ve kas innervasyon. Ancak, biz güvenilir B10 ve B39 tespit etmek mümkün olmamıştır. Önceki intrasellüler çalışma 6,7 B10 ve B39 B4/B5 bölge ve B6 bölgesi arasında bukkal gangliyonların kaudal tarafında iki komşu nöronlar olduğunu gösterdi. Hem nöronlar BN2s üzerine bilateral yansıtabilirsiniz. B39 I1/I3 kasın anterior bölgede innerve iken B10, I1/I3 kas orta ve posterior bölgede innerve eder. Soma konumu ve sinir projeksiyon kriterlere dayanarak, bilateral dört farklı deneylerde BN2s üzerine bu proje en fazla iki motor nöronları bulundu. Onların soma yerle kas innervasyonu, ve motor desenleri sırasında aktivite zamanlaması hayvandan hayvana değişken olduğundan, biz onlar aynı nöronlar olsaydı emin değildi. Böylece, güvenilir nedeniyle tutarlılık eksikliği ekstraselüler tekniği kullanılarak B10 ve B39 tespit etmek mümkün değildi. Benzersiz onları tanımlamak için,Biz bukkal gangliyonlarda nöronların daha kapsamlı bir araştırma yapmak gerekir ve bu Premotor nöronların B4/B5 gelen sinaptik giriş ve intraselüler teknikler gerektirir vericileri, verilen cevaplar gibi ek kriterler gerekebilir.
Uygun modifikasyonlar ile, bu yöntem aynı zamanda diğer motorlu havuzları için de geçerlidir, örneğin, Lymnaea stagnalis 2, Helix pomatia 3, hamamböceği 13, I5 kas 10, I2 kas 11, ve Aplysia olarak veya diğer sistemleri için I4 kas 12, örneğin, ve 14 zebrafish. Bir Aplysia içinde I5 kas (aynı zamanda aksesuar radular yakın kas veya ARC 10,28 olarak da bilinir) için motor nöronlar için bu yöntemin uygulanmasına yönelik istiyorsa, örneğin, bir BN2s yerine bukkal kütle bağlı BN3s tutmalı çünkü I5 motor nöronları B15 ve ipsilateral BN3 6,7 üzerinde B16 projesi. Sonra tO bukkal kitle EMG veya kuvvet çalışmaları için I5 kas göstermek için hazırlıklı olmalıdır. Nöronlar güvenilir azaltılmış hazırlanmasında tanımlandıktan sonra, optimize edilmiş bir tanı yöntemi de gelecekteki davranışsal çalışmalar için oluşturulmuş olabilir.
Tarif ettiğimiz tekniği gibi multi-elektrot dizileri ve voltaj duyarlı boya gibi diğer ekstraselüler tekniklerle olumlu karşılaştırır. Hücredışı elektrotlar ve çok elektrot diziler 30 uyarım ve kayıt her ikisi için de kullanılabilir ise voltaj duyarlı boya 29 tekniği, sadece kayıt için kullanılır. Çoklu elektrot dizisi 29 ve voltaj duyarlı boyalar 30 Hem aynı anda birçok nörondan sinyal kaydedebilirsiniz. Tek ekstraselüler elektrot sadece uç boyutu ve elektrot yere bağlı olarak bir veya iki nöronlardan kayıt olsa da, aynı zamanda bir ganglion üzerinde birkaç pozisyon kesinlikle mümkündür ve biz yaptıkBu başarılı. Vitro çoklu elektrot dizi standart 8 x 8 veya 6 x 10 elektrotları 29 sahiptir. Elektrotlar eşit dizi dağıtılan bu yana, genellikle hala bazıları altta yatan nöronlar eşit olarak dağıtılmış değildir çünkü kayıtları, elde edildiği nöronlar ve sinyallerin post-processing önemli, en kimliğini belirlemek için meydan okuyor kitabı, bu belirsizlik çözmek için yapılmalıdır. Hücre dışı elektrotlar tek somata üzerine yerleştirilmesi için Buna zıt olarak, altta yatan nöronun kimlik açıktır. Bu nedenle, çoklu elektrot dizilimi ve voltaj duyarlı boyalar aynı anda birden çok kayıt için daha verimli olabilir gibi görünüyor. Ancak, hücre dışı uyarım ve elektrot teknik kayıt hem de daha iyi seçicilik temin edebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa etmek başka bir şey var.
Acknowledgments
Bu araştırma NIH hibe NS047073 ve NSF hibe DMS1010434 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671 | Biological, Certified |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217 | Certified ACS |
| Magnesium chloride hexahydrate | Acros Organics | 19753 | 99% |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | M63 | Certified ACS |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientifc | C79 | Certified ACS |
| Glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | BioXtra |
| MOPS buffer | Acros Organics | 17263 | 99% |
| Carbachol | Acros Organics | 10824 | 99% |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | SS255 | Certified |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA49 | Certified |
| Single-barreled capillary glass | A-M Systems | 6150 | |
| Flaming-Brown micropipette puller model P-80/PC | Sutter Instruments | Filament used: FT345B | |
| Enamel coated stainless steel wire | California Fine Wire | 0.001D, coating h | |
| Household Silicone II Glue | GE | ||
| Duro Quick-Gel superglue | Henkel corp. | ||
| A-M Systems model 1700 amplifier | A-M Systems | Filter settings: 10-500 Hz for the I2 nerve/muscle; 300-500 Hz for all the other nerves | |
| Pulsemaster Multi-Channel Stimulator | World Precision Instruments | A300 | |
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A360 | |
| AxoGraph X | AxoGraph Scientific | Software for recordings | |
| Gold Connector Pins | Bulgin | SA3148/1 | |
| Gold Connector Sockets | Bulgin | SA3149/1 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Dow Corning | ||
| 100 x 15 mm Crystalizing Dish | Pyrex | ||
| High Vacuum Grease | Dow Corning | ||
| Pipet Tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Modeling Clay | Sargent Art | 22-4400 | |
| Whisper Air Pump | Tetra | 77849 | |
| Aquarium Tubing | Eheim | 7783 | 12/16 mm |
| Elite Airstone | Hagen | A962 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 |
References
- McCrohan, C. R., Benjamin, P. R. Synaptic relationships of the cerebral giant cells with motoneurones in the feeding system of Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 85, 169-186 (1980).
- Benjamin, P. R., Rose, R. M. Central generation of bursting in the feeding system of the snail, Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 80, 93-118 (1979).
- Peters, M., Altrup, U. Motor organization in pharynx of Helix pomatia. J. Neurophysiol. 52 (3), 389-409 (1984).
- Church, P. J., Cohen, K. P., Scott, M. L., Kirk, M. D. Peptidergic motoneurons in the buccal ganglia of Aplysia californica: immunocytochemical, morphological, and physiological characterizations. J. Comp. Physiol. A. 168 (3), 323-336 (1991).
- Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia. J. Neural. Eng. 5 (3), 287-309 (2008).
- Church, P. J., Lloyd, P. E. Expression of diverse neuropeptide cotransmitters by identified motor neurons in Aplysia. J. Neurosci. 11 (3), 618-625 (1991).
- Church, P. J., Lloyd, P. E. Activity of multiple identified motor neurons recorded intracellularly during evoked feedinglike motor programs in Aplysia. J. Neurophys. 72 (4), 1794-1809 (1994).
- McManus, J. M., Lu, H., Chiel, H. J. An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica. J. Vis. Exp. (70), e4320 (2012).
- Cullins, M. J., Chiel, H. J. Electrode fabrication and implantation in Aplysia californica for multi-channel neural and muscular recordings in intact, freely behaving animals. J Vis. Exp. (40), e1791 (2010).
- Zhurov, Y., Weiss, K. R., Brezina, V. Tight or loose coupling between components of the feeding neuromusculature of Aplysia. J. Neurophysiol. 94 (1), 531-549 (2005).
- Hurwitz, I., Goldstein, R. S., Susswein, A. J. Compartmentalization of pattern-initiation and motor functions in the B31 and B32 neurons of the buccal ganglia of Aplysia californica. J. Neurophysiol. 71 (4), 1514-1527 (1994).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. The timing of activity in motor neurons that produce radula movements distinguishes ingestion from rejection in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 173 (5), 519-536 (1993).
- Iles, J. F. Structure and synaptic activation of the fast coxal depressor motoneurone of the cockroach. Periplaneta americana. J. Exp. Biol. 56 (3), 647-656 (1972).
- Westerfield, M., McMurray, J. V., Eisen, J. S. Identified motoneurons and their innervation of axial muscles in the zebrafish. J. Neurosci. 6 (8), 2267-2277 (1986).
- Susswein, A. J., Rosen, S. C., Gapon, S., Kupfermann, I. Characterization of buccal motor programs elicited by a cholinergic agonist applied to the cerebral ganglion of Aplysia californica. J. Comp. Physiol. A. 179 (4), 509-524 (1996).
- Hurwitz, I., Neustadter, D., Morton, D. W., Chiel, H. J., Susswein, A. J. Activity patterns of the B31/B32 pattern initiators innervating the I2 muscle of the buccal mass during normal feeding movements in Aplysia californica. J. Neurophys. 75 (4), 1309-1326 (1996).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 172 (1), 17-32 (1993).
- Warman, E. N., Chiel, H. J. A new technique for chronic single-unit extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes. J. Neurosci. Methods. 57 (2), 161-169 (1995).
- Nargeot, R. N., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Contingent-dependent enhancement of rhythmic motor patterns: an in vitro analog of operant conditioning. J. Neurosci. 17 (21), 8093-8105 (1997).
- Kandel, E. R. Behavioral biology of Aplysia. , Freeman. San Francisco. (1979).
- Scott, M. L., Govind, C. K., Kirk, M. D. Neuromuscular organization of the buccal system in Aplysia californica. J. Comp. Neurol. 312 (2), 207-222 (1991).
- Rosen, S. C., Miller, M. W., Cropper, E. C., Kupfermann, I. Outputs of radula mechanoafferent neurons in Aplysia are modulated by motor neurons, interneurons, and sensory neurons. J. Neurophysiol. 83 (3), 1621-1636 (2000).
- Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia. J. Neurophysiol. 83 (3), 1605-1620 (2000).
- Weiss, K. R., Chiel, H. J., Koch, U., Kupfermann, I. Activity of an identified histaminergic neuron, and its possible role in arousal of feeding behavior in semi-intact Aplysia. J. Neurosci. 6 (8), 2403-2415 (1986).
- Rosen, S. C., Teyke, T., Miller, M. W., Weiss, K. R., Kupfermann, I. Identification and characterization of cerebral-to-buccal interneurons implicated in the control of motor programs associated with feeding in Aplysia. J. Neurosci. 11 (11), 3630-3655 (1991).
- Jing, J., Weiss, K. R. Generation of variants of a motor act in a modular and hierarchical motor network. Curr. Biol. 15 (19), 1712-1721 (2005).
- Azizi, F., Lu, H., Chiel, H. J., Mastrangelo, C. H. Chemical neurostimulation using pulse code modulation (PCM) microfluidic chips. J. Neurosci. Methods. 192 (2), 193-198 (2010).
- Zhurov, Y., Proekt, A., Weiss, K. R., Brezina, V. Changes of internal state are expressed in coherent shifts of neuromuscular activity in Aplysia feeding behavior. J. Neurosci. 25 (5), 1268-1280 (2005).
- Baker, B. J., Kosmidis, E. K., Vucinic, D., Falk, C. X., Cohen, L. B., Djurisic, M., Zecevic, D. Imaging brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes. Cell. Mol. Neurobiol. 25 (2), 245-282 (2005).
- Fejtl, M., Stett, A., Nisch, W., Boven, K. -H., Möller, A. On Micro-Electrode Array Revival. Advances in Network Electrophysiology Using Multi-Electrode Arrays. Baudry, M., Taketani, M. , Springer Press. New York. 24-37 (2006).
