Summary
Мы демонстрируем минимально инвазивной техники называют новорожденных субвентрикулярной электропорации зоне. Методика заключается во введении плазмидной ДНК в боковых желудочков у новорожденных щенков и применение электрического тока для доставки и генетически манипулировать нервных стволовых клеток
Abstract
Нервные стволовые клетки (НСК) линии послеродового боковых желудочков и приводит к нескольким типам клеток, которые включают нейроны, астроциты и клетки эпендимных 1. Понимание молекулярных путей, ответственных за НСК самообновлению, целеустремленность и дифференциация имеет решающее значение для освоения их уникальные возможности для восстановления мозга и лучше понять расстройства центральной нервной системы. Предыдущие методы манипуляции системах млекопитающих требуется много времени и средств деятельности генной инженерии в целом уровень животного 2. Таким образом, подавляющее большинство исследований изучили функции молекулы НСК в пробирке или в беспозвоночных.
Здесь мы покажем, простой и быстрый метод управления новорожденных NPCs, что называют новорожденных субвентрикулярной зону (СВЗ) электропорации. Подобные методы были разработаны десять лет назад для изучения эмбриональных НСК и помогли исследования по corticaл развитие 3,4. Совсем недавно это был применен для изучения послеродовой мозга грызунов 5-7. Этот метод приводит к надежной маркировки SVZ НСК и их потомства. Таким образом, послеродовое SVZ электропорации предоставляет стоимость и время эффективной альтернативой для млекопитающих НСК генной инженерии.
Protocol
Эта процедура осуществляется в соответствии с требованиями Йельского IACUC. Ученые должны убедиться, что IACUC руководящие принципы были утверждены и затем в соответствии с их институциональными требованиями.
1. Раздел 1. Получение ДНК, решения и стеклянных пипеток
- Создание высокой чистоты (OD 260/280> 1,80) высокой концентрации (мкг / мкл> 2,5) эндотоксина ДНК.
- Подготовка 0,9% солевой раствор и стерильных фильтров через 22 мкм фильтр.
- Место 10 см граненые боросиликатного стеклянные капилляры (OD: 1,5 мм, ID: 1,10 мм) в модели PP-830 Narishige PC-10 Съемник стеклянной пипетки с проводом Kanthal. Установить съемник на один шаг взвешенный тянуть на 70,5 ° C. Перерыв советов с круглыми щипцами и осмотр под микроскопом для рассечения неровными краями. Конические советы и место под УФ-лампой в течение 15 мин. Вытащил пипетки должны быть отмечены в 2 мм от края чаевых.
- Подготовка 0,1% вес / объем быстрой зеленых solutiна путем смешивания стерильной фильтрации 0,9% солевой раствор с сухой быстрой зеленых.
2. Раздел 2. Подготовка животных, стеклянной пипетки Загрузка и плазмиды инъекций
- Удалите 0-1 день после рождения щенка индивидуально из клеток, место на стеклянном блюде Петри предварительно охлажденный до 4 ° C, а затем место на льду.
- Примерно через 5 минут, определить состояние обезболивания, используя ногу ответ крайнем случае. Если не происходит движение, при условии щенков внутрижелудочковой инъекции.
- Важно отметить, что комбинация быстрых зеленых, ДНК и солевой раствор может привести к быстрому испарению, кристаллизация, и блокада стеклянных пипеток. Таким образом, генерировать раствора и 1-2 мкл аликвоты на парафильмом непосредственно перед инъекциями.
- Аспирируйте весь объем аликвоты с вырванными стеклянной пипетки.
- Держите голову из щенка между большим и указательным пальцем менее доминантной рукой.
- Включите лампуD держать голову из щенка только за пределами светового пучка. Если необходимо, положите на голову солевой, чтобы уменьшить количество света, отраженного от щенка. Желудочков теперь должны быть освещены.
- С Вашей доминирующей руки, вставить иглу в боковой желудочек ближайший к вам (рис. 1А и 1В). Месте инъекции должна быть примерно на равном расстоянии от ламбдовидного шва и глаз и 2 мм латеральнее сагиттального шва. Вставьте вытащил пипетки на 2 мм марки для P0 щенка, который должен обеспечить проникновение в боковой желудочек. Кстати, вы можете увидеть засыпке спинномозговой жидкости в пипетку от выпуска внутричерепного давления. Для снижения внутричерепного давления, которое оказывает помощь в инъекции плазмиды, ослабить свою хватку на голову pup.Step 2.8. Inject около 0,5 мкл плазмиды в боковой желудочек использования воздушного давлением инжектор (Picospritzer, Parker).
3. Раздел 3. Electroporation и восстановление
- Seт напряжение генератора для электропорации 5 квадратных импульсов, 50 мс / импульс на 100 вольт, с 950 мс интервалах. Пространственной специфики плазмиды электропорации диктуется направленностью переноса заряда. Пристальное внимание должно быть уделено размещению с учетом неоднородности популяции стволовых клеток вдоль SVZ 8. Различия в темпах распространения и судьбы клеток были определены для вентральной-спинной и хвостовой ростральной-мест 9,10.
- После того, плазмиды вводят, падение пинцет электродов в PBS. Этот шаг заключается в максимизации переноса заряда и предотвратить ожоги, вызванные сопротивлением.
- Поместите положительный электрод на спине боковой стенке щенка возле уха ипсилатерального на сайт плазмиды инъекции (рис. 1С и 1D). Поместите отрицательного электрода на противоположной полушарии вентральной сбоку от щенка мордой.
- Начало текущей передачи, нажав на импульс футовВедьма педаль и подметать электродов от спины к боковым использовании ~ 25 ° угла интервалами.
- Место электропорации щенков на грелку в течение 5 мин. Плавно поворачивайте щенков каждые 30 сек с легкой стимуляции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Новорожденных субвентрикулярной зоне электропорации результатов в маркировке почти все радиальные глии смежных с дорсальной, верхних боковых и боковых субвентрикулярной зоне после «зачистки» движения пинцет электрод (рис. 1E). Тем не менее, электропорации могут быть адаптированы к требованиям соответствующего эксперимента, но не радикальные электродов и использования конкретного расположения и ориентации, как описано в видео. Например, так как сверху локализованные радиальной глии отличаются от тех, подкладка боковой части желудочка, вы можете выбрать только electroporate одного региона 9,10. Далее специфичность также может быть задано с помощью меньших электродов.
Плазмидной ДНК быстро разбавляется в течение первых трех недель 11. Таким образом, выявление genomically измененных клеток с использованием ДНК плазмиды не рекомендуется. Чтобы обойти это ограничение, CRE рекомбиназой выражения плазмиды вступuced вместе с GFP мышам, которые имеют остановки последовательности в окружении жидкий кислород сайты P перед genomically выразил флуоресцентного белка (tdTomato) 12. При рекомбинации, остановка последовательности удаляют и флуоресцентного белка выражена (рис. 1F). По четыре недели после электропорации несколько GFP плазмиды экспрессирующие клетки видны в субвентрикулярной зоне в то время как многие другие tdTomato позитивные клетки видел. После перерезки обонятельных луковиц это также очевидно, что по сравнению с tdTomato экспрессирующих клеток, гораздо меньше GFP выражение клетки присутствуют, однако оба они приобрели черты зрелых клеток гранулы (рис. 1Г).
Рисунок 1. Новорожденных субвентрикулярной Electroporation зоны. (А) СхемаP0-P1 щенка с желудочковой системы и спинного мозга, содержащих спинномозговую жидкость (бирюзовый) подчеркнул вводится с повышенной GFP (EGFP), кодирующей плазмиды (зеленый). (B) корональные разрезе, показывающий ориентации лопастей относительно места инъекции и бокового желудочка. (C) Ориентация отрицательный (-).., и положительный (+) электроды по отношению к оси XYZ на вводили щенка (D) горизонтальный вид щенка следующие электропорации (E) Изображение бокового желудочка 24 часов следующих электропорации EGFP-кодирования вектора (зеленая). (F) Изображение бокового желудочка через 28 дней после электропорации CRE рекомбиназой и EGFP-кодирование плазмид в мышей, несущих стоп-кодона перед tdTomato. Рекомбинация индуцирует экспрессию tdTomato (красный). Последовательные разведения плазмиды результат в немногих оставшихся УЗФБ положительных клеток SVZ в то время как genomically выразил tdTomato постоянно выражена. (G)Разведение плазмидной ДНК (зеленая) очевидна, учитывая, что больше клеток в слое гранул клетки обонятельной луковицы выразить геномных маркеров, tdTomato (красный). LV: боковой желудочек; OB: обонятельной луковицы. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы подробно технику новорожденных электропорации SVZ, технику, быстро и надежно маркировать и манипулировать SVZ стволовых клеток и их потомства. Есть несколько преимуществ, которые электропорации имеет по сравнению с другими методами. Во-первых, учитывая координационного маркировки клеток, человек способен различать клетки автономным и не-клетки автономных эффектов. Во-вторых, генетические манипуляции с использованием индуцибельной системы позволяет сравнить эффекты до или после синаптической интеграции. Кроме того, можно обойти использование нескольких плазмид electroporating CRE выражения мышей с плазмиды, содержащие loxP сайтов. В-четвертых, плазмиды гена-репортера может быть использована для изучения транскрипционной трансактивации. В этом случае транскрипционной активности могут быть измерены только в клетках, которые манипулируют, добавлена специфика может быть введен, когда субрегионов микродиссекции. В-пятых, переходные маркировки клеток транзитных усиливающей связи с продолжающимся распространением и разбавления оF плазмиды могут быть использованы в качестве "birthdating" метод похож на маркировке с аналогами тимидина 11. В-шестых, хотя переходные маркировки клеток может рассматриваться как недостаток, техника должна быть поддаются транспозазы-транспозонов пар, чтобы побудить геномной интеграции 13. Кроме того, текущие нейрогенеза может быть изменен с CRE рекомбиназой, чтобы побудить геномной модификации мышей, содержащих аллелей в окружении сайтов loxP 7,11. Используя этот протокол, новорожденных нейронов были выявлены до четырех месяцев после электропорации в Rosa26R-Stop-tdTomato мышей, у которых остановка кассеты в окружении loxP сайтов 12. Взятые вместе, новорожденных электропорации SVZ является экономически эффективным и время эффективным малоинвазивным инструмент для временной или постоянной генетические манипуляции и маркировки мозга нервных стволовых клеток и новорожденных нейронов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют раскрытия сделать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами от Министерства обороны (награда идея развития, W81XWH-10-1-0041, AB), CT стволовых клеток гранта (AB) и Национального института здоровья АЯРБ 10668225 (DMF). Настоящий материал основан на работе частично поддержана штата Коннектикут под сотовый Коннектикут стволовых Программа исследовательских грантов. Его содержание несут исключительно авторы и не обязательно отражают официальную точку зрения штата Коннектикут, Департамент здравоохранения штата Коннектикут или КТ Innovations, Inc спонсоры не играли никакой роли в разработке дизайна исследования, сбор данных и анализа, решение о публикации или подготовки рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heavy Polished Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | BF150-110-10 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narishige | PC-10H | |
| Fast Green | Fischer Scientific | 0521192205 | |
| ECM 830 Square Wave Pulse generator | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Tweezertrodes | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12-562-36 | |
| Tungsten Halogen lamp | USHIO America, Inc | 1002247 | |
| Picospritzer II | Parker Instruments | 052-0312-900 |
References
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
- Imayoshi, I., Sakamoto, M., Kageyama, R. Genetic methods to identify and manipulate newly born neurons in the adult brain. Frontiers in Neuroscience. 5, 64 (2011).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i120-i125 (2009).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PloS ONE. 3, e1883 (2008).
- Chesler, A. T., et al. Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis. PloS ONE. 3, e1517 (2008).
- Platel, J. C., et al. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
- Alvarez-Buylla, A., Kohwi, M., Nguyen, T. M., Merkle, F. T. The heterogeneity of adult neural stem cells and the emerging complexity of their niche. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 73, 357-365 (2008).
- Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis. Neural Development. 6, 13 (2011).
- de Chevigny, A., et al. miR-7a regulation of Pax6 controls spatial origin of forebrain dopaminergic neurons. Nature Neuroscience. 15, 1120-1126 (2012).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Frontiers in Neuroscience. 4, (2010).
- Feliciano, D. M., Quon, J. L., Su, T., Taylor, M. M., Bordey, A. Postnatal neurogenesis generates heterotopias, olfactory micronodules and cortical infiltration following single-cell Tsc1 deletion. Human Molecular Genetics. 21, 799-810 (2012).
- Iguchi, T., Yagi, H., Wang, C. C., Sato, M. A tightly controlled conditional knockdown system using the Tol2 transposon-mediated technique. PloS ONE. 7, e33380 (2012).
