Summary
우리는 신생아 subventricular 영역 electroporation라고 최소한 침입 기술을 보여줍니다. 기술은 신생아 새끼의 측면 심실에 플라스미드 DNA를 주입하고 전달하는 전기 전류를 적용 구성되어 있으며, 유전자 신경 줄기 세포를 조작
Abstract
신경 줄기 세포 (NSCs)는 라인 출생 후의 측면 심실하고 뉴런, astrocytes, 그리고 ependymal 세포 1 등 여러 세포 유형에 상승을 제공합니다. 분자 NSC 자기 갱신, 노력에 대한 책임 경로와 차별화를 이해하는 것은 활용 뇌를 수리하고 더 나은 중추 신경계 장애를 이해하는 독특한 가능성에 중요합니다. 포유류의 시스템의 조작에 대한 이전 방법은 전체 동물의 2 단계에서 유전 공학의 시간이 소요 비싼 노력이 필요했습니다. 따라서, 연구의 대부분은 체외 또는 무척추 동물의 NSC 분자의 기능을 살펴 보았다.
여기, 우리는 신생아 subventricular 구역 (SVZ) electroporation로 언급됩니다 신생아 NPCs를 조작 할 수있는 간단하고 빠른 방법을 보여줍니다. 비슷한 기술은 배아 NSCs을 공부하는 10 년 전 개발 및 cortica에 대한 연구를 도와 왔으며리터 개발 3,4. 최근이는 출생 후의 쥐 forebrain은 5-7 공부 적용되었습니다. 이 기술 SVZ NSCs과 자손의 강력한 라벨의 결과입니다. 따라서, 출생 후의 SVZ electroporation은 포유류의 NSC 유전 공학을위한 비용 및 시간 효율적인 대안을 제공합니다.
Protocol
이 절차는 예일 IACUC 요구 사항에 따라 수 있습니다. 과학자들은 IACUC 가이드 라인은 자신의 기관 요구 사항에 따라 승인 및 준수되어 있는지 확인해야합니다.
1. 제 1 항. DNA, 솔루션 및 유리 피펫의 준비
- 고순도 (OD 280분의 260> 1.80) 높은 농도 (μg / μl> 2.5) 독소가없는 DNA를 생성 할 수 있습니다.
- 22 μm 필터를 통해 0.9 % 생리 식염수와 멸균 필터를 준비합니다.
- 장소 10cm 화재 광택 붕규산 유리 모세관 튜브 (OD : 1.5 mm, ID : 1.10 mm) 모델 kanthal 와이어와 PP-830 Narishige PC-10 유리 피펫 풀러에. 70.5에서 한 단계 가중 풀다운 ° C.에 풀러를 설정 원형 집게와 팁을 해제하고 계단 가장자리에 해부 현미경으로 검사한다. 15 분을위한 UV 램프 아래에 베벨 팁과 장소. 당겨 피펫은 팁의 가장자리에서 2mm에서 표시해야합니다.
- 무게 / 볼륨 빠른 그린 soluti 0.1 % 준비건조 빠른 그린과 혼합 살균 필터 0.9 % 생리 식염수로 있습니다.
2. 제 2 항. 동물 준비, 유리 피펫 로딩 및 플라스미드 주입
- 유리 페트리 접시 4 미리 차가운에, 케이지 0-1 새끼 개별적으로 출생 후의 일 장소를 제거 ° C, 그리고 서부 유럽 표준시 얼음에 위치.
- 약 5 분 후, 도보로 핀치 응답을 이용하여 anesthetization의 상태를 결정합니다. 심실 주사는 전혀 움직임이 발생하지 않으면, 주제 새끼.
- 그것은 빠르고, 녹색, DNA, 그리고 생리 식염수의 조합 빠른 증발, 결정화 및 유리 피펫의 봉쇄 될 수 있습니다하는 것이 중요합니다. 따라서, 주식 솔루션과 주사 직전에 parafilm로 나누어지는 1-2 μl를 생성합니다.
- 당겨 유리 피펫으로 전체 aliquoted 볼륨을 대기음.
- 엄지와 덜 지배적 인 손의 검지 손가락 사이의 강아지의 머리를 잡아.
- 램프를 켜십시오D는 광선 이외의 강아지의 머리를 누르고 있습니다. 필요한 경우, 강아지가 반사 빛의 양을 줄이기 위해 머리에 염분 넣어. 심실 이제 조명해야합니다.
- 당신의 지배적 인 손을 사용하면 (그림 1A 및 1B)에 가장 가까운 측면 심실에 바늘을 삽입합니다. 주사의 사이트는 lambdoid 봉합과 눈과 시상 봉합에 측면 2mm에서 약 등거리 있어야합니다. 삽입은 측면 심실에 침투을 보장해야하는, P0 강아지에 대한 2mm 마크에 피펫을 꺼냈다. 동시에, 당신은 intracranial 압력의 릴리스에서 피펫으로 CSF의 작성 다시 볼 수 있습니다. 플라스미드의 주입을 도와 intracranial 압력을 줄이기 위해 pup.Step 2.8의 머리에 그립을 느슨하게. 공기 압력을 주입기 (Picospritzer, 파커)를 사용하여 측면 뇌실에 플라스미드의 약 0.5 μl를 삽입.
3. 제 3 항. Electroporation 및 복구
- SEt 5 평방 펄스, 950 밀리 초 간격으로 100 볼트 50 밀리 초 / 펄스에 대한 electroporation 발생기의 전압. 플라스미드 electroporation의 공간 특이성은 무료 전송의 방향에 의해 결정됩니다. 닫기주의 SVZ (8)를 따라 줄기 세포 인구의 이질성을 부여 게재 위치를 제공해야합니다. 증식과 세포 운명의 속도의 차이는 복부 - 등쪽과 뱃 부리 장식이있는 - 꼬리 위치 9,10에 대한 확인되었습니다.
- 일단 플라스미드는 딥 트위터 전극은 PBS로, 주입된다. 이 단계는 요금이 전송을 극대화하고 저항으로 인한 화상을 방지하는 것입니다.
- 플라스미드 주사의 사이트 (그림 1C 및 1D)에 ipsilateral 귀 근처에있는 강아지의 등 측면 벽에 긍정적 인 전극을 배치합니다. 의 강아지 코에 contralateral 반구 복부 측면에 부정적인 전극을 배치합니다.
- 펄스 foots를 눌러 현재 송금을 시작합니다마녀는 등쪽에서 ~ 25 ° 각도 간격을 사용하여 측면에 전극 페달하고 지나간다.
- 장소 5 분의 가열 패드에 새끼를 electroporated. 부드럽게 부드러운 자극과 새끼 매 30 초를 회전 할 수 있습니다.
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Representative Results
트위터 전극의 "탁"운동 (그림 1E) 다음 등쪽의, 등쪽의 측면, 그리고 측면 subventricular 구역과 인접 거의 모든 요골 glia의 라벨에 신생아 subventricular 영역 electroporation 결과이다. 그러나, electroporation은 각 실험의 요구에 맞는하지만 전극을 샅샅이 및 비디오 상세과 같은 특정 위치와 방향을 사용하지 할 수 있습니다. dorsally 현지화 반경 glia 이러한 안감에서 심실의 측면 부분을 다른부터 예를 들어, 하나는 단지 하나의 지역 9,10를 electroporate하기 위해 선택할 수 있습니다. 또한 특이성은 작은 전극을 사용하여 제공 할 수 있습니다.
플라스미드 DNA는 빠르게 첫 3 주 동안 11에서 희석된다. 따라서, 플라스미드 DNA를 사용하여 식별 genomically 수정 전지는 사용하지 않는 것이 좋습니다. 이 제한을 회피하기 위해 CRE recombinase 표현 plasmids은 introd 아르상류 genomically 표현 형광 단백질 (tdTomato) 12의 훈제 연어 P 사이트으로 둘러싸인 정지 순서를 마우스로 GFP와 함께 uced. 재조합시, 정지 시퀀스는 제거되고 형광 단백질 (그림 1 층) 표시됩니다. 더 많은 tdTomato 긍정적 인 세포를 보는 반면, 사주에 의해 후 electroporation 몇 GFP 플라스미드 표현 세포는 subventricular 영역에서 볼 수 있습니다. 이 tdTomato 표현 세포에 비해 훨씬 적은 GFP 표현 셀이 존재하는 것 또한 명백 후각 망울을 sectioning시, 그러나 모두 성숙 과립 세포의 기능 (그림 1G)을 획득했습니다.
1 그림. 신생아 Subventricular 지대 Electroporation. 의 (A) 도식 다이어그램뇌척수 (청록색)을 포함 심실 시스템과 척추와 강아지 P0-P1은 (녹색) 플라스미드 인코딩 강화 GFP (eGFP)에 주입 강조했다. (B) 코로나 섹션 주사 사이트 및 측면 심실에 비해 노의 방향을 보여줍니다. (C) . (-) 마이너스의 방향. 강아지 다음 electroporation의 강아지 주입 (D) 가로보기에서 XYZ 축에 대해 (+)와 긍정적 인 전극 eGFP 인코딩 벡터의 측면 심실 24 시간 다음 electroporation의 (E) 이미지 (녹색). 28일 CRE의 electroporation 후 측면 심실의 (F) 이미지 recombinase 및 tdTomato의 상류 정지 코돈을 가진 마우스에 eGFP-인코딩 plasmids. 재조합은 tdTomato (레드)의 표현을 유도한다. genomically 표현 tdTomato 반면에 몇 가지 남아있는 eGFP 긍정적 인 SVZ 세포에 플라스미드 결과의 연속 dilutions가 영구적으로 표시됩니다. (G)플라스미드 DNA (녹색)의 희석은 후각 망울의 과립 세포 레이어에 더 많은 세포가 게놈 마커, tdTomato (빨간색)를 표현하는 점을 감안할 때 명백합니다. LV : 측면 심실, OB : 후각 망울. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
다음은 세부 신생아 SVZ의 electroporation의 기술, 신속하고 견고 라벨 및 SVZ의 줄기 세포와 자손을 조작 할 수있는 기술을. electroporation 다른 기술에 비해 가지고 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 세포의 초점 라벨에 따라, 하나는 세포 자율적와 비 세포 자율적 인 효과를 판별 할 수 있습니다. inducible 시스템을 사용하여 둘째, 유전자 조작 한 사전이나 신경 통합 후 효과를 비교할 수 있습니다. 또한, 하나는 loxP 사이트를 포함 plasmids과 CRE 표현 쥐를 electroporating하여 여러 plasmids의 사용을 무시할 수 있습니다. 넷째, 유전자 기자 plasmids은 전사 transactivation을 공부하는 데 사용할 수 있습니다. 이 경우 전사 활동은 조작 아르 셀로 측정 될 수있다; 하위 지역이 microdissected 때 추가 특이성 소개 할 수 있습니다. 다섯째, 과도 지속적인 확산으로 인해 교통 증폭기 세포의 라벨 및 희석 OF 플라스미드는 thymidine analogs 11 라벨과 유사 "birthdating"방법으로 사용할 수 있습니다. 세포의 과도 라벨이 단점으로 볼 수 있지만, 여섯 번째는,이 기술은 게놈 통합 13 유도 할 transposase-transposon 쌍 의무가 있어야합니다. 또한, 지속적으로 neurogenesis는 loxP 사이트 7,11으로 둘러싸인 대립 유전자를 포함하는 쥐 게놈 수정을 유도하기 위해 CRE recombinase으로 변경 될 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여, 신생아 뉴런은 정지 카세트가 loxP 사이트 12 둘러싸인되는 Rosa26R - 스톱 tdTomato 마우스에서 4 개월 후 electroporation까지 확인되었습니다. 함께 촬영, 신생아 SVZ의 electroporation은 과도 또는 영구적 인 유전자 조작 및 forebrain 신경 줄기 세포 및 신생아 뉴런의 라벨을위한 비용 효과적인와 시간을 효율적으로 최소한 침략 도구입니다.
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Disclosures
저자되도록 할 공개가 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 국방부 (아이디어 개발 상, W81XWH-10-1-0041, AB), CT 줄기 세포 기금 (AB) 및 건강 NRSA 10668225 (DMF)의 국립 연구소에서 보조금에 의해 지원되었다. 현재 자료는 부분적으로 코네티컷의 줄기 세포 연구 보조금 프로그램의 코네티컷 주에서 지원 작업에 기반을두고 있습니다. 의 내용이 전적으로 저자의 책임이며 반드시 코네티컷 코네티컷 또는 중부 표준시 혁신의 주 공공 보건부의 국가의 공식 전망을 대표하지 않습니다 주식회사 funders는 데이터 수집을 연구 설계에 역할을 없었다 및 분석, 게시하는 결정, 또는 원고의 준비.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heavy Polished Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | BF150-110-10 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narishige | PC-10H | |
| Fast Green | Fischer Scientific | 0521192205 | |
| ECM 830 Square Wave Pulse generator | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Tweezertrodes | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12-562-36 | |
| Tungsten Halogen lamp | USHIO America, Inc | 1002247 | |
| Picospritzer II | Parker Instruments | 052-0312-900 |
References
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