Summary
Nós demonstramos uma técnica minimamente invasiva referido como eletroporação zona neonatal subventricular. A técnica consiste em injectar o DNA de plasmídeo nos ventrículos laterais de bebés recém-nascidos e na aplicação de corrente eléctrica para fornecer e manipular geneticamente as células estaminais neurais
Abstract
As células estaminais neurais (NSC) linha dos ventrículos laterais pós-natais e dão origem a vários tipos de células que incluem neurónios, astrócitos e células ependimais 1. Entender os caminhos moleculares responsáveis pela NSC auto-renovação, compromisso e diferenciação é fundamental para aproveitar o seu potencial único para reparar o cérebro e entender melhor sistema nervoso central. Os métodos anteriores para a manipulação de sistemas de mamíferos necessário o esforço demorado e caro de engenharia genética a nível animal inteiro 2. Assim, a grande maioria dos estudos têm explorado as funções de moléculas NSC in vitro ou in invertebrados.
Aqui, nós demonstrar a técnica simples e rápida para manipular NPCs neonatais que é referido como neonatal eletroporação subventricular zona (SVZ). Técnicas semelhantes foram desenvolvidos há uma década para estudar NSCs embrionárias e ajudaram estudos sobre Cortical desenvolvimento 3,4. Mais recentemente, esta foi utilizada para estudar o prosencéfalo roedor pós-natal 5-7. Esta técnica resulta em rotulagem robusto de SVZ NSCs e seus descendentes. Assim, pós-natal SVZ electroporação proporciona uma alternativa de custo e de tempo eficaz para a engenharia genética de mamíferos NSC.
Protocol
Este procedimento está em conformidade com os requisitos de Yale IACUC. Os cientistas devem se certificar de que as orientações IACUC são aprovados e seguido de acordo com as suas necessidades institucionais.
1. Seção 1. Preparação do Pipetas de DNA, Soluções e vidro
- Gerar alta pureza (OD 260/280> 1,80) elevada concentração (ug / uL> 2,5) endotoxinas sem DNA.
- Preparar solução salina 0,9% e filtrar através de um filtro estéril uM 22.
- Colocar 10 centímetros de fogo polidas tubos capilares de vidro de borosilicato (OD: 1,5 mm, ID: 1,10 mm) em um modelo de PP-830 PC-10 Narishige pipeta de vidro com um puxador de fio de Kanthal. Definir puxador para puxar uma etapa uma ponderada em 70,5 ° C. Quebrar dicas com fórceps circulares e inspecionar sob um microscópio de dissecação para as bordas recortadas. Dicas de bisel e coloque sob uma lâmpada UV por 15 min. Pipetas puxados deve ser marcado menos 2 mm a partir da borda da ponta.
- Prepare 0,1% em peso / volume rápido verde solutipela mistura estéril filtrada solução salina 0,9% com o verde de secagem rápida.
2. Seção 2. Preparação Animal, vidro Pipeta Carregando e Injeção plasmídeo
- Remover dia pós-natal 0-1 filhotes individualmente a partir de gaiolas, lugar para uma placa de Petri de vidro pré-refrigerada a 4 ° C, e depois colocar em gelo húmido.
- Após aproximadamente 5 minutos, determinar o estado de anestesia, utilizando a resposta pitada pé. Se nenhum movimento ocorre, filhotes sujeitos à injeção intraventricular.
- É importante notar que a combinação de verde rápido, DNA, e solução salina podem resultar na rápida evaporação, cristalização, e o bloqueio de pipetas de vidro. Por isso, gerar uma solução estoque e ul alíquota 1-2 para parafilme imediatamente antes da injecção.
- Aspirar todo o volume alíquota com a pipeta de vidro puxado.
- Segure a cabeça do filhote entre o polegar eo dedo indicador de sua mão menos dominante.
- Ligue uma lâmpadad segurar a cabeça do filhote de cachorro do lado de fora do feixe de luz. Se necessário, colocar sobre a cabeça de salina para reduzir a quantidade de luz reflectida por pup. Os ventrículos agora deve ser iluminado.
- Com sua mão dominante, inserir a agulha no ventrículo lateral mais próxima de você (Figura 1A e 1B). O local de injecção deve ser de aproximadamente equidistante da sutura lambdóide e olho e 2 mm lateral da sutura sagital. Insira pipeta puxado para a marca de 2 mm para uma pup P0, que deve assegurar a penetração no interior do ventrículo lateral. Coincidentemente, você pode ver de volta o preenchimento do QCA na pipeta da liberação da pressão intracraniana. Para reduzir a pressão intracraniana, o que ajuda a injeção do plasmídeo, afrouxar seu aperto na cabeça do pup.Step 2.8. Injectar cerca de 0,5 ul de plasmídeo no ventrículo lateral, usando um injector de ar sob pressão (Picospritzer, Parker).
3. Seção 3. Eletroporação e Recuperação
- Set a tensão do gerador de electroporação para 5 impulsos quadrados, 50 ms / pulso de 100 volts, com intervalos de 950 mseg. A especificidade espacial de electroporação plasmídeo é ditada pela direccionalidade de transferência de carga. Uma atenção especial é dada à colocação dada a heterogeneidade da população de células-tronco ao longo da SVZ 8. Diferenças nas taxas de proliferação e destino da célula foram identificados para locais ventral-dorsal e rostral-caudal 9,10.
- Uma vez que o plasmídeo é injectado, dip eléctrodos pinça em PBS. Este passo é o de maximizar a transferência de carga e para impedir queimaduras provocadas pela resistividade.
- Coloque o eléctrodo positivo sobre a parede dorsal lateral do filhote perto da orelha ipsilateral para o local da injecção de plasmídeo (Figura 1C e 1D). Coloque o eletrodo negativo no hemisfério contralateral ventral lateral para o filhote do focinho.
- Iniciar a transferência atual pressionando as foots pulsobruxa pedal e varrer os eletrodos dorsal para lateral usando ~ 25 ° de ângulo intervalos.
- Lugar electroporado crias num bloco de aquecimento durante 5 min. Gire gentilmente filhotes a cada 30 seg com estimulação leve.
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Representative Results
Neonatal resulta zona subventricular electroporação na rotulagem de quase todos glia radial contígua com a zona subventricular dorsal, dorsal lateral, e o movimento lateral, seguindo "varrer" do eléctrodo de pinça (Figura 1E). No entanto, a electroporação pode ser adaptado para as necessidades do respectivo ensaio, mas não varrer o eléctrodo e utilizando a colocação e orientação específica, conforme detalhado no vídeo. Por exemplo, uma vez localizada dorsalmente glia radial diferem daqueles revestimento da secção lateral do ventrículo, pode-se optar por apenas uma única região electroporate 9,10. Especificidade adicional pode ser dada através de eletrodos menores.
O DNA de plasmídeo é rapidamente diluída dentro dos primeiros três semanas 11. Portanto, para identificar as células genomicamente modificados usando DNA de plasmídeo não é recomendada. Para contornar esta limitação, plasmídeos CRE recombinase expressando são introduced juntamente com GFP em ratinhos que possuem uma sequência de paragem flanqueado por sítios lox P a montante de uma proteína expressa genomicamente fluorescente (tdTomato) 12. Após a recombinação, a sequência de paragem for removida e a proteína fluorescente é expressada (Figura 1F). Por quatro semanas pós-electroporação poucas células que expressam GFP plasmídeo são vistas na zona subventricular que muitas mais células positivas tdTomato são vistos. Após a secção do bolbo olfactivo, é também evidente que, em comparação com células que expressam tdTomato, as células que expressam GFP muito menos estão presentes, no entanto ambos adquiriram características de células granulares maduros (Figura 1G).
Figura 1. Eletroporação Zona Neonatal subventricular. (A) Diagrama esquemático de umP0 P1-cachorro com sistema ventricular e da medula espinhal contém líquido cefalorraquidiano (verde azulado) destacou injetado com maior GFP (eGFP) plasmídeo (Verde). (B) Secção coronal mostrando a orientação das pás em relação ao local da injeção e ventrículo lateral. (C) Orientação de negativos (-).. eletrodos e positivo (+) com relação a XYZ eixo sobre injetada filhote vista (D) Horizontal de um filhote de cachorro eletroporação seguinte (E) Imagem da lateral eletroporação hr ventrículo 24 seguinte de um vetor eGFP-codificação (verde). (F) da imagem do ventrículo lateral 28 dias após a electroporação de recombinase CRE-eGFP e codificação de plasmídeos em ratinhos que transportam um codão de paragem a montante do tdTomato. Recombinação induz a expressão de tdTomato (vermelho). Diluições sucessivas de resultado plasmídeo em poucos remanescentes EGFP células SVZ positiva, enquanto tdTomato genomicamente expressa é permanentemente expressa. (G)Diluição de DNA de plasmídeo (verde) pode ser apreciado, uma vez que mais células na camada de células granulares do bulbo olfativo expressar o marcador genômico, tdTomato (vermelho). LV: ventrículos laterais; OB: bulbo olfatório. Clique aqui para ver maior figura .
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Discussion
Aqui nós detalhe a técnica de electroporação SVZ neonatal, uma técnica para rapidamente e de forma robusta e rotular manipular as células-tronco SVZ e seus descendentes. Há várias vantagens que tem a electroporação, em comparação com outras técnicas. Em primeiro lugar, dada a marcação focal de células, é capaz de discernir celulares autónomos e não autónomos efeitos célula. Manipulação, segundo genética utilizando sistemas indutíveis permite comparar o efeito antes ou após integração sináptica. Além disso, pode-se evitar a utilização de plasmídeos múltiplos electroporating ratinhos que expressam CRE com plasmídeos contendo locais loxP. Em quarto lugar, plasmídeos repórter gene pode ser utilizado para estudar a transactivação da transcrição. Neste caso, a actividade transcripcional pode ser medido apenas em células que são manipuladas; especificidade adicionados podem ser introduzidos quando subregiões são microdissecados. Em quinto lugar, a rotulagem transiente de células de amplificação em trânsito devido à proliferação contínua e diluição of o plasmídeo pode ser utilizado como "birthdating" método semelhante ao marcação com timidina análogos 11. Em sexto lugar, embora a rotulagem transiente de células pode ser vista como uma desvantagem, a técnica devem ser passíveis de transposase-pares de transposões para induzir a integração genômica 13. Como alternativa, a neurogênese em curso pode ser alterado com CRE recombinase para induzir modificações genômico de camundongos contendo alelos ladeado por locais loxP 7,11. Usando este protocolo, os neurônios recém-nascidos foram identificados até quatro meses pós-eletroporação em Rosa26R-Stop-tdTomato ratos em que a cassete parada é ladeado por locais loxP 12. Tomados em conjunto, eletroporação SVZ neonatal é um custo eficaz e tempo eficiente ferramenta minimamente invasiva para a manipulação genética transitória ou permanente e rotulagem de células-tronco neurais e prosencéfalo neurônios recém-nascidos.
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Disclosures
Os autores não têm a revelação a fazer.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por doações do Departamento de Defesa (prêmio de desenvolvimento Idéia, W81XWH-10-1-0041, AB), CT de células-tronco de subvenção (AB), e um Instituto Nacional de Saúde NRSA 10668225 (DMF). O presente material é baseado no trabalho, em parte suportado pelo Estado de Connecticut sob o Stem Cell Research Connecticut Programa de Subsídios. Seu conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representam necessariamente a posição oficial do Estado de Connecticut, o Departamento de Saúde Pública do Estado de Connecticut ou Inovações CT, Inc. A financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, a coleta de dados e análise, a decisão de publicar, ou a preparação do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heavy Polished Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | BF150-110-10 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narishige | PC-10H | |
| Fast Green | Fischer Scientific | 0521192205 | |
| ECM 830 Square Wave Pulse generator | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Tweezertrodes | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12-562-36 | |
| Tungsten Halogen lamp | USHIO America, Inc | 1002247 | |
| Picospritzer II | Parker Instruments | 052-0312-900 |
References
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