Summary
एक न्यूनतम इनवेसिव तकनीक नवजात subventricular क्षेत्र electroporation के रूप में भेजा प्रदर्शित करता है. तकनीक नवजात पिल्ले के पार्श्व ventricles में प्लास्मिड डीएनए इंजेक्शन और बिजली के वर्तमान आवेदन वितरित करने के लिए होते हैं और आनुवंशिक रूप से तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं में हेरफेर
Abstract
तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एनएससी) प्रसवोत्तर पार्श्व ventricles लाइन और जो न्यूरॉन्स astrocytes, और ependymal कोशिकाओं में शामिल हैं 1 कई प्रकार की कोशिकाओं को जन्म देते हैं. आणविक एनएससी प्रतिबद्धता आत्म नवीकरण के लिए जिम्मेदार रास्ते, और भेदभाव को समझना उनके अद्वितीय क्षमता का दोहन करने के लिए मस्तिष्क की मरम्मत करने के लिए और बेहतर केंद्रीय तंत्रिका तंत्र विकारों को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. स्तनधारी प्रणालियों के हेरफेर के लिए पिछले विधियों पूरे जानवर 2 स्तर पर जेनेटिक इंजीनियरिंग के समय लेने और महंगी प्रयास की आवश्यकता है. इस प्रकार, अध्ययन के विशाल बहुमत इन विट्रो में या अकशेरूकीय में एनएससी अणुओं के कार्यों का पता लगाया है.
यहाँ, हम नवजात NPCs कि नवजात subventricular क्षेत्र electroporation (SVZ) के रूप में संदर्भित किया जाता है में हेरफेर करने के लिए सरल और तेजी से तकनीक का प्रदर्शन. इसी तरह की तकनीक एक दशक पहले विकसित किए गए अध्ययन करने के लिए भ्रूण एनएससी और cortica पर अध्ययन सहायता प्राप्तएल विकास 3,4. हाल ही में इस प्रसवोत्तर कृंतक अग्रमस्तिष्क 5-7 अध्ययन करने के लिए लागू किया गया था. इस तकनीक SVZ एनएससी और उनके वंशज के मजबूत लेबलिंग में परिणाम है. इस प्रकार, प्रसवोत्तर SVZ electroporation एक और स्तनधारी एनएससी जेनेटिक इंजीनियरिंग के लिए समय प्रभावी वैकल्पिक लागत प्रदान करता है.
Protocol
इस प्रक्रिया येल IACUC आवश्यकताओं के साथ अनुसार में है. वैज्ञानिकों को यकीन है कि IACUC दिशा निर्देशों को मंजूरी दे दी है और उनके संस्थागत आवश्यकताओं के अनुसार का पालन करना चाहिए.
1. धारा 1. डीएनए, समाधान, और ग्लास Pipettes की तैयारी
- उच्च (260 ओवर ड्राफ्ट / 280 1.80>) उच्च शुद्धता (/ छ μl 2.5>) एकाग्रता endotoxin मुक्त डीएनए उत्पन्न करता है.
- एक 22 सुक्ष्ममापी फिल्टर के माध्यम से 0.9% नमकीन घोल और बाँझ फिल्टर तैयार.
- Place 10 सेमी आग पॉलिश borosilicate ग्लास केशिका ट्यूब (1.5 मिमी, आईडी: आयुध डिपो 1.10 मिमी) एक पीपी-830 Narishige पीसी-10 एक KANTHAL तार के साथ कांच विंदुक डांड़ी मॉडल में. सेट डांड़ी 70.5 पर एक कदम भारित पुल डिग्री सेल्सियस तोड़ परिपत्र संदंश के साथ सुझाव और दांतेदार किनारों के लिए एक विदारक खुर्दबीन के नीचे का निरीक्षण. बेवल सुझावों और 15 मिनट के लिए एक यूवी दीपक के तहत जगह. खींच pipettes टिप के किनारे से 2 मिमी पर चिह्नित किया जाना चाहिए.
- 0.1% तैयार / वजन मात्रा तेजी से हरे रंग solutiपर मिश्रण बाँझ फ़िल्टर्ड 0.9% सूखी तेजी से हरे रंग के साथ नमकीन घोल से.
2. धारा 2. पशु तैयार करना, ग्लास विंदुक लोड हो रहा है और प्लास्मिड इंजेक्शन
- प्रसव के बाद दिन 0-1 पिल्ले व्यक्तिगत पिंजरों से, एक गिलास पेट्री डिश 4 पूर्व ठंडा पर जगह निकालें ° सी, और फिर गीला बर्फ पर जगह.
- लगभग 5 मिनट के बाद पैर चुटकी प्रतिक्रिया का उपयोग करके anesthetization की स्थिति का पता लगाने के. यदि कोई आंदोलन होता है, intraventricular इंजेक्शन के लिए विषय पिल्ले.
- यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि तेजी से हरे, डीएनए, और खारा समाधान के संयोजन तेजी से वाष्पीकरण, crystallization, और कांच pipettes की नाकाबंदी में परिणाम कर सकते हैं. इसलिए, एक स्टॉक समाधान और अशेष भाजक parafilm पर 1-2 μl तुरंत इंजेक्शन के लिए पहले उत्पन्न करते हैं.
- खींच लिया कांच विंदुक के साथ पूरे aliquoted मात्रा Aspirate.
- अपने अंगूठे और अपने कम प्रमुख हाथ की तर्जनी के बीच पिल्ला के सिर पकड़ो.
- एक दीपक चालूप्रकाश किरण के बस के बाहर पिल्ला के सिर पकड़. यदि आवश्यक हो, सिर पर खारा डाल पिल्ला से परिलक्षित प्रकाश की राशि को कम करने. ventricles अब प्रबुद्ध होना चाहिए.
- अपने प्रमुख हाथ के साथ, पार्श्व (चित्रा 1 ए और 1 बी) निकटतम निलय में सुई डालने. इंजेक्शन के स्थल lambdoid सिवनी और आंख और 2 मिमी बाण के समान सीवन पार्श्व से लगभग समदूरस्थ होना चाहिए. सम्मिलित करें एक P0 पिल्ला के लिए 2 मिमी निशान विंदुक खींच है जो पार्श्व वेंट्रिकल में प्रवेश सुनिश्चित करना चाहिए. संयोग से, आप वापस विंदुक में सी.एस.एफ. की intracranial दबाव के रिलीज से भरने सकता है. Intracranial दबाव है, जो प्लाज्मिड के इंजेक्शन में सहायता कम करने के लिए, 2.8 pup.Step के सिर पर अपनी पकड़ को ढीला. प्लाज्मिड के पार्श्व वेंट्रिकल का उपयोग कर एक हवा दबाव सुई लगानेवाला (Picospritzer, पार्कर) में लगभग 0.5 μl इंजेक्षन.
3. धारा 3. Electroporation और रिकवरी
- सेelectroporation जनरेटर के 5 वर्ग दालों, 50 मिसे / नाड़ी 100 वोल्ट पर 950 मिसे के अंतराल के साथ के लिए वोल्टेज टी. प्लाज्मिड electroporation के स्थानिक विशिष्टता चार्ज हस्तांतरण की दिशात्मकता द्वारा निर्धारित होता है. करीब ध्यान 8 SVZ साथ स्टेम सेल आबादी की विविधता दी गई नियुक्ति को दी जानी चाहिए. प्रसार और सेल भाग्य की दरों में अंतर के उदर पृष्ठीय और व्याख्यान चबूतरे वाला - लांगुलिय 9,10 स्थानों के लिए पहचान की गई है.
- एक बार प्लाज्मिड इंजेक्शन, पीबीएस में डुबकी मोचनी इलेक्ट्रोड. इस चरण के लिए चार्ज हस्तांतरण को अधिकतम करने के लिए और प्रतिरोधकता की वजह से जल को रोकने के लिए है.
- प्लाज्मिड इंजेक्शन की साइट (चित्रा 1C और 1D) ipsilateral कान के पास पिल्ला की पृष्ठीय पार्श्व दीवार पर इलेक्ट्रोड सकारात्मक रखें. Contralateral गोलार्द्ध है पिल्ला थूथन उदर पार्श्व पर नकारात्मक इलेक्ट्रोड रखें.
- नाड़ी foots को दबाकर वर्तमान हस्तांतरण आरंभचुड़ैल पेडल और पृष्ठीय से ° ~ कोण अंतराल 25 का उपयोग कर पार्श्व इलेक्ट्रोड झाडू.
- 5 मिनट के लिए एक हीटिंग पैड पर रखें पिल्ले electroporated. धीरे पिल्ले हल्के उत्तेजना के साथ बारी बारी से हर 30 सेकंड.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
लगभग सभी रेडियल glia पृष्ठीय, पृष्ठीय पार्श्व, और पार्श्व subventricular मोचनी इलेक्ट्रोड के "व्यापक" आंदोलन (चित्रा 1E) के बाद क्षेत्र से सटे की लेबलिंग में नवजात subventricular क्षेत्र electroporation परिणाम है. हालांकि, electroporation संबंधित प्रयोग की आवश्यकता के अनुरूप किया जा सकता है, लेकिन व्यापक और नहीं इलेक्ट्रोड विशिष्ट स्थान और वीडियो में विस्तृत रूप में उन्मुखीकरण का उपयोग. उदाहरण के लिए, क्योंकि पृष्ठीय स्थानीयकृत रेडियल glia उन अस्तर से निलय के पार्श्व भाग अलग, एक करने के लिए केवल एक ही 9,10 क्षेत्र electroporate चुना जा सकता है. इसके अलावा विशिष्टता भी छोटे इलेक्ट्रोड का उपयोग किया जा सकता है.
प्लास्मिड डीएनए पहले तीन 11 सप्ताह के भीतर तेजी से पतला है. इसलिए, की पहचान genomically संशोधित प्लास्मिड डीएनए का उपयोग कोशिकाओं की सिफारिश नहीं है. इस सीमा को दरकिनार, CRE recombinase व्यक्त plasmids introdचूहे जो एक बंद lox एक genomically व्यक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन (tdTomato) 12 के अपस्ट्रीम पी साइटों द्वारा flanked अनुक्रम में GFP के साथ uced. पुनर्संयोजन पर, रोक अनुक्रम हटा दिया है और फ्लोरोसेंट प्रोटीन (चित्रा 1F) व्यक्त किया है. चार सप्ताह के बाद electroporation कुछ GFP प्लाज्मिड व्यक्त कोशिकाओं subventricular क्षेत्र में देखा जाता है जबकि कई और अधिक tdTomato सकारात्मक कोशिकाओं में देखा जाता है. घ्राण बल्ब यह भी स्पष्ट है कि tdTomato व्यक्त कोशिकाओं की तुलना में अब तक कम GFP व्यक्त कोशिकाओं मौजूद हैं सेक्शनिंग पर, लेकिन दोनों परिपक्व ग्रेन्युल कोशिकाओं (चित्रा 1G) की सुविधाओं को प्राप्त कर लिया है.
चित्रा 1. नवजात subventricular क्षेत्र electroporation. (ए) के योजनाबद्ध आरेखवेंट्रिकुलर सिस्टम और रीढ़ की हड्डी के साथ मस्तिष्कमेरु द्रव (चैती) युक्त पिल्ला P0-P1 बढ़ाया GFP (EGFP) इंजेक्शन के साथ प्रकाश डाला प्लाज्मिड एन्कोडिंग (हरा) (बी) के कोरोनल खंड इंजेक्शन साइट और पार्श्व वेंट्रिकल के सापेक्ष paddles के उन्मुखीकरण दिखा. (सी) (-) नकारात्मक के अभिविन्यास और पिल्ला इंजेक्शन (डी) एक पिल्ला निम्नलिखित electroporation क्षैतिज दृश्य पर XYZ अक्ष सम्मान के साथ सकारात्मक इलेक्ट्रोड (+) (ई) पार्श्व वेंट्रिकल एक EGFP एन्कोडिंग वेक्टर 24 घंटा निम्नलिखित electroporation की छवि. recombinase (हरा) (एफ) CRE के electroporation के बाद 28 दिनों के पार्श्व वेंट्रिकल की छवि और एक को रोकने के कोडोन tdTomato नदी के ऊपर ले जाने के चूहों में plasmids EGFP एन्कोडिंग. पुनर्संयोजन tdTomato (लाल) की अभिव्यक्ति लाती है. कुछ genomically व्यक्त tdTomato जबकि शेष EGFP सकारात्मक SVZ कोशिकाओं में प्लाज्मिड परिणाम के लगातार dilutions स्थायी रूप से व्यक्त की है. (G)प्लास्मिड डीएनए (हरा) के कमजोर पड़ने दिया है कि घ्राण बल्ब की ग्रेन्युल सेल परत में और अधिक कोशिकाओं जीनोमिक मार्कर, tdTomato (लाल) व्यक्त स्पष्ट है. एल.वी.: पार्श्व निलय, ओबी: घ्राण बल्ब. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
यहाँ हम नवजात SVZ electroporation की तकनीक, एक तेजी से और robustly लेबल और तकनीक SVZ स्टेम सेल और उनके संतान में हेरफेर करने के लिए विस्तार. वहाँ कई फायदे कि electroporation अन्य तकनीकों की तुलना में है. सबसे पहले, कोशिकाओं की फोकल लेबलिंग दिया, एक सेल स्वायत्त और गैर सेल स्वायत्त प्रभाव विचार करने में सक्षम है. दूसरा, आनुवंशिक हेरफेर inducible सिस्टम का उपयोग कर एक से पहले या synaptic एकीकरण के बाद प्रभाव की तुलना करने के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, एक बाईपास loxP साइटों युक्त plasmids के साथ रचनात्मक व्यक्त चूहों electroporating द्वारा कई plasmids का उपयोग कर सकते हैं. चौथा, जीन संवाददाता plasmids transcriptional transactivation का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस मामले में, transcriptional गतिविधि केवल कोशिकाओं कि छेड़छाड़ कर रहे हैं में मापा जा सकता है, जोडी विशिष्टता उपक्षेत्र microdissected पेश किया जा सकता है. पांचवां, पारगमन amplifying कोशिकाओं के क्षणिक लेबलिंग जारी रखा प्रसार की वजह से कमजोर पड़ने और ओच प्लाज्मिड "birthdating" thymidine analogs 11 के साथ लेबलिंग करने के लिए इसी तरह की पद्धति के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. छठी, हालांकि कोशिकाओं के क्षणिक लेबलिंग एक नुकसान के रूप में देखा जा सकता है, तकनीक Transposase transposon जोड़े जीनोमिक 13 एकीकरण के लिए प्रेरित करने के लिए उत्तरदायी होना चाहिए. वैकल्पिक रूप से, चल रहे neurogenesis CRE recombinase के साथ परिवर्तित किया जा सकता है loxP 7,11 साइटों के द्वारा flanked alleles वाले चूहों के जीनोमिक संशोधन के लिए प्रेरित करना है. इस प्रोटोकॉल का प्रयोग, नवजात न्यूरॉन्स चूहों Rosa26R बंद करो tdTomato जिसमें एक बंद कैसेट loxP 12 साइटों द्वारा flanked है में चार महीने के बाद electroporation के लिए पहचान की गई है. साथ में ले ली, नवजात SVZ electroporation क्षणिक या स्थायी आनुवंशिक हेरफेर और अग्रमस्तिष्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं और नवजात न्यूरॉन्स की लेबलिंग के लिए एक प्रभावी लागत और समय कुशल न्यूनतम इनवेसिव उपकरण है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखक करने के लिए कोई खुलासे है.
Acknowledgments
इस काम के रक्षा विभाग (आइडिया विकास पुरस्कार, W81XWH-10-1-०,०४१, एबी), सीटी स्टेम सेल (एबी) अनुदान, और स्वास्थ्य 10668225 एनआरएसए (DMF) का एक राष्ट्रीय संस्थान से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. वर्तमान सामग्री आंशिक रूप से कनेक्टिकट स्टेम सेल अनुसंधान अनुदान कार्यक्रम के तहत कनेक्टिकट के राज्य द्वारा समर्थित काम पर आधारित है. इसकी सामग्री केवल लेखकों की ज़िम्मेदारी है और कनेक्टिकट, कनेक्टिकट या सीटी नवाचार के राज्य के लोक स्वास्थ्य विभाग के राज्य के अधिकारी विचार जरूरी नहीं प्रतिनिधित्व, इंक funders अध्ययन डिजाइन में कोई भूमिका नहीं थी, डाटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heavy Polished Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | BF150-110-10 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narishige | PC-10H | |
| Fast Green | Fischer Scientific | 0521192205 | |
| ECM 830 Square Wave Pulse generator | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Tweezertrodes | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12-562-36 | |
| Tungsten Halogen lamp | USHIO America, Inc | 1002247 | |
| Picospritzer II | Parker Instruments | 052-0312-900 |
References
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
- Imayoshi, I., Sakamoto, M., Kageyama, R. Genetic methods to identify and manipulate newly born neurons in the adult brain. Frontiers in Neuroscience. 5, 64 (2011).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i120-i125 (2009).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PloS ONE. 3, e1883 (2008).
- Chesler, A. T., et al. Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis. PloS ONE. 3, e1517 (2008).
- Platel, J. C., et al. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
- Alvarez-Buylla, A., Kohwi, M., Nguyen, T. M., Merkle, F. T. The heterogeneity of adult neural stem cells and the emerging complexity of their niche. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 73, 357-365 (2008).
- Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis. Neural Development. 6, 13 (2011).
- de Chevigny, A., et al. miR-7a regulation of Pax6 controls spatial origin of forebrain dopaminergic neurons. Nature Neuroscience. 15, 1120-1126 (2012).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Frontiers in Neuroscience. 4, (2010).
- Feliciano, D. M., Quon, J. L., Su, T., Taylor, M. M., Bordey, A. Postnatal neurogenesis generates heterotopias, olfactory micronodules and cortical infiltration following single-cell Tsc1 deletion. Human Molecular Genetics. 21, 799-810 (2012).
- Iguchi, T., Yagi, H., Wang, C. C., Sato, M. A tightly controlled conditional knockdown system using the Tol2 transposon-mediated technique. PloS ONE. 7, e33380 (2012).
