Summary
Vi viser en minimalt invasiv teknik kaldet neonatal subventricular zone elektroporering. Teknikken består i at injicere plasmid-DNA i de laterale ventrikler af neonatale hvalpe og anvendelse af elektrisk strøm til at levere og genmanipulere neurale stamceller
Abstract
Neurale stamceller (NSC) line den postnatale laterale ventrikler og giver anledning til flere celletyper, der indbefatter neuroner, astrocytter, og ependymal celler 1.. Forståelse af de molekylære veje, der er ansvarlige for NSC selvfornyelse, engagement og differentiering er kritisk for at udnytte deres unikke potentiale til at reparere hjernen og bedre forstå sygdomme i centralnervesystemet. Tidligere metoder til manipulering af mammale systemer krævede tidskrævende og dyrt, for genteknologien på hele dyret niveau 2. Således har hovedparten af undersøgelser undersøgt funktioner NSC-molekyler in vitro eller in hvirvelløse dyr.
Her vil vi demonstrere den enkle og hurtige teknik til at manipulere neonatale NPCs der omtales som neonatal subventricular zone (SVZ) elektroporation. Lignende teknikker blev udviklet et årti siden for at studere embryonale NSC og har hjulpet undersøgelser af cortical udvikling 3,4. For nylig dette blev anvendt til at studere den postnatale gnaver forhjerne 5-7. Denne teknik resulterer i robust mærkning af SVZ NSC og deres afkom. Således postnatal SVZ elektroporering giver en omkostningseffektiv og tid effektivt alternativ til pattedyr NSC genteknologi.
Protocol
Denne procedure er i overensstemmelse med Yale IACUC krav. Forskerne bør sikre, at IACUC retningslinjerne godkendes og følges i henhold til deres institutionelle krav.
1. Afsnit 1. Fremstillinq af DNA, Solutions, og glaspipetter
- Genererer høj renhed (OD 260/280> 1.80) høj koncentration (pg / pl> 2.5) endotoxin-frit DNA.
- Forbered 0,9% saltvandsopløsning og steril filtreres gennem et 22 um filter.
- Place 10 cm brand poleret borosilikatglas kapillarrør (OD: 1,5 mm, ID: 1,10 mm) til en model PP-830 Narishige PC-10 glaspipette aftrækker med en Kanthal ledning. Sæt aftrækker til et et skridt vægtet træk ved 70,5 ° C. Break tips med cirkulære pincet og inspicere under et dissektionsmikroskop for takkede kanter. Bevel tips og anbringes under en UV-lampe i 15 min. Trukket pipetter bør mærkes på 2 mm fra kanten af spidsen.
- Forbered 0,1% vægt / volumen fast green solutiden ved blanding sterilfiltreret 0,9% saltvandsopløsning med tørt fast green.
2. Afsnit 2. Animal Forberedelse, glaspipette Loading og Plasmid Injection
- Fjern postnatal dag 0-1 hvalpe individuelt fra bure, sted på et glas petriskål pre-nedkølet til 4 ° C, og derefter sted på våd is.
- Efter ca 5 min, bestemme tilstanden af bedøvelse ved at udnytte foden knivspids respons. Hvis nogen bevægelse sker med forbehold hvalpe til intraventrikulær injektion.
- Det er vigtigt at bemærke, at kombinationen af fast green, DNA og saltvandsopløsning kan resultere i hurtig fordampning, krystallisation og blokering af glaspipetter. Derfor generere en stamopløsning og aliquot 1-2 pi på parafilm umiddelbart før injektioner.
- Aspirer hele alikvoteret volumen med den trukket glas pipette.
- Hold hovedet af hvalpen mellem tommel-og pegefinger på din mindre dominerende hånd.
- Tænd lampe end holdes hovedet af ungerne lige uden for lysstrålen. Om nødvendigt sættes saltvand på hovedet for at reducere mængden af lys, der reflekteres fra pup. Ventriklerne skal nu belyses.
- Med din dominerende hånd stikkes nålen ind laterale ventrikel tættest på dig (figur 1A og 1B). Injektionsstedet skulle være tilnærmelsesvis lige langt fra den lambdoid sutur og øje og 2 mm lateralt til den sagittale sutur. Indsæt trukket pipette til 2 mm varemærke for en P0 pup, som skal sikre indtrængning i den laterale ventrikel. Tilfældigvis, kan du se tilbage fyldning af CSF ind i pipetten fra frigivelsen af intrakranielt tryk. For at reducere intrakranielt tryk, hvilket hjælper med injektion af plasmid, løsne dit greb på hovedet af pup.Step 2,8. Indsprøjtes cirka 0,5 ul plasmidet i lateral ventrikel ved hjælp af en luft-presset injektor (Picospritzer, Parker).
3. Afsnit 3. Elektroporation and Recovery
- Set spændingen af elektroporation generator for 5 firkantede impulser, 50 msek / puls ved 100 volt, med 950 msek intervaller. Den rumlige specificitet plasmid elektroporering dikteres af retningen af ladningsoverførsel. Luk opmærksomhed bør gives til placeringen givet heterogenitet stamcellepopulationer langs SVZ 8. Forskelle i satserne for spredning og celle skæbne er blevet identificeret til ventral-dorsale og rostral-caudale steder 9,10.
- Når plasmidet injiceres, dip pincetfladerne elektroder i PBS. Dette trin er at maksimere ladningsoverførsel og forhindre forbrændinger forårsaget af resistivitet.
- Anbring den positive elektrode på den dorsale sidevæg af unger nær øret ipsilateral til stedet for plasmidet injektion (fig. 1C og 1D). Anbring den negative elektrode på den kontralaterale hemisfære ventrale laterale til hvalpen snude.
- Indled strømoverførelse ved at trykke på puls footsheks pedal og feje elektroderne fra dorsal til lateral hjælp ~ 25 ° vinkel intervaller.
- Sted elektroporeret unger på en varmepude i 5 min. Drej forsigtigt unger hver 30 sek med mild stimulation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Neonatal subventricular zone elektroporation resulterer i mærkningen af næsten alle radial glia sammenhængende med ryg-, bryst-lateral, og lateral subventricular zone efter "fejer" bevægelse af pincetten elektrode (fig. 1E). Dog kan elektroporation være skræddersyet til kravet om den pågældende eksperiment, men ikke fejer elektroden og under anvendelse af specifikke placering og orientering som beskrevet i videoen. For eksempel, eftersom dorsalt lokaliseret radial glia afviger fra foring den laterale del af ventriklen kan man vælger kun at elektroporere en enkelt region 9,10. Yderligere specificitet kan også gives ved hjælp af mindre elektroder.
Plasmid DNA fortyndes hurtigt inden for de første tre uger 11. Derfor er identifikation af genomisk modificerede celler under anvendelse af plasmid-DNA ikke anbefales. For at omgå denne begrænsning, er CRE rekombinasegenkendelsessites udtrykker plasmider Introduced sammen med GFP i mus, som har et stop sekvens flankeret af lox P steder opstrøms for et genomisk udtrykte fluorescerende protein (tdTomato) 12. Efter rekombination, er stop-sekvensen fjernet, og det fluorescerende protein er udtrykt (figur 1F). Med fire uger efter elektroporering få GFP-plasmid, der udtrykker celler ses i subventricular zone hvorimod mange flere tdTomato positive celler ses. Efter skæring lugtekolben er det også klart, at i sammenligning med tdTomato udtrykkende celler, langt færre GFP-udtrykkende celler er til stede, både imidlertid har erhvervet træk modne granulceller (figur 1G).
Figur 1. Neonatal Subventricular Zone Elektroporering. (A) Skematisk diagram over enP0-P1 pup med ventrikulære system og rygmarv indeholdende cerebrospinalvæske (TEAL) fremhæves injiceret med forøget GFP (EGFP) koder plasmid (grøn). (B) koronale snit, der viser orientering af skovlene i forhold til injektionsstedet og laterale ventrikel. (C) orientering af negative (-).. og positive (+) elektroder i forhold til XYZ akse på injiceret pup (D) vandret billede af en pup efter elektroporering (E) Billede af den laterale ventrikel 24 timers efter elektroporering af en EGFP-kodende vektor (grøn). (F) Billede af den laterale ventrikel 28 dage efter elektroporering af Cre-rekombinase-og EGFP-kodende plasmider i mus, der bærer en stopkodon opstrøms for tdTomato. Rekombination inducerer ekspression af tdTomato (Red). Successive fortyndinger af plasmid resultat i få tilbageværende eGFP positive SVZ celler, mens genomically udtrykte tdTomato er permanent udtrykkes. (G)Fortynding af plasmid-DNA (grøn) fremgår eftersom flere celler i granulen cellelag i lugtekolben udtrykke genomiske markør, tdTomato (rød). LV: lateral ventrikel, OB: lugtekolben. Klik her for at se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi detaljeret teknikken med neonatal SVZ elektroporering, en teknik til hurtigt og robust mærke og manipulere SVZ stamceller og deres afkom. Der er flere fordele, at elektroporering har i sammenligning med andre teknikker. For det første på grund af den fokale mærkning af celler, er man i stand til at skelne celle autonome og ikke-autonome celle virkninger. Sekund, genetisk manipulation ved hjælp af inducerbare systemer gør det muligt at sammenligne virkninger før eller efter synaptisk integration. Endvidere kan man omgå anvendelsen af multiple plasmider ved elektroporering CRE udtrykkende mus med plasmider indeholdende loxP-sites. Det fjerde kan gen reporterplasmider anvendes til at undersøge transskriptionel transaktivering. I dette tilfælde kan transskriptionel aktivitet kun måles i celler, der er manipuleret, tilsættes specificitet kan indføres, når Delregionerne er microdissected. For det femte den forbigående mærkning af transit forstærkende celler som følge af fortsat spredning og fortynding of plasmidet kan anvendes som "birthdating" metode svarende til mærkning med thymidin-analoger 11. Sjette, selv om forbigående mærkning af celler kan ses som en ulempe, skal teknikken være modtagelige for transposase-transposonsekvenser par til at inducere genomisk integration 13. Alternativt kan løbende neurogenese ændres med Cre-rekombinase at inducere genomisk modifikation af mus indeholdende alleler flankeret af loxP-sites 7,11. Ved hjælp af denne protokol blev nyfødte neuroner identificeret op til fire måneder efter elektroporation i Rosa26R-Stop-tdTomato mus, hvor stop-kassetten er flankeret af loxP-sites 12. Tilsammen neonatal SVZ elektroporering er en omkostningseffektiv og tidseffektiv minimalt invasiv værktøj til forbigående eller permanent genetisk manipulation og mærkning af forhjerne neurale stamceller og nyfødte neuroner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen oplysninger at gøre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Department of Defense (Idéudvikling award, W81XWH-10-1-0041, AB), CT Stamceller tilskud (AB), og en National Institute of Health NRSA 10.668.225 (DMF). Det foreliggende materiale er baseret på arbejde delvis støttet af staten Connecticut under Connecticut Stem Cell Research Grants Program. Dens indhold er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter i staten Connecticut, Institut for Folkesundhed i staten Connecticut eller CT Innovations, havde Inc. finansieringskilder ingen rolle i studie design, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heavy Polished Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | BF150-110-10 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narishige | PC-10H | |
| Fast Green | Fischer Scientific | 0521192205 | |
| ECM 830 Square Wave Pulse generator | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Tweezertrodes | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12-562-36 | |
| Tungsten Halogen lamp | USHIO America, Inc | 1002247 | |
| Picospritzer II | Parker Instruments | 052-0312-900 |
References
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
- Imayoshi, I., Sakamoto, M., Kageyama, R. Genetic methods to identify and manipulate newly born neurons in the adult brain. Frontiers in Neuroscience. 5, 64 (2011).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i120-i125 (2009).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PloS ONE. 3, e1883 (2008).
- Chesler, A. T., et al. Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis. PloS ONE. 3, e1517 (2008).
- Platel, J. C., et al. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
- Alvarez-Buylla, A., Kohwi, M., Nguyen, T. M., Merkle, F. T. The heterogeneity of adult neural stem cells and the emerging complexity of their niche. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 73, 357-365 (2008).
- Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis. Neural Development. 6, 13 (2011).
- de Chevigny, A., et al. miR-7a regulation of Pax6 controls spatial origin of forebrain dopaminergic neurons. Nature Neuroscience. 15, 1120-1126 (2012).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Frontiers in Neuroscience. 4, (2010).
- Feliciano, D. M., Quon, J. L., Su, T., Taylor, M. M., Bordey, A. Postnatal neurogenesis generates heterotopias, olfactory micronodules and cortical infiltration following single-cell Tsc1 deletion. Human Molecular Genetics. 21, 799-810 (2012).
- Iguchi, T., Yagi, H., Wang, C. C., Sato, M. A tightly controlled conditional knockdown system using the Tol2 transposon-mediated technique. PloS ONE. 7, e33380 (2012).
