Summary
Wir zeigen eine minimal-invasive Technik genannt Neugeborenen Subventrikulärzone Elektroporation. Die Technik besteht aus Einspritzen Plasmid-DNA in den lateralen Ventrikel neonataler Welpen und Anlegen von elektrischem Strom zu liefern und genetisch zu manipulieren Nervenstammzellen
Abstract
Neurale Stammzellen (NSCs) säumen die postnatale Seitenventrikel und führen zu mehreren Zelltypen, die Neuronen, Astrozyten und Ependymzellen 1 enthalten. Das Verständnis der molekularen Mechanismen, die für NSC Selbsterneuerung, Engagement und Differenzierung ist entscheidend für die Nutzung der ihr einzigartiges Potenzial, um das Gehirn zu reparieren und besser zu verstehen Erkrankungen des zentralen Nervensystems. Bisherige Verfahren zur Manipulation von Säugersystemen erforderte die zeitaufwendig und teuer Bestreben der Gentechnologie am Ganztier Ebene 2. Somit haben die meisten Studien die Funktionen des NSC-Molekülen in vitro oder in wirbellosen erforscht.
Hier zeigen wir die einfache und schnelle Methode, um Neugeborenen NPCs, die als Neugeborene subventrikulären Zone (SVZ) Elektroporation bezeichnet manipulieren. Ähnliche Techniken wurden vor einem Jahrzehnt zu embryonalen NSCs zu studieren entwickelt und unterstützt Studien über cortical Entwicklung 3,4. In jüngerer Zeit wurde dies angewendet zu studieren die postnatale Nager Vorderhirn 5-7. Diese Technik führt zu robusten Kennzeichnung von SVZ NSCs und deren Nachkommen. So bietet postnatalen SVZ Elektroporation eine Kosten-und Zeitaufwand effektive Alternative für Säugetierzellen NSC Gentechnik.
Protocol
Diese Vorgehensweise ist im Einklang mit Yale IACUC Anforderungen. Wissenschaftler sollten sicherstellen, dass IACUC Richtlinien zugelassen sind und nach ihrer institutionellen Voraussetzungen gefolgt.
Ein. Abschnitt 1. Herstellung von DNA, Lösungen und Glaspipetten
- Generieren hoher Reinheit (OD 260/280> 1,80) hoher Konzentration (ug / ul> 2,5) Endotoxin-freien DNA.
- Planen 0,9% iger Kochsalzlösung und steril filtriert durch ein 22 pm-Filter.
- Platz 10 cm feuerpolierte Borosilikatglas Kapillarrohre (OD: 1,5 mm, ID: 1,10 mm) in ein Modell PP-830 Narishige PC-10 Glaspipette Abzieher mit einem Kanthal Draht. Set Abzieher einem Schritt gewichteten Pull bei 70,5 ° C. Brechen Sie Tipps mit kreisförmigen Pinzette und überprüfen unter einem Binokular für gezackte Ränder. Bevel Tipps und unter einer UV-Lampe für 15 min. Gezogen Pipetten sollte bei 2 mm von der Kante der Spitze zu kennzeichnen.
- Bereiten 0,1% Gewicht / Volumen schnell grün Löauf durch Mischen sterilfiltriert 0,9% iger Kochsalzlösung mit trockenem schnell grün.
2. Abschnitt 2. Tierische Vorbereitung, Glaspipette Laden und Plasmid Injection
- Entfernen postnatalen Tag 0-1 Welpen einzeln aus Käfigen, statt auf eine Glas-Petrischale vorgekühlt auf 4 ° C, und legen Sie dann auf nassem Eis.
- Nach ca. 5 min, bestimmen den Zustand der Betäubung durch die Nutzung der Fuß Prise Antwort. Wenn keine Bewegung auftritt, unterliegen Welpen zu intraventrikuläre Injektion.
- Es ist wichtig zu beachten, dass die Kombination von schnell grün, DNA und Salzlösung kann in schneller Verdampfung, Kristallisation und Blockade Glaspipetten führen. Daher erzeugen eine Stammlösung und aliquoten 1-2 ul auf Parafilm unmittelbar vor Injektionen.
- Saugen Sie die gesamte aliquotierten Lautstärke mit dem gezogenen Glaspipette.
- Halten Sie den Kopf des Welpen zwischen Daumen und Zeigefinger der weniger dominanten Hand.
- Schalten Sie Lampe eind Halten Sie den Kopf des Welpen etwas außerhalb des Lichtstrahls. Falls erforderlich, setzen auf den Kopf Kochsalzlösung, um die Menge an Licht, das von pup wider reduzieren. Die Ventrikel sollte nun beleuchtet werden.
- Mit Ihrer dominanten Hand, die Nadel in lateralen Ventrikel am nächsten zu Ihnen (1A und 1B). Die Injektionsstelle sollte ungefähr gleich weit von der Lambdanaht und Auge und 2 mm lateral zur Sagittalnaht. Legen Sie zog Pipette auf die 2 mm Marke für eine P0 Welpen, die sollten das Eindringen in den lateralen Ventrikel zu gewährleisten. Zufällig, sehen Sie möglicherweise Verfüllen von CSF in die Pipette aus der Auflösung von Hirndruck. Um Hirndruck, die Injektion von Plasmid hilft zu reduzieren, lockern Sie Ihren Griff auf den Kopf des pup.Step 2,8. Inject rund 0,5 ul Plasmid in lateralen Ventrikel mit einem Luft-Druck-Injektor (Picospritzer, Parker).
3. Abschnitt 3. Elektroporation und Recovery
- Set die Spannung des Generators Elektroporation für 5 Rechteckimpulsen, 50 msec / Impuls bei 100 Volt mit 950 msec Intervallen. Die räumliche Spezifität von Plasmid Elektroporation wird durch die Bündelung von Charge-Transfer diktiert. Besondere Aufmerksamkeit sollte auf die Platzierung angesichts der Heterogenität der Stammzell-Populationen entlang der SVZ 8 gegeben. Unterschiede in den Raten von Proliferation und das Schicksal der Zelle haben ventral-dorsal und rostral-kaudale Standorten 9,10 identifiziert worden.
- Sobald das Plasmid injiziert wird, dip Pinzette Elektroden in PBS. Dieser Schritt dient dazu Ladungstransfer zu maximieren und Verbrennungen durch Widerstand zu verhindern.
- Platzieren Sie die positive Elektrode auf der dorsalen seitlichen Wand des pup nahe dem Ohr ipsilateral zur Stelle von Plasmid-Injektion (1C und 1D). Zeigen die negative Elektrode auf der kontralateralen ventralen seitlichen des pup Schnauze.
- Initiieren Stromübertragung durch Drücken der Puls footsHexe Pedal und fegen die Elektroden von dorsal nach lateral mit ~ 25 °-Winkel Abständen.
- Ort elektroporiert Jungtieren auf ein Heizkissen für 5 min. Drehen Sie vorsichtig Welpen alle 30 sec mit einer milden Stimulation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Neonatal Subventrikulärzone Elektroporation Ergebnisse bei der Etikettierung von fast allen radialen Gliazellen zusammenhängend mit dem Rücken, dorsal lateral und lateral Subventrikulärzone nach dem "Sweeping" Bewegung der Pinzette Elektrode (1E). Allerdings kann Elektroporation der Anforderung des jeweiligen Experiments zugeschnitten werden, aber nicht Fegen der Elektrode und unter Verwendung spezifischer Anordnung und Ausrichtung, wie in dem Video. Da beispielsweise dorsal örtlichen radialen Glia von jenen unterscheiden Auskleidung des seitlichen Abschnitts des Ventrikels, kann man wählen, um nur eine einzige Region elektroporieren 9,10. Weitere Spezifität kann auch gegeben mit kleineren Elektroden werden.
Plasmid-DNA wird schnell innerhalb der ersten drei Wochen 11 verdünnt. Daher ist die Identifizierung genomisch veränderten Zellen mit Plasmid-DNA nicht empfohlen. Um diese Einschränkung zu umgehen, sind CRE-Rekombinase exprimierenden Plasmiden Introduced zusammen mit GFP in Mäusen, die eine Stop-Sequenz von lox P-Websites vor einem genomisch ausgedrückt fluoreszierende Protein (tdTomato) 12 flankiert. Nach Rekombination ist die Stopp-Sequenz entfernt und das fluoreszierende Protein exprimiert wird (1F). Um vier Wochen nach der Elektroporation wenigen GFP exprimierenden Plasmid-Zellen werden in der Subventrikularzone gesehen wohingegen viele weitere tdTomato positive Zellen beobachtet werden. Nach Schneiden der Riechkolben ist auch ersichtlich, dass im Vergleich zu tdTomato exprimierenden Zellen deutlich weniger GFP exprimierenden Zellen vorhanden sind, aber beide haben Merkmale der reifen Körnerzellen (1G) erworben.
Abbildung 1. Neonatal Subventrikulärzone Elektroporation. (A) Schematische Darstellung einesP0-P1 Welpen mit Ventrikelsystem und Rückenmark enthaltenden Cerebrospinalflüssigkeit (blaugrün) markierten injiziert mit enhanced GFP (eGFP) codiert Plasmid (Grün). (B) zeigt Frontalschnitt Orientierung der Schaufeln relativ zu der Injektionsstelle und lateralen Ventrikel. (C) Ausrichtung der negative (-).. und positive (+)-Elektroden mit Bezug auf XYZ-Achse auf injiziert pup (D) Horizontale Ansicht eines Welpen folgenden Elektroporation (E) Bild der lateralen Ventrikel 24 Stunden nach der Elektroporation eines eGFP-codierenden Vektor (Green). (F) Bild von den lateralen Ventrikel 28 Tage nach Elektroporation von CRE-Rekombinase-und eGFP-kodierenden Plasmiden in Mäuse tragen ein Stop-Codon vor tdTomato. Rekombination induziert die Expression von tdTomato (Red). Aufeinanderfolgende Verdünnungen von Plasmid-Ergebnis in wenigen verbleibenden eGFP positive SVZ-Zellen während genomisch ausgedrückt tdTomato permanent ausgedrückt. (G)Verdünnung von Plasmid-DNA (grün) ist ersichtlich, da mehr Zellen in der Granalie Zellschicht der Riechkolben die genomische Marker, tdTomato (rot) exprimieren. LV: Seitenventrikel; OB: Riechkolben. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier im Einzelnen die Technik der neonatalen SVZ Elektroporation, eine Technik, um schnell und robust beschriften und manipulieren SVZ Stammzellen und deren Nachkommen. Es gibt mehrere Vorteile, die Elektroporation im Vergleich zu anderen Techniken aufweist. Erstens, da der Schwerpunkt Markierung von Zellen, ist man in der Lage zu Zelle autonom und nicht zellautonomen Effekte zu erkennen. Zweitens genetischen Manipulation unter Verwendung induzierbare Systeme ermöglicht es, Effekte vor oder nach Integration synaptischer vergleichen. Weiterhin kann ein Bypass die Verwendung von mehreren Plasmiden durch Elektroporation CRE exprimierenden Mäusen mit Plasmiden, die loxP-Stellen. Viertens kann Gens Reporterplasmide zur transkriptionellen Transaktivierungsdomäne studieren. In diesem Fall können transkriptionelle Aktivität nur in Zellen, die manipuliert sind, durchgeführt werden; zugegeben Spezifität kann eingeleitet werden, wenn Teilbereiche mikrodissezierten werden. Fünftens, die vorübergehende Kennzeichnung von transit amplifying Zellen aufgrund der fortgesetzten Verbreitung und Verdünnung of das Plasmid kann als "birthdating" analog Markierung mit Thymidinanaloga 11 verwendet werden. Sechste, obwohl die transiente Markierung von Zellen als Nachteil angesehen werden könnten, sollte die Technik zugänglich sein Transposase-Transposon paarweise genomische Integration 13 induzieren. Alternativ können laufende Neurogenese mit CRE-Rekombinase verändert werden, um genomische Modifikation von Mäusen, die Allele durch loxP 7,11 flankiert induzieren. Unter Verwendung dieses Protokolls wurden neugeborenen Neuronen bis zu vier Monate nach der Elektroporation in Rosa26R-Stop-tdTomato Mäuse, bei denen der Anschlag Kassette von loxP-Stellen flankiert 12 identifiziert wird. Zusammen für neonatalen SVZ Elektroporation eine kostengünstige und zeitsparende minimal invasives Verfahren für die vorübergehende oder dauerhafte genetische Manipulation und Kennzeichnung von Vorderhirn neuralen Stammzellen und Neugeborenen Neuronen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben keine Angaben zu machen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Department of Defense (Idea Development Award, W81XWH-10-1-0041, AB), CT Stammzell-Stipendium (AB), und eine National Institute of Health NRSA 10.668.225 (DMF) unterstützt. Das vorliegende Material basiert auf der Arbeit teilweise durch den Staat Connecticut unter dem Connecticut Stem Cell Research Grants Program unterstützt werden. Die Inhalte sind allein in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des Staates Connecticut, das Department of Public Health des Staates Connecticut oder CT Innovations, Inc. hatte die Geldgeber keine Rolle in der Studie, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung zur Veröffentlichung oder Vorbereitung des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heavy Polished Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | BF150-110-10 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narishige | PC-10H | |
| Fast Green | Fischer Scientific | 0521192205 | |
| ECM 830 Square Wave Pulse generator | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Tweezertrodes | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12-562-36 | |
| Tungsten Halogen lamp | USHIO America, Inc | 1002247 | |
| Picospritzer II | Parker Instruments | 052-0312-900 |
References
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
- Imayoshi, I., Sakamoto, M., Kageyama, R. Genetic methods to identify and manipulate newly born neurons in the adult brain. Frontiers in Neuroscience. 5, 64 (2011).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i120-i125 (2009).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PloS ONE. 3, e1883 (2008).
- Chesler, A. T., et al. Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis. PloS ONE. 3, e1517 (2008).
- Platel, J. C., et al. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
- Alvarez-Buylla, A., Kohwi, M., Nguyen, T. M., Merkle, F. T. The heterogeneity of adult neural stem cells and the emerging complexity of their niche. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 73, 357-365 (2008).
- Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis. Neural Development. 6, 13 (2011).
- de Chevigny, A., et al. miR-7a regulation of Pax6 controls spatial origin of forebrain dopaminergic neurons. Nature Neuroscience. 15, 1120-1126 (2012).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Frontiers in Neuroscience. 4, (2010).
- Feliciano, D. M., Quon, J. L., Su, T., Taylor, M. M., Bordey, A. Postnatal neurogenesis generates heterotopias, olfactory micronodules and cortical infiltration following single-cell Tsc1 deletion. Human Molecular Genetics. 21, 799-810 (2012).
- Iguchi, T., Yagi, H., Wang, C. C., Sato, M. A tightly controlled conditional knockdown system using the Tol2 transposon-mediated technique. PloS ONE. 7, e33380 (2012).
