Summary
ونحن يبرهن على وجود تقنية مينيملي ويشار إلى الولدان الصعق الكهربائي منطقة subventricular. تقنية حقن الحمض النووي يتكون من البلازميد إلى البطينين الوحشي للالجراء حديثي الولادة وتطبيق التيار الكهربائي لتقديم والتلاعب وراثيا الخلايا الجذعية العصبية
Abstract
الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) خط البطينين الوحشي بعد الولادة وتؤدي إلى أنواع خلايا متعددة والتي تشمل الخلايا العصبية، الخلايا النجمية، وخلايا البطانة العصبية 1. فهم المسارات الجزيئية المسؤولة عن التزام مجلس الأمن القومي، التجديد الذاتي، والتمايز هو أمر حاسم لتسخير إمكاناتها الفريدة لإصلاح الدماغ وفهم أفضل اضطرابات الجهاز العصبي المركزي. مطلوب الأساليب السابقة للتلاعب من نظم الثدييات المسعى تستغرق وقتا طويلا ومكلفة للهندسة الوراثية على مستوى الحيوان كله 2. وهكذا، واستكشفت الغالبية العظمى من الدراسات وظائف الجزيئات NSC في المختبر أو في اللافقاريات.
هنا، علينا أن نبرهن على تقنية بسيطة وسريعة لمعالجة المواليد الشخصيات التي يشار اليها على انها حديثي الولادة الصعق الكهربائي subventricular (SVZ) المنطقة. تم تطوير تقنيات مماثلة قبل عقد من الزمن لدراسة NSCs الجنينية ولقد ساعد على دراسات corticaL 3،4 التنمية. وفي الآونة الأخيرة تم تطبيق هذه لدراسة الدماغ الأمامي القوارض بعد الولادة 5-7. هذه التقنية نتائج قوية في وضع العلامات من NSCs SVZ وذريتها. وهكذا، بعد الولادة SVZ الصعق الكهربائي و يوفر التكلفة والوقت البديل الفعال للهندسة الوراثية NSC الثدييات.
Protocol
هذا الإجراء هو وفقا لمتطلبات IACUC ييل. هل يجوز للعلماء التأكد من أن تتم الموافقة على المبادئ التوجيهية IACUC وتابع وفقا لاحتياجاتها المؤسسية.
1. القسم 1. إعداد الماصات DNA، والحلول، والزجاج
- توليد عالية النقاء (OD 260/280> 1.80) التركيز العالي (ميكروغرام / ميكرولتر> 2.5) سم داخلي المنشأ خالية من الحمض النووي.
- إعداد محلول ملحي 0.9٪ وتصفية العقيمة من خلال مرشح ميكرون 22.
- مكان الحريق 10 سم مصقول أنابيب زجاجية البورسليكات الشعرية (OD: 1.5 مم، ID: 1.10 مم) إلى نموذج PP-830 PC-10 Narishige الزجاج ماصة مجتذب مع سلك kanthal. تعيين مجتذب لسحب خطوة واحدة المرجح في 70،5 ° C. نصائح كسر مع ملقط دائرية وتفتيش تحت المجهر تشريح للحواف خشنة. نصائح شطبة ومكان تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة. يجب وضع علامة ماصات سحبت في 2 مم من حافة الحافة.
- إعداد 0.1٪ الوزن / الحجم سريع الخضراء solutiعلى طريق خلط محلول معقم المالحة تصفيتها مع الأخضر 0.9٪ سريع الجفاف.
2. القسم 2. إعداد الحيوان، الزجاج ماصة تحميل وحقن البلازميدات
- إزالة يوم بعد الولادة 0-1 الجراء بشكل فردي من الأقفاص، ومكان على طبق بتري الزجاج قبل المبردة إلى 4 ° C، ثم مكان على الجليد الرطب.
- بعد حوالي 5 دقائق، تحديد حالة التخدير من خلال الاستفادة من استجابة قرصة القدم. إذا لم يحدث حركة، الجراء خاضعة للحقن داخل البطيني.
- من المهم أن نلاحظ أن الجمع بين الأخضر بسرعة، DNA، ومحلول ملحي يمكن أن يؤدي إلى التبخر السريع، تبلور، والحصار المفروض على ماصات زجاجية. لذلك، إنشاء محلول المخزون وقسامة 1-2 ميكرولتر على parafilm مباشرة قبل الحقن.
- نضح وحدة التخزين بالكامل aliquoted مع ماصة الزجاج سحبت.
- عقد رئيس الجرو بين الإبهام والسبابة من يدك المهيمنة أقل.
- تشغيل مصباح علىد عقد رئيس الجرو خارج للتو من شعاع ضوء. إذا لزم الأمر، وطرح المالحة على رأسه لتقليل كمية الضوء المنعكس من الجرو. وينبغي الآن أن تكون مضيئة البطينين.
- مع يدك المهيمنة، أدخل الإبرة في بطين الوحشي الأقرب لك (الشكل 1A و 1B). يجب أن يكون مكان الحقن مسافة واحدة تقريبا من الدرز اللامي والعين و2 مم الوحشي للخياطة السهمي. سحبت إدراج ماصة للعلامة مم 2 لالجرو P0، التي ينبغي ضمان النفاذ إليها من البطين الجانبي. من قبيل الصدفة، قد تشاهد مرة أخرى ملء CSF في ماصة من إطلاق الضغط داخل الجمجمة. لتخفيف الضغط داخل الجمجمة، والذي يساعد في ضخ البلازميد، وتخفيف قبضة الخاص بك على رئيس pup.Step 2.8. حقن حوالي 0.5 ميكرولتر من البلازميد في البطين الجانبي باستخدام محقن الهواء لضغوط (Picospritzer، باركر).
3. الباب 3. الصعق الكهربائي والاسترداد
- SEر الجهد للمولد الصعق الكهربائي لمدة 5 البقول مربع، و 50 مللي ثانية / 100 فولت في نبض، مع فترات ميللي ثانية 950. وأملت خصوصية المكانية للبلازميد الصعق الكهربائي من قبل اتجاهية نقل المسؤول. وينبغي إيلاء اهتمام وثيق لوضع نظرا لعدم تجانس السكان الخلايا الجذعية على طول SVZ 8. وقد تم تحديد الاختلافات في معدلات الانتشار ومصير الخلية للمواقع بطني-الظهرية والذيلية منقاري، 9،10.
- مرة واحدة يتم حقن البلازميد، وتراجع أقطاب منتاش في برنامج تلفزيوني. هذه الخطوة هو تعظيم ونقل المسؤول لمنع الحروق الناجمة عن المقاومة.
- وضع القطب الموجب على جدار الجانبي الظهري للالجرو بالقرب من الأذن المماثل من موقع الحقن بلازميد (الشكل 1C و 1D). وضع قطب كهربائي سلبي على نصف الكرة الجانبية المقابل بطني لخطم الجرو ل.
- بدء النقل الحالي عن طريق الضغط على يمشي على الأقدام نبضساحرة واكتساح دواسة الأقطاب من الظهرية الجانبية لاستخدام ~ 25 درجة زاوية فترات.
- electroporated مكان الجراء على وسادة التدفئة لمدة 5 دقائق. تدوير بلطف الجراء كل ثانية 30 مع تحفيز معتدل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الوليد الصعق الكهربائي منطقة subventricular النتائج في وسم الخلايا الدبقية تقريبا كل شعاعي متجاورة مع، الظهرية الظهرية منطقة subventricular الجانبية، والجانبية بعد حركة "الكاسح" من القطب منتاش (الشكل 1E). ومع ذلك، يمكن أن تكون مصممة الصعق الكهربائي لمتطلبات التجربة ولكن ليس كل تجتاح الكهربائي واستخدام المكان المحدد والتوجه كما هو مفصل في الفيديو. على سبيل المثال، منذ الدبقية شعاعي المترجمة ظهريا تختلف عن تلك البطانة القسم الجانبي من البطين، يمكن للمرء أن اختار electroporate فقط منطقة واحدة 9،10. ويمكن أيضا أن تعطى المزيد من خصوصية باستخدام أصغر الأقطاب الكهربائية.
يتم تخفيف DNA البلازميد بسرعة في غضون الأسابيع الثلاثة الأولى 11. ولذلك، فمن غير المستحسن تحديد الخلايا باستخدام DNA تعديل genomically البلازميد. للتحايل على هذا القيد، وانترود CRE البلازميدات التعبير عن recombinaseuced جنبا إلى جنب مع GFP في الفئران التي لديها تسلسل توقف يحيط بها مواقع P LOX المنبع من البروتين الفلوري أعرب genomically (tdTomato) 12. على إعادة التركيب، يتم إزالة تسلسل توقف ويعبر عن بروتين فلوري (الشكل 1F). قبل أربعة أسابيع وينظر بعد الصعق الكهربائي و GFP البلازميد القليلة الخلايا في المنطقة معربا عن subventricular بينما ينظر العديد من الخلايا أكثر tdTomato إيجابية. على تقطيع البصلة الشمية ومن الواضح أيضا أنه بالمقارنة إلى الخلايا معربا عن tdTomato، والخلايا GFP التعبير عن عدد أقل بكثير موجودة، ومع ذلك اكتسبت ملامح كل من الخلايا الحبيبية الناضجة (الشكل 1G).
الشكل 1. الوليد الصعق الكهربائي Subventricular المنطقة. (A) رسم تخطيطي لأبرز P0-P1 الجرو مع نظام البطين والحبل الشوكي يحتوي على السائل النخاعي (البط البري) مع GFP حقن محسن (EGFP) ترميز البلازميد (الخضراء). (B) قسم الاكليل يظهر اتجاه المجاذيف نسبة إلى موقع الحقن والبطين الجانبي. (C) اتجاه السالب (-). وأقطاب موجبة (+) فيما يتعلق المحور XYZ على عرض (D) حقن أفقي الجرو من الصعق الكهربائي والجرو التالية (E) صورة من الصعق الكهربائي على مدار 24 ساعة البطين الجانبي التالية لناقلات ترميز EGFP (الأخضر). (F) صورة من البطين الجانبي بعد 28 يوما من الصعق الكهربائي و CRE recombinase وEGFP ترميز البلازميدات في الفئران يحمل كودون وقف المنبع من tdTomato. إعادة التركيب يدفع التعبير عن tdTomato (الأحمر). وأعرب عن التخفيفات المتتالية بشكل دائم نتيجة بلازميد في خلايا قليلة EGFP SVZ الإيجابية المتبقية في حين أعرب tdTomato genomically. (G)التخفيف من الحمض النووي البلازميد (الأخضر) هو واضح بالنظر إلى أن أكثر من الخلايا في طبقة الخلايا الحبيبية من البصلة الشمية تعبر عن علامة الجيني، tdTomato (الحمراء). LV: البطين الجانبي؛ OB: البصلة الشمية. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن هنا التفاصيل أسلوب الصعق الكهربائي SVZ حديثي الولادة، وهي تقنية لبسرعة وبقوة تسمية الخلايا الجذعية والتلاعب SVZ وذريتها. هناك العديد من المزايا التي الصعق الكهربائي وبالمقارنة مع غيرها من التقنيات. أولا، نظرا للوضع العلامات التنسيق من الخلايا، واحد قادر على تمييز الخلايا آثار مستقلة وغير مستقلة الخلية. الثانية، والتلاعب الجيني باستخدام نظم محرض يسمح احد لمقارنة آثار قبل أو بعد الاندماج متشابك. وعلاوة على ذلك، يمكن للمرء تجاوز استخدام البلازميدات متعددة من الفئران electroporating CRE معربا عن البلازميدات تحتوي على مع المواقع loxP. الرابع، يمكن استخدام البلازميدات مراسل لدراسة الجينات transactivation النسخي. في هذه الحالة، يمكن قياس النشاط النسخي فقط في الخلايا التي يتم التلاعب بها، ويمكن عرض خصوصية وأضاف عندما يتم microdissected المناطق الفرعية. خامسا، وضع العلامات عابرة من الخلايا تضخيم العبور بسبب استمرار انتشار والتخفيف سو يمكن استخدام البلازميد كطريقة "birthdating" مماثلة لوضع العلامات مع النظير ثيميدين 11. السادسة، على الرغم من يمكن أن ينظر إليه على وضع العلامات عابرة من الخلايا كما وضع غير مؤات، ينبغي أن تكون قابلة للتقنية transposase-ينقول أزواج للحث على الاندماج الجيني 13. بدلا من ذلك، يمكن تغيير تكوين الخلايا العصبية المستمرة مع recombinase CRE للحث على تعديل الجيني من الفئران التي تحتوي على الأليلات يحيط بها المواقع loxP 7،11. باستخدام هذا البروتوكول، تم تحديد الخلايا العصبية الوليد تصل إلى أربعة أشهر بعد الصعق الكهربائي في Rosa26R وقفة وtdTomato الفئران التي يحيط الكاسيت توقف عن طريق المواقع loxP 12. أخذت معا، حديثي الولادة SVZ الصعق الكهربائي هو فعالة من حيث التكلفة والوقت أداة فعالة مينيملي للتلاعب الجيني عابرة أو دائمة ووضع العلامات على الخلايا الجذعية العصبية الدماغ الأمامي والخلايا العصبية الوليد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم لجعل الكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من وزارة الدفاع (فكرة الجائزة التنمية، W81XWH-10-1-0041، AB)، CT الجذعية منحة الخلية (AB)، والمعهد الوطني للصحة NRSA 10668225 (DMF). ويستند المواد موجودة على العمل المدعوم جزئيا من ولاية كونيتيكت تحت الخلايا الجذعية كونيتيكت برنامج المنح البحثية. كان شركة والممولين محتوياته هي الجهة الوحيدة المسؤولة عن أصحابها ولا تعبر بالضرورة عن وجهات النظر الرسمية للدولة من ولاية كونيتيكت، وزارة الصحة العامة في ولاية كونيتيكت أو الابتكارات CT، أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات والتحليل، وقرار نشر أو إعداد المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heavy Polished Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | BF150-110-10 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narishige | PC-10H | |
| Fast Green | Fischer Scientific | 0521192205 | |
| ECM 830 Square Wave Pulse generator | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Tweezertrodes | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12-562-36 | |
| Tungsten Halogen lamp | USHIO America, Inc | 1002247 | |
| Picospritzer II | Parker Instruments | 052-0312-900 |
References
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
- Imayoshi, I., Sakamoto, M., Kageyama, R. Genetic methods to identify and manipulate newly born neurons in the adult brain. Frontiers in Neuroscience. 5, 64 (2011).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i120-i125 (2009).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PloS ONE. 3, e1883 (2008).
- Chesler, A. T., et al. Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis. PloS ONE. 3, e1517 (2008).
- Platel, J. C., et al. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
- Alvarez-Buylla, A., Kohwi, M., Nguyen, T. M., Merkle, F. T. The heterogeneity of adult neural stem cells and the emerging complexity of their niche. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 73, 357-365 (2008).
- Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis. Neural Development. 6, 13 (2011).
- de Chevigny, A., et al. miR-7a regulation of Pax6 controls spatial origin of forebrain dopaminergic neurons. Nature Neuroscience. 15, 1120-1126 (2012).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Frontiers in Neuroscience. 4, (2010).
- Feliciano, D. M., Quon, J. L., Su, T., Taylor, M. M., Bordey, A. Postnatal neurogenesis generates heterotopias, olfactory micronodules and cortical infiltration following single-cell Tsc1 deletion. Human Molecular Genetics. 21, 799-810 (2012).
- Iguchi, T., Yagi, H., Wang, C. C., Sato, M. A tightly controlled conditional knockdown system using the Tol2 transposon-mediated technique. PloS ONE. 7, e33380 (2012).
