Summary
유전자 인코딩 optogenetic 도구에서 특정 뉴런의 비 침투 조작을 수
Abstract
유전자 인코딩 도구의 수가 증가하고 Drosophila melanogaster 1 특정 뉴런의 신경 활동의 비 침습적 조작을 허용 가능 해지고 있습니다. 이 중 최고는 밝은 빛을 사용하여 온전하고 자유롭게 움직이는 동물에서 특정 뉴런의 활성화 또는 입을 수 있도록 optogenetic 도구입니다. Channelrhodopsin (ChR2)는 푸른 빛에 의해 활성화 될 때를 표현 뉴런의 탈분극을 초래, 밝은 활성화 양이온 채널입니다. ChR2는 CO 2 회피, 코 확장 및 대형 섬유 매개 펄쩍 뛰게하다 응답 2-4과 같은 특정 행동에 대한 중요한 뉴런을 식별위한 효과적인 왔습니다. 그러나, 또한 ChR2을 자극 photoreceptors를 자극하는 데 사용되는 강렬한 광원으로,이 optogenetic 기술은 이전 영상 시스템에 사용되지 않았습니다. 여기, 우리는 데모로 phototransduction을 impairs 돌연변이로 optogenetic 접근 방식을 결합파리의 광 엽, Foma-1 뉴런의 직기에 민감한 뉴런의 클러스터의 활성화를 nstrate, 충돌을 피하기 위해 사용하는 탈출의 행동을 유도 할 수 있습니다. 우리는 phototransduction 층계의 중요한 구성 요소의 널 allele을 사용 norpA 유전자에 의해 인코딩 phospholipase C-β는 장님이 날아 렌더링하고 있으며, Foma-1 ChR2의 표현을 유도 할 Gal4-UAS 전사 활성 시스템을 사용하는 뉴런. 개별 파리는 푸른 LED가 둘러싸인 작은 플랫폼에 배치됩니다. LED가 조명 때, 시각적으로 구동 직기 - 탈출의 행동과 비슷한 방식으로, 비행으로 신속하게 이륙 이동합니다. 우리는이 기술을 쉽게 자유롭게 파리를 이동 다른 행동을 조사하도록 구성 될 수 있다고 생각합니다.
Introduction
유전자 인코딩 도구의 성장 아스날이 Drosophila melanogaster 1 특정 셀의 신경 활동을 조작하기 위해 개발되었습니다. 이 도구는 온전하고 자유롭게 움직이는 동물에서 특정 뉴런의 비 침투 활성화 또는 입을 할 수 있습니다. 이 시간적으로 통제하고 빠르게 유도 할 수 있기 때문에이 중, Channelrhodopsin2 (ChR2), 빛 활성 양이온 채널, 주요 장점을 제공합니다. 경우 명시 적 ChR2은 그들이 빠르게 depolarize 3 ~ 5 높은 발사 속도를 나타내는 밝은 파란색 (470 nm 정도) 빛에 노출되는 뉴런. 자유롭게 움직이는 동물에서 특정 뉴런의 이러한 목표 활성화는 CO 2 회피 3, 코 확장 2,4, 그리고 거대한 섬유 매개 펄쩍 뛰게하다 응답 4와 같은 행위에 대한 특정 뉴런의 자족을 공개했다. 그러나, ChR2을 자극 할 필요가 강렬한 광원으로도 조합을 적용, photoreceptors을 자극시각 시스템에 togenetic 기술이 제한되었습니다. phototransduction을 impairs 돌연변이가있는 optogenetic 접근 방식을 결합하여, 우리는 파리의 광 엽의 뉴런의 특정 클러스터의 활성화가 충돌 6 방지하는 데 사용되는 탈출 행동을 유도 할 수있는 증명하고있다.
대부분 경우 모든 시각적 인 동물은 다가오는 객체와 충돌을 피하기 위해 탈출 행동을 나타냅니다. 나타난 충돌로 제시 할 때 파리를 산책하거나 고정, 멀리 다가오는 충돌 7-9에서 비행기로 이륙. 이러한 테이크 오프는 이륙과 불안정한 비행 궤적 10,11 이전 제기 날개를 특징으로하고 있습니다. 이 응답은 거대한 섬유 매개 펄쩍 뛰게하다 응답 제기 날개 앞에는되지 점프 별개이며, 일반적으로 자유 낙하 회전식 4,9의 결과. uniqu있는 광 엽, Foma-1 뉴런에 직기 민감한 뉴런의 특정 클러스터를 식별 것으로일리가 접근 객체를 인코딩 조정, 우리는 파리의 직기 이스케이프 동작에서의 참여를 조사 모색하고 있습니다. 여기 선택적으로 이러한 뉴런을 활성화하고 파리의 탈출 행동을 유도 할 수 optogenetics의 사용을 보여줍니다.
우리는 Foma-1 뉴런에 ChR2의 표현을 유도 할 Gal4-UAS 전사 활성 시스템을 사용합니다. ChR2는 cofactor는 모든 횡단 망막 필요하며이 작업은 Drosophila 중추 신경 시스템의 낮은 수준에서 발견됩니다로는 파리 '의 음식에 보충해야합니다. 밝은 빛이 ChR2를 활성화하는 데 사용되는 파리는 강력한 phototactic 행동을 전시하고 있습니다 3,4으로 12 우리는 자극에 대한 시각적 반응의 가능성을 제거하기 위해 모색하고 있습니다. 이 작업을 수행하려면, 우리는 phototransduction 층계의 중요한 구성 요소 phospholipase C-β를 인코딩 norpA 유전자의 null이 allele에 대한 homozygous 돌연변이했다 동물을 사용했습니다. 이러한 돌연변이 파리의 Photoreceptors는 책임을 할 수 없습니다d는 13 불입니다. 탈출 응답의 optogenetic 자극을 테스트하기 위해, 우리는 하나의 플라이를 분리하고 밝은 푸른 빛에 목욕을해야합니다. 이 작업을 수행하기 위해, 우리는 pipet 팁에서 개별 파리 배치합니다. 하나 pipet 팁은 파리가 geotactically 팁을 걸어 그러한와 아웃 사각형 플랫폼으로 사용자 정의 홀더에 배치됩니다. 파리가 자유롭게이 플랫폼의 상단에 돌아 다닐 할 수 있습니다. 플랫폼은 플랫폼의 상단에 초점을 맞춘 네 푸른 색 LED 배열, 각 포함 3 개의 LED로 둘러싸여 있습니다. 파리가 플랫폼에 후, LED를 조명하고 있으며, 파리의 응답은 고속 카메라 6을 사용하여 기록됩니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Channelrhodopsin의 파리를 생성
- 선택한 Gal4 드라이버 크로스 UAS-ChR2 파리, 우리는 광 엽의 Foma-1 뉴런에 표시됩니다 G105-Gal4를 사용합니다.
- 푸른 빛의 자극에 대한 시각적 반응의 가능성을 제거하려면 두 플라이 라인 아 + norpA 배경에 있습니다.
- 최종 결과 : w + norpA, G105-Gal4/UAS-ChR2 +
- 어른 eclose을 날아 후 행동 분석을 수행하기 전에 3 일 동안 10 μM 모든 횡단 망막 (ChR2에 필요한 공동 요소)와 빛으로부터 보호와 함께 보충 신선한 음식,에 선택한 여자를 넣어.
2. 10 μM 올 횡단 망막 강화 식품을
- 20 MM은 망막하기 위해 95 % 에탄올의 17.6 ML의 모든 횡단 망막의 100 밀리그램을 분해. 모든 트랜스 - 망막은 항상 빛으로부터 보호하세요.
- 전자 레인지에서 표준 cornmeal이 나는 음식을 녹여, 따뜻한 터치까지 시원 보자.
- 20 MM 50 μl를 혼합플라이 식품의 10 ML 병에 모든 횡단 망막.
- 튜브는 냉각과 빛으로부터 보호 하세.
3. 장비
- Pipet 도움말 : 표준 1,000 μl pipet 팁은 ~ 2.25 mm의 구멍 직경을 만들어, 끝 가까이에 절단됩니다.
- 플랫폼 (그림 1 참조).
- Delrin베이스는 17cm X 25cm는 ¼ "NPT 냉각수 호스 커넥터에 맞게 각 모서리의 나사 구멍 건설되었습니다.
- Delrin로 만든 수직 홀더는,베이스의 중심에 부착되어 있습니다. 전체 크기는 X 40mm X 65mm (폭 X 깊이 X 높이) 25mm입니다. 10mm 폭 홈은 맨 아래에 엄지 나사과 함께 홀더의 길이를 실행합니다. 플랫폼 홀더의 상단에 부착, 25mm X 40mm 홀더의 홈과 정렬 3.5 mm 직경의 구멍 X 10mm.입니다
- LED 배열 (그림 1 참조).
- 냉각수 호스의 네 팔은 ~ 18cm 길이, 플랫폼 BAS에 부착된다냉각수 호스 커넥터를 사용하여 전자. 냉각수 호스는 구조 지원으로 만 사용되며 냉각 목적으로 사용되지 않습니다.
- 제대로 간격 그루브는 각 팔의 끝 부분에 부착 히트 싱크를 각 팔을 뿌리고 냉각수의 마지막 작품으로 절단됩니다.
- 파란색 LED가 반란군 트라이 스타는 사전 컷 열 접착 테이프를 사용하여 각 히트 싱크에 장착되어 있습니다. Carclo 18 ° 트라이 렌즈는 각각의 트라이 스타에 부착되어 있습니다.
- LED 트라이 스타는 BuckPuck DC 드라이버와 같은 지정된 전원 공급 장치에 유선 수 있습니다. 우리는 각 BuckPuck이 시리즈의 두 트라이 별 전원과의 설정을 준비하고 있습니다.
- 네 가지의 조명은 700에서 트라이 별 LED mA은 우리의 플랫폼에 713 W / m 2 조사량이 나왔고.
- 카메라 : 카메라는 작은 삼각대에 장착하고 플랫폼의 상단에 중점을두고 있습니다.
4. 행동 분석
- 간단히 얼음에 파리가 마취시키다.
- 종료 테이프를 사용하여, pipet 팁에서 개별의 파리를 삽입둘 다 끝의 끝납니다.
- 파리는 awoken하고 적극적으로 pipet 팁을 답사 한 후, 테이프를 제거하고 수직 홀더의 홈에 pipet를 놓습니다. 나비 나사는 장소에 pipet 팁을 확보하고 팁의 바닥을 닫습니다하는 데 사용됩니다.
- 파리가 pipet 팁을 (일반적으로 30-60 초) 탐구으로 파리가 플랫폼으로 끝에서 나온다는 전에 카메라 녹화를 시작합니다.
- 파리가 플랫폼에 등장 후, 1-2 seco를 기다렸는데, 파란색 LED가 켜십시오. 파리가 비행을 시작 할 때까지 수동으로 시간을 측정하는 타이머를 사용합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
맹인 중 하나 ChR2 나 혼자 G105 드라이버 밝은 푸른 빛의 조명에 따라 이륙의 낮은 속도를 보여을 표현 이동합니다. 맹인이 테이크 오프이 파란색 빛과 조명으로 인해 자연이었다 아닌 것을 제안에 관계없이 조명 (그림 2)의 이륙 같은 속도를 전시 이동합니다. ChR2이 Foma1 뉴런으로 표현 될 때, 그러나, 푸른 빛 조명이 탈출 응답을 elicits. 테스트 파리의 50 % 이상은 조명의 1 초 이내에 이륙, 5 초 내에 75% (그림 2). 반면, 제어 파리의 10 %가 1 초 이내에 이륙, 5 초 내 20 %. G105 드라이버가 Foma-1 뉴런과 버섯 몸의 γ-엽에 모두 표현으로, 우리는 특별히 추가 컨트롤로 버섯 본문 (201Y-Gal4)의이 부분에 표현 드라이버를 사용했습니다. 이 파리는 (그림 2 수행 한 다른 컨트롤과 비슷한 이륙의 속도를 전시), Foma-1 뉴런의 optogenetic 활성화 탈출 응답을 elicited 것을 구체적으로 나타냅니다.
optogenetically 유도 응답 초당 200 프레임 촬영 고속 영상이 응답 베틀-evoked 탈출 동작 (그림 3)과 유사 있다고 밝혔다. 즉, 파리의 90 %는 사전 이륙 (N = 30) 6 자신의 날개를 제기 촬영. 또한, 다음의 비행 궤적은 파리의 몸이 다소 수직 방향 (그림 3)에 빠진 함께 테이크 오프 10 자발적으로보다 안정하지만, 거대 섬유 매개 응답 아홉보다 더 안정적입니다.
그림 1. 수직 홀더 그들에게 부착 LED 배열 방열판을 들고 팔을 뿌리고 네 개의 냉각수와 플랫폼을 보여주는 설정 실험., 주위 조명에 따라 설정. B, 설정 LED는 조명 때. C, 히트 싱크의 LED 트라이 스타의 가까이보기. D, 트라이 - 렌즈 첨부로 트라이 스타의 최대 가깝습니다. E, Buckpuck 드라이버 및 LED 회로의 개략도. F, BuckPuck 및 LED 회로를위한 회로 다이어그램.
그림 2. 실험 및 제어 플라이 라인에 대한 탈출 점프 시간의 누적 히스토그램. 모든 파리 명시 w + norpA들을 시각적으로 맹인 렌더링합니다. "Foma-1"파리는 G105-Gal4 드라이버가; "메가바이트"파리는 버섯 본문에 표현을 유도 201Y - Gal4 드라이버를 갖추고 있습니다.
그림 3. ChR2 유도 탈출 응답의 고속 비디오 프레임. 프레임은 필연의 결과 번호가 매겨집니다ially 프레임 사이에 5 밀리 초와.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
우리는 밝은 푸른 빛으로 파리를 도보로 자유롭게 수영하여 도망가는 방법을 optogenetic 자극을 보여주고 있습니다. 이 접근 방식은 쉽게 자유롭게 도보로 파리에서 다른 행동을 조사하도록 구성 할 수 있으며, 단순히 우리가 더 큰 영역 사용되는 LED 배열을 기와 지붕으로 더 큰 플랫폼으로 확장 할 수 있습니다. 사용자가 재단사, 우리가 설명 저렴한 카메라, 또는 기타 사용 가능한 카메라 시스템 중 하나를 할 수 사용하여 이미지의 프레임 속도와 공간 해상도는 관심의 동작에 맞게 인수했습니다. 파란색 LED가 카메라뿐만 아니라 ChR2의 활성화를 위해 조명을 제공하는 LED가, 조명 된 후에 또한, 우리의 영상은 시간으로 제한됩니다. 이 우리의 행동에 대한 충분하지만, 이전의 LED 조명에 파리의 위치 나 운동 기록해야하는 경우, 카메라의 적절한 필터링과 결합 적외선 범위에서 신호를 제공하는 추가 광원이 통합 될 수 있습니다.
_content는 "> Optogenetics 널리 신경 활동을 조작 할 수있는 비 침습적 방법으로 찬사되었습니다. 그러나,이 기법은 시각적 인 경로를 활성화합니다 ChR2를 활성화하는 데 사용되는 빛으로 영상 시스템에 주로 사용할 수있다. 또한, optogenetics의 사용 비 시각적 행동을 알아 내기도 밝은 빛에 파리 'phototactic 응답 방해 할 수있다. 시각 맹인 norpA의 파리의 사용은 우리가 시각적으로 시스템에 optogenetic 도구를 사용 할 수 있도록, 다른 행동을 왜곡시키지에서 phototaxis을 방지 할 수 있습니다.이 프로토콜은 ChR2이 파리는 모든 횡단 망막 공급하는 것이, 선택의 뉴런으로 표현하도록하고, 파리는 밝은 파란색 불빛이 몸을 감싸서 있어야합니다. 우리가 개발 한 프로토콜은 이러한 요구 사항을 충족, 아직 완전히 최적화되지 않았습니다. 예를 들어, 우리는 우리가 사용하는 빛의 양이 필요 이상으로 밝게하고, 모든 횡단 망막, 이상 높은 농도가 TI를 공급하는 수도 생각나, 이륙 높은 요금이 발생할 수 있습니다. 우리는 체계적으로 이러한 매개 변수를 확인하지 않았습니다.
우리가 활성화 Foma-1 뉴런은 파리의 lobula 단지에서 발견되며, 따라서 뇌의 배면에 가까운 자리 잡고 있습니다. 그것은 빛이 ChR2을 활성화 파리의 큐티클을 통과해야하기 때문에이 실험의 성공은 가까운 표면에되는 뉴런에 의존 가능성이 있습니다. 따라서, 뇌에 깊이 자리 잡고 세포가이 방법을 사용 활성화되지 않을 수 있습니다.
G105 드라이버가 광 엽의 각면에 5 뉴런의 클러스터로 표현되며, Foma-1 뉴런뿐만 아니라 버섯 몸의 γ-엽의 뉴런에 있습니다. 다행히, 우리는 탈출 행동에 버섯 몸 뉴런의 역할을 제거하기 위해 제어 실험을 할 수있는 드라이버를했다. 그러나, 여부는 모든 10 Foma-1 뉴런의 활성화가 거기에 있는지 여부를이 문제가 필요하거나하는 경우에만 하나 또는 두 개의특정 셀 충분이 시간에 결정 할 수 없습니다. 보다 구체적인 드라이버가 개발하고, 표현을 제한 교차 전략 1,14를 수정하기 때문에, 우리는 더 큰 특이성과 뉴런을 타겟팅 할 수 있도록 기대합니다.
Cryptochromes은 circadian 리듬과 파란색 빛에 민감한 행동에 참여 photoreceptors 있습니다. 이 프로토콜에서 cryptochromes 가능성이 높습니다 ChR2를 자극하는 데 사용되는 푸른 빛에 의해 활성화됩니다. 이 (푸른 빛이 Foma-1 뉴런에 ChR2를 cryptochromes를 활성화 아니라하는) 제어 파리에서 관찰 이륙의 낮은 속도로, 여기를 관찰 테이크 - 오프 동작에 영향을 나타나지 않는 것은 밀접하게 소요될의 속도를 일치 오프 제어에서 관찰이 조명없이하거나 녹색 빛 (cryptochromes을 활성화하지 않는)과 조명 이동합니다. 그러나,보다 직접적으로 cryptochromes에 의해 영향을하는 다른 행동에 대해이 문제가 증명 수도 있습니다. 하나의 가능성이러한 일을 방지하기 위해 개선 노란색, 589 nm의 빛 15 활성화 적 방편 channelrhodopsin의 사용이 될 수 있습니다.
우리의 실험에서, 우리는의 자발적인 오프를 같은 그 ~ 제어 파리의 10 %가 LED 조명의 1 초 이내에 이륙, 5 초 내에 13-28%. 낮은 수준을 관찰 파리는 효과적으로 어떤 조명없이 ChR2뿐만 아니라 파리가 활성화되지 않았습니다 녹색 빛으로 조명을 때 우리는 이륙이 같은 속도를 관찰, 우리는 이러한 자연 항공편보다는 빛을 유도 테이크 오프 있다고 생각합니다. 탈출 행동에 Foma-1 뉴런의 ChR2 활성화의 효과 따라서이 자발적인 활동의 상단에서 측정해야합니다. 파리 전에 테스트 행동의 실행에 플랫폼에서 탈출하는 경우에는 이륙을 포함하지 않는 다른 동작의 경우이 해지 시험 될 수 있습니다. 이러한 자연 탈출이 실험 불편을 대표 할 수있는 범위 obvio입니다관심 행동 timescale에 usly 따라.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 스탠포드 딘의 휄로 십 (SEJdV), 건강 감독 개척자 상 국립 연구소 (TRC DP0035350), 일행 재단 학술의 상 (TRC)와 R01 EY022638 (TRC)에 의해 재정 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| All-trans Retinal | Advance Scientific Chemical Inc | R3041 | |
| Equipment | |||
| Heat Sink 9.2 C/W | Luxeonstar | LPD30-30B | 30 mm square X 30 mm high |
| Carclo 18 ° Tri-Lens | Luxeonstar | 10507 | |
| Blue Rebel LED on Tri-Star Base | Luxeonstar | MR-B0030-20T | 470 nm, 174 lm @ 700 mA. |
| 700 mA BuckPuck DC Driver | Luxeonstar | 3021-D-E-700 | |
| Wiring Harness for BuckPuck Driver | Luxeonstar | 3021-HE | |
| Pre-cut thermal adhesive tape | Luxeonstar | LXT-S-12 | 20 mm Hex Base |
| Snap-Loc Coolant Hose, ¼" ID | McMaster-Carr | 5307K49 | |
| Snap-Loc Coolant Hose Connector | McMaster-Carr | 5307K39 | ¼" NPT Male |
| Laboratory Grade Switching Mode Programmable DC Power Supply | BK Precision | 1698 | |
| Exilim camera | Casio | EX-FH20 | |
References
- Venken, K., Simpson, J., Bellen, H. Genetic manipulations of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
- Gordon, M., Scott, K. Motor control in a Drosophila taste circuit. Neuron. 61, 373-384 (2009).
- Suh, G. S. B., et al. Light activation of an innate olfactory avoidance response in Drosophila. Current Biology. 17, 905-908 (2007).
- Zhang, W., Ge, W., Wang, Z. A toolbox for light control of Drosophila behaviors through Channelrhodopsin 2-mediated photoactivation of targeted neurons. European Journal of Neuroscience. 26, 2405-2416 (2007).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Science. 100, 13940-13945 (2003).
- de Vries, S., Clandinin, T. Loom-sensitive neurons link computation to action in the Drosophila visual system. Current Biology. 22, 353-362 (2012).
- Card, G. Escape behaviors in insects. Current Opinion in Neurobiology. 22, 1-7 (2012).
- Card, G., Dickinson, M. H. Visually mediated motor planning in the escape response of Drosophila. Current Biology. 18, 1300-1307 (2008).
- Fotowat, H., Fayyazuddin, A., Bellen, H. J., Gabbiani, F. A novel neuronal pathway for visually guided escape in Drosophila melanogaster. Journal of Neurophysiology. 102, 875-885 (2009).
- Card, G., Dickinson, M. H. Performance trade-offs in the flight initiation of Drosophila melanogaster. The Journal of Experimental Biology. 211, 341-353 (2008).
- Hammond, S., O'Shea, M. Escape flight initiation in the fly. Journal of Comparative Phsyiology A. 193, 471-476 (2007).
- Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. PNAS. 58, 1112-1119 (1967).
- Bloomquist, B., et al. Isolation of a putative phospholipase C gene of Drosophila, norpA, and its role in phototransduction. Cell. 54, 723-733 (1988).
- Gohl, D., et al. A versatile in vivo system for directed dissection of gene expression patterns. Nature Methods. 8, 231-237 (2011).
- Zhang, F., et al. Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox cateri. Nature Neuroscience. 11, 631-633 (2008).
