Summary
Genetisk kodede optogenetic værktøjer muliggør invasiv manipulation af specifikke neuroner i
Abstract
Et stigende antal genetisk kodede værktøjer på vej, som tillader ikke-invasiv manipulation af den neurale aktivitet af specifikke neuroner i Drosophila melanogaster 1. Chief blandt disse er optogenetic værktøjer, der gør det muligt for aktivering eller undertrykkelse af bestemte neuroner i den intakte og frit flytte dyr ved hjælp af skarpt lys. Channelrhodopsin (CHR2) er en lysaktiveret kation-kanal, der, når de aktiveres af blåt lys, forårsager depolarisering af neuroner, som udtrykker det. CHR2 har været effektiv til at identificere neuroner kritiske for aktivitet, såsom CO 2 unddragelse, snabel udvidelse og gigant-fiber medieret respons på lyd 2-4. Da de stærke lyskilder anvendes til at stimulere CHR2 også stimulere fotoreceptorer har disse optogenetic teknikker ikke tidligere været anvendt i det visuelle system. Her kombinerer vi en optogenetic tilgang med en mutation, som forringer fototransduktionen til demonstrate at aktivering af en klynge af væven-følsomme neuroner i flue optiske lap, FOMA-1 neuroner, kan køre en flugt adfærd bruges til at undgå kollision. Vi anvendte en nul allel af et kritisk element i lysoverførelsen, til phospholipase C-β, der kodes for af norpA genet, gør flyver blinde og også bruge Gal4-UAS transkriptionsaktivator system til at drive ekspression af CHR2 i Foma-1 neuroner. Individuelle fluer er placeret på en lille platform omgivet af blå lysdioder. Når lysdioderne lyser, den flyver hurtigt take-off i flyvning, på en måde der ligner visuelt drevet væven-escape adfærd. Vi mener, at denne teknik kan let tilpasses til at undersøge andre adfærd i frit flytte fluer.
Introduction
Et stigende arsenal af genetisk kodede værktøjer er blevet udviklet til at manipulere neurale aktivitet i specifikke celler i Drosophila melanogaster 1. Disse værktøjer gør det muligt noninvasive aktivering eller undertrykkelse af bestemte neuroner i den intakte og frit flytte dyr. Blandt disse giver Channelrhodopsin2 (CHR2), en lysaktiveret kation-kanal, vigtige fordele, eftersom den kan temporært reguleres og hurtigt induceres. Når neuroner, som udtrykker CHR2 er udsat for lys blå (470 nm) lys, de hurtigt depolarisere og udviser forhøjede fyring satser 3-5. En sådan målrettet aktivering af specifikke neuroner i frit bevægelige dyr har afsløret tilstrækkeligheden af bestemte neuroner for adfærd, såsom CO 2 unddragelse 3, snabel udvidelse 2,4, og gigant-fiber medierede startle svar 4. Men da de intense lyskilder nødvendige for at stimulere CHR2 også stimulere fotoreceptorer, anvender optogenetic teknikker til det visuelle system har været begrænset. Ved at kombinere en optogenetic tilgang med en mutation, som forringer fototransduktionen har vi vist, at aktivering af en bestemt klynge af neuroner i flue optiske lap kan drive escape opførsel anvendes til at undgå kollision 6.
De fleste, hvis ikke alle, visuelle dyr udviser en flugt adfærd for at undgå kollisioner med modkørende objekter. Gåture eller stationær fluer, når de præsenteres med en truende kollision, take-off i flugt, væk fra modkørende kollision 7-9. Disse take-offs er kendetegnet ved hævede vinger før take-off og en ustabil flyveveje 10,11. Denne reaktion er forskellig fra den gigantiske fiber medieret startle response, hopper, der ikke indledes med hævede vinger, og som regel resultere i en frit faldende tørre 4,9. Efter at have identificeret en bestemt klynge af væven følsomme neuroner i den optiske lap, Foma-1 neuroner, som er UNIQUely tunet til at indkode nærmer objekter, vi søgte at sondere deres engagement i flue Loom flugt adfærd. Her har vi demonstrere brugen af optogenetics til selektivt at aktivere disse neuroner og fremkalde fluen flugt adfærd.
Vi bruger den Gal4-UAS transkriptionsaktivator system til at drive ekspressionen af CHR2 i FOMA-1 neuroner. CHR2 kræver cofaktor all-trans-retinal og da dette er fundet i lave niveauer i Drosophila centralnervesystemet den skal suppleres i fluerne "kost. 3,4 Som skarpt lys anvendes til at aktivere CHR2 og fluer udviser stærke phototactic adfærd 12, har vi forsøgt at eliminere muligheden for en visuel reaktion på stimulus. For at gøre dette har vi benyttet dyr, der var homozygote mutant i en nul-allel af norpA genet, som koder for et afgørende element i lysoverførelsen, phospholipase C-β. Fotoreceptorer i sådanne mutante fluer er i stand til at respond til lys 13. For at teste optogenetic stimulering af flugt reaktion, er vi nødt til at isolere en enkelt flue og bade det i lyse blå lys. For at gøre dette, vi anbringe de enkelte fluer i pipettespidser. En pipettespids er anbragt i en tilpasset holder, således at flyve geotactically vil gå op spidsen og ud på en rektangulær platform. Fluen er i stand til frit gå rundt på toppen af denne platform. Platformen er omgivet af fire blå LED arrays, der hver indeholder tre lysdioder, der fokuserer på toppen af platformen. Efter fluen er på platformen, er lysdioderne lyser, og fluen svar er optaget på en high-speed kamera 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generer Channelrhodopsin Fluer
- Cross UAS-CHR2 fluer med Gal4 driver efter eget valg, vi bruger G105-Gal4, som er udtrykt i FOMA-1 neuroner i den optiske lap.
- For at eliminere muligheden for en visuel reaktion på det blå lys stimulation, begge flueliner er i aw + norpA baggrund.
- Slutresultat: w + norpA; G105-Gal4/UAS-ChR2 +
- Efter voksen flyver eclose, sætte udvalgte kvinder på friske fødevarer, suppleret med 10 pM all-trans-retina (en co-faktor, der kræves for CHR2) og beskyttet mod lys, i 3 dage, før du udfører det adfærdsmæssige assay.
2. Lav 10 uM All-trans-retinal Enhanced Food
- Opløs 100 mg af all-trans-retinal i 17,6 ml 95% ethanol at 20 mM retinal. Hold all-trans-retinal beskyttet mod lys på alle tidspunkter.
- Smelt standard cornmeal flyve mad i mikrobølgeovn, og lad det køle indtil den er varm at røre ved.
- Mix 50 pi af 20 mMall-trans-retinal i hætteglas på 10 ml flue fødevarer.
- Lad hætteglas afkøle og holde beskyttes mod lys.
3. Udstyr
- Pipettespidser: Standard 1000 ul pipettespidser er skåret i nærheden af spidsen, hvilket skaber en porediameter på ~ 2,25 mm.
- Platformen (se figur 1).
- En Delrin base, 17 cm X 25 cm, konstrueret med gevindhuller i hvert hjørne til at passe ¼ "NPT kølevæske slangekoblinger.
- En lodret holder, er fremstillet af Delrin, er fastgjort til midten af basen. De overordnede mål er 25 mm x 40 mm x 65 mm (bredde x dybde x højde). En 10 mm bred rille kører længden af holderen, med en fingerskrue i bunden. En platform er fastgjort til toppen af holderen, 25 mm X 40 mm X 10 mm, med en 3,5 mm diameter hul på linje med rillen i holderen.
- LED arrays (se figur 1).
- Fire arme af kølerslange, ~ 18 cm lang, er fastgjort til platformen base hjælp af kølerslange stik. Kølerslange anvendes udelukkende som strukturel understøtning og ikke anvendes til køleformål.
- Korrekt afstand riller er skåret ind i den sidste brik i kølevæske spuling af hver arm at anbringe et varmedræn til enden af hver arm.
- En blå lysdiode Rebel Tri-Stars er monteret på hver køleplade med pre-cut termisk tape. En Carclo 18 ° Tri-linse er fastgjort til hver Tri-Star.
- LED Tri-Stars er kablede til BuckPuck DC drivere og en strømforsyning som angivet. Vi har arrangeret vores set-up med hver BuckPuck kraftoverførsel to Tri-Stars i serie.
- Belysning af alle fire LED Tri-Stars ved 700 mA gav en bestråling på 713 W / m 2 på vores platform.
- Kamera: Kameraet er monteret på et lille stativ og fokuseres på toppen af platformen.
4. Behavioral Assay
- Kort fortalt bedøve fluer på is.
- Placer de enkelte fluer i pipettespidser, ved hjælp af tape til at lukkebegge ender af spidsen.
- Efter fluerne har vækket og udforsker aktivt pipettespidsen, fjerne tapen og placer en pipette i rillen i lodret holder. Fingerskruen anvendes til at fastgøre pipettespidsen på plads, og til at lukke bunden af spidsen.
- Som fluen udforsker pipettespidsen (typisk 30-60 sec), starte kameraoptagelse lige før fluen kommer ud af spidsen på platformen.
- Når fluen er opstået på platformen, vente 1-2 seco, og tænd for blå lysdioder. Brug en timer til manuelt måle den tid, indtil fluen indleder flyvningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Blind flyver udtrykker enten CHR2 eller G105 driver alene viser en lav start efter deres belysning med lyse blå lys. Blind flyver udviste den samme sats for take-off uanset belysning (figur 2), hvilket tyder på, at disse take-offs var spontan snarere end på grund af belysning med blåt lys. Når CHR2 udtrykkes i Foma1 neuroner, men belysning med blåt lys fremkalder den forsvarsmekanisme. Over 50% af de testede fluer lettede inden for 1 sec af belysning og 75% inden for 5 sek (figur 2). I modsætning hertil var kun 10% af kontrol fluer ud inden for 1 sekund, og 20% inden for 5 sek. Da G105 driver kommer til udtryk både i FOMA-1 neuroner og i γ-lap af champignon krop, vi brugte en driver specifikt udtrykkes i denne del af champignon legeme (201Y-Gal4) som en ekstra kontrol. Disse fluer udviste en hastighed på start lighed med de øvrige udførte kontroller (figur 2), Hvilket indikerer specifikt at optogenetic aktivering af FOMA-1 neuroner fremkaldte flugten respons.
Høj hastighed billeddannelse taget ved 200 fps af de optogenetically inducerede responser viste, at disse responser svarede til vævens-fremkaldte escape adfærd (figur 3). Nemlig, filmede 90% af fluer hævet deres vinger før take-off (n = 30) 6. Yderligere, den efterfølgende flyveveje var mindre stabil end frivillige starter 10, med flue krop er i en noget lodret orientering (fig. 3), men mere stabile end giant fiber medierede responser 9.
Figur 1. Eksperimentel set-up viser platformen med den lodrette holder, og de fire kølevæske spuling armene der holder køleplader med LED arrays er fastgjort til dem. A, Set-up under omgivelsernes belysning. B, set-up når LED'erne lyser. C, en tæt op visning af en Tri-Star LED på kølepladen. D, en tæt op af den Tri-Star med tri-objektiv monteret. E en skematisk afbildning af Buckpuck Driver og LED kredsløb. F, kredsløbsdiagram for BuckPuck og LED kredsløb.
Figur 2. Kumulativ histogram af tid for flugt hoppe til forsøg og kontrol flueliner. Alle fluer express w + norpA at gøre dem visuelt blind. "Foma-1" fluer har G105-Gal4 føreren "MB" fluer har 201Y-Gal4 driver, der driver ekspression i champignon kroppen.
Figur 3. Højhastigheds videobilleder af CHR2 inducerede escape svar. Rammer er nummererede gendeially med 5 msek mellem rammer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har vist optogenetic stimulering af flugtveje adfærd ved at bade frit vandre fluer i lyse blå lys. Denne fremgangsmåde kan let tilpasses til at undersøge andre adfærd i fritgående fluer, og kan skaleres til større platforme ved blot flisebelægning af LED arrays vi brugte over et større område. Brug enten den billige kamera beskriver vi, eller andre tilgængelige kamerasystemer, kan brugeren skræddersy frame rate og rumlig opløsning af billederne erhvervet så de passer til opførsel af interesse. Derudover er vores imaging begrænset til den tid, efter at lysdioderne er tændt, da det blå lysdioder giver belysning til kameraet samt aktivering af CHR2. Dette er tilstrækkeligt for vores adfærd, men hvis position eller bevægelse af fluen før LED-belysning skal registreres, kan yderligere lyskilder giver signaler i det infrarøde område, kombineret med passende filtrering af kameraet, skal indarbejdes.
_content "> Optogenetics er blevet bredt betegnet som en ikke-invasiv måde at manipulere neurale aktivitet. Alligevel har denne teknik været stort set utilgængelig for det visuelle system, som lyset anvendes til at aktivere CHR2 vil også aktivere visuelle veje. Desuden er brugen af optogenetics at sonden ikke-visuelle adfærd kunne også være hæmmet af de fluer 'phototactic reaktioner på klare lys. Brugen af norpA fluer, der er visuelt blinde gør os i stand til at bruge optogenetic værktøjer i det visuelle system, og forhindrer phototaxis i at skjule andre adfærd.Denne protokol kræver, at CHR2 udtrykkes i neuronerne af valg, at fluerne fodres all-trans-retinal, og at fluerne være badet i lys blå lys. Protokollen vi udviklet har opfyldt disse krav, er endnu ikke blevet fuldt optimeret. For eksempel mener vi den mængde lys vi bruger kan være lysere end nødvendigt, og at en højere koncentration af hel-trans-retinal eller længere fodring timig, kunne resultere i en højere sats for take-off. Vi har ikke systematisk undersøgt disse parametre.
De FOMA-1 neuroner vi aktiverer findes i lobula kompleks af fluen, og er således beliggende tæt på den bageste overflade af hjernen. Det er muligt, at succesen af dette forsøg er afhængig af neuronerne er tæt på overfladen, som lyset skal trænge gennem flue kutikula at aktivere CHR2. Således kan celler, der ligger dybere i hjernen ikke blev aktiveret ved hjælp af denne fremgangsmåde.
Den G105 driver udtrykkes i en klynge af 5 neuroner på hver side af den optiske lap, at Foma-1 neuroner, såvel som i neuroner i γ-lap af svampen organ. Heldigvis havde vi en chauffør til at gøre kontrolforsøg for at fjerne en rolle champagneproplukke kroppen neuroner i flugt adfærd. Men uanset om aktivering af alle 10 FOMA-1 neuroner er påkrævet for denne adfærd, eller om der kun er en eller tospecifikke celler er tilstrækkelige, kan ikke afgøres på nuværende tidspunkt. Efterhånden som flere specifikke drivere er udviklet, og tværsektorielle strategier til begrænsning af ekspression raffineres 1,14, forventer vi at kunne målrette neuroner med større specificitet.
Cryptochromes er fotoreceptorer involveret i døgnrytmen og adfærd, der er følsomme over for blåt lys. I denne protokol, er cryptochromes sandsynligvis aktiveres af det blå lys, der anvendes til at stimulere CHR2. Dette synes ikke at påvirke take-off opførsel observeret her, da den lave take-off observeret i kontrol-fluer (hvor det blå lys aktiverer cryptochromes men ikke CR2 i FOMA-1 neuroner) svarer nøje udnyttelsesgraden -off observeret i kontrol fluer uden belysning, eller når de belyses med grønt lys (som ikke aktiverer cryptochromes). Men for anden adfærd, der er mere direkte påvirkes af cryptochromes, kan det vise sig problematisk. Et potentieltforbedring at undgå dette kunne være brugen af en rød-skiftet channelrhodopsin, der aktiveres af gul, 589 nm, light 15.
I vore forsøg observerede vi et lavt niveau af spontan starter således at ~ 10% af kontrol fluer tog inden for 1 sekund for LED-belysning, og 13 til 28% inden for 5 sek. Som vi observerede den samme sats for start, når fluerne blev belyst med grønt lys, der ikke effektivt aktivere CHR2, samt fluer uden nogen belysning, mener vi, at disse var spontane flyvninger snarere end lette inducerede take-offs. Virkningen af CHR2 aktivering af FOMA-1 neuroner på flugt adfærd skal derfor måles på toppen af denne spontane aktivitet. For andre adfærd, der ikke involverer take-off, dog kan dette resultere i opsagte forsøg, hvis fluer flygte fra platformen forud for fuldbyrdelsen af den testede adfærd. I hvilket omfang disse spontane undslipper udgør en eksperimentel ulempe er obviously afhængig af tidshorisont for opførsel af interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af en Stanford Dean Fellowship (SEJdV), en National Institutes of Health direktørs Pioneer Award (TRC DP0035350), en McKnight Foundation Scholar Award (TRC) og R01 EY022638 (TRC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| All-trans Retinal | Advance Scientific Chemical Inc | R3041 | |
| Equipment | |||
| Heat Sink 9.2 C/W | Luxeonstar | LPD30-30B | 30 mm square X 30 mm high |
| Carclo 18 ° Tri-Lens | Luxeonstar | 10507 | |
| Blue Rebel LED on Tri-Star Base | Luxeonstar | MR-B0030-20T | 470 nm, 174 lm @ 700 mA. |
| 700 mA BuckPuck DC Driver | Luxeonstar | 3021-D-E-700 | |
| Wiring Harness for BuckPuck Driver | Luxeonstar | 3021-HE | |
| Pre-cut thermal adhesive tape | Luxeonstar | LXT-S-12 | 20 mm Hex Base |
| Snap-Loc Coolant Hose, ¼" ID | McMaster-Carr | 5307K49 | |
| Snap-Loc Coolant Hose Connector | McMaster-Carr | 5307K39 | ¼" NPT Male |
| Laboratory Grade Switching Mode Programmable DC Power Supply | BK Precision | 1698 | |
| Exilim camera | Casio | EX-FH20 | |
References
- Venken, K., Simpson, J., Bellen, H. Genetic manipulations of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
- Gordon, M., Scott, K. Motor control in a Drosophila taste circuit. Neuron. 61, 373-384 (2009).
- Suh, G. S. B., et al. Light activation of an innate olfactory avoidance response in Drosophila. Current Biology. 17, 905-908 (2007).
- Zhang, W., Ge, W., Wang, Z. A toolbox for light control of Drosophila behaviors through Channelrhodopsin 2-mediated photoactivation of targeted neurons. European Journal of Neuroscience. 26, 2405-2416 (2007).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Science. 100, 13940-13945 (2003).
- de Vries, S., Clandinin, T. Loom-sensitive neurons link computation to action in the Drosophila visual system. Current Biology. 22, 353-362 (2012).
- Card, G. Escape behaviors in insects. Current Opinion in Neurobiology. 22, 1-7 (2012).
- Card, G., Dickinson, M. H. Visually mediated motor planning in the escape response of Drosophila. Current Biology. 18, 1300-1307 (2008).
- Fotowat, H., Fayyazuddin, A., Bellen, H. J., Gabbiani, F. A novel neuronal pathway for visually guided escape in Drosophila melanogaster. Journal of Neurophysiology. 102, 875-885 (2009).
- Card, G., Dickinson, M. H. Performance trade-offs in the flight initiation of Drosophila melanogaster. The Journal of Experimental Biology. 211, 341-353 (2008).
- Hammond, S., O'Shea, M. Escape flight initiation in the fly. Journal of Comparative Phsyiology A. 193, 471-476 (2007).
- Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. PNAS. 58, 1112-1119 (1967).
- Bloomquist, B., et al. Isolation of a putative phospholipase C gene of Drosophila, norpA, and its role in phototransduction. Cell. 54, 723-733 (1988).
- Gohl, D., et al. A versatile in vivo system for directed dissection of gene expression patterns. Nature Methods. 8, 231-237 (2011).
- Zhang, F., et al. Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox cateri. Nature Neuroscience. 11, 631-633 (2008).
