Summary
We tonen een minimaal invasieve techniek genoemd neonatale subventriculaire zone elektroporatie. De techniek bestaat uit het injecteren plasmide DNA in de laterale ventrikels van neonatale pups en toepassen elektrische stroom te leveren en genetisch manipuleren neurale stamcellen
Abstract
Neurale stamcellen (NSC's) langs de postnatale laterale ventrikels en leiden tot verschillende celtypen die neuronen, astrocyten en ependymale cellen 1 omvatten. Inzicht in de moleculaire routes die verantwoordelijk zijn voor de NSC zelfvernieuwing, betrokkenheid, en differentiatie is van cruciaal belang voor het benutten van hun unieke potentieel om de hersenen te herstellen en beter te begrijpen het centraal zenuwstelsel. Eerdere methoden voor het manipuleren van zoogdiersystemen vereist de tijdrovende en dure onderneming van genetische manipulatie in het gehele dier level 2. Zo hebben de meeste studies onderzocht de functies van NSC moleculen in vitro of in ongewervelden.
Hier tonen we de eenvoudige en snelle techniek om neonatale NPCs die wordt aangeduid als neonatale subventriculaire zone (SVZ) elektroporatie manipuleren. Vergelijkbare technieken werden tien jaar geleden ontwikkeld om embryonale NSCs studeren en hebben geholpen studies over cortical ontwikkeling 3,4. Meer recent werd dit toegepast op de studie van de postnatale knaagdier voorhersenen 5-7. Deze techniek resulteert in robuuste etikettering van SVZ NSCs en hun nageslacht. Zo postnatale SVZ elektroporatie zorgt voor een kosten-en tijdbesparende alternatief voor zoogdieren NSC genetische manipulatie.
Protocol
Deze procedure is in overeenstemming met Yale IACUC eisen. Wetenschappers moeten ervoor zorgen dat IACUC richtlijnen worden goedgekeurd en gevolgd op basis van hun institutionele eisen.
1. Afdeling 1. Bereiding van DNA, oplossingen en glazen pipetten
- Genereer hoge zuiverheid (OD 260/280> 1,80) hoge concentratie (ug / ul> 2.5) endotoxine-vrij DNA.
- Bereid 0,9% zoutoplossing en steriel gefiltreerd door een 22 pm filter.
- Plaats 10 cm brand gepolijst borosilicaatglas capillaire buizen (OD: 1,5 mm, ID: 1,10 mm) in een model PP-830 Narishige PC-10 glazen pipet trekker met een Kanthal draad. Stel trekker om een een stap gewogen pull bij 70,5 ° C. Break tips met ronde tang en inspecteren onder een dissectie microscoop voor gekartelde randen. Bevel tips en plaats onder een UV-lamp gedurende 15 minuten. Getrokken pipetten worden gemarkeerd op 2 mm van de rand van de tip.
- Bereid 0,1% gewicht / volume snel groen Solutidoor mengen steriel gefiltreerd 0,9% zoutoplossing met droog snel groen.
2. Sectie 2. Animal Voorbereiding, glazen pipet met laden en Plasmide Injectie
- Verwijder postnatale dag 0-1 pups individueel uit kooien, plaats op een glazen petrischaal voorgekoeld tot 4 ° C, en daarna op nat ijs.
- Na ongeveer 5 min, is de stand van verdoving door gebruikmaking van de voet pinch reactie. Als er geen beweging optreedt, onder voorbehoud van pups tot intraventriculaire injectie.
- Het is belangrijk op te merken dat de combinatie van fast green, DNA en zoutoplossing kan resulteren in een snelle verdamping, kristallisatie en blokkade van glazen pipetten. Daarom het genereren van een stockoplossing aanwezig zijn en aliquot 1 tot 2 pl op parafilm onmiddellijk voorafgaand aan injecties.
- Zuig het hele hoeveelheden verdeeld volume met de getrokken glazen pipet.
- Houd de kop van de pup tussen uw duim en wijsvinger van uw minder dominante hand.
- Zet lamp eend Houd het hoofd van pup net buiten lichtbundel. Indien nodig zoutoplossing op het hoofd van de hoeveelheid licht die gereflecteerd door pup verminderen. De ventrikels nu branden.
- Met je dominante hand, steek de naald in laterale ventrikel het dichtst bij u (Figuur 1A en 1B). De plaats van injectie ongeveer gelijke afstand van de lambdoïde hechtdraad en oog en 2 mm lateraal van de pijlnaad. Plaats getrokken pipet om de 2 mm voor een merk P0 pup die moet doordringen in het laterale ventrikel. Toevallig, ziet u wellicht terug vullen van CSF in de pipet uit de release van intracraniale druk. Om intracraniale druk, die helpt bij injectie van plasmide te verminderen, maak je grip op het hoofd van de pup.Step 2.8. Injecteer ongeveer 0,5 ul van plasmide in laterale ventrikel met behulp van een lucht-druk injector (Picospritzer, Parker).
3. Sectie 3. Elektroporatie en Herstel
- Set de spanning van de generator voor elektroporatie 5 vierkante pulsen, 50 msec / puls bij 100 volt met 950 msec intervallen. De ruimtelijke specificiteit van elektroporatie plasmide wordt bepaald door de richtingsgevoeligheid van ladingsoverdracht. Bijzondere aandacht moet worden besteed aan de plaatsing vanwege de heterogeniteit van stamcelpopulaties langs de SVZ 8. Verschillen in de tarieven van de proliferatie en lot van de cel zijn geïdentificeerd voor ventrale-dorsale en rostrale-caudale locaties 9,10.
- Zodra het plasmide wordt geïnjecteerd, duik pincet elektroden in PBS. Deze stap is om overdracht van lading te maximaliseren en brandwonden veroorzaakt door weerstand te voorkomen.
- Plaats de positieve elektrode op de dorsale laterale wand van de pup bij het oor ipsilaterale de site van plasmide injectie (figuur 1C en 1D). Plaats de negatieve elektrode op de contralaterale hemisfeer ventrale lateraal van de pup snuit.
- Start stroomoverdracht door te drukken op de pols footsheks pedaal en de elektroden vegen van dorsale laterale met ~ 25 ° hoek intervallen.
- Plaats geëlektroporeerd pups op een verwarming pad gedurende 5 minuten. Voorzichtig rondgedraaid pups elke 30 seconden met een milde stimulatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Neonatale subventriculaire zone elektroporatie resulteert in de etikettering van bijna alle radiale glia grenst aan de dorsale, laterale dorsale en laterale subventriculaire zone na de "vegen" beweging van de pincet elektrode (figuur 1E). Echter, elektroporatie worden afgestemd op de eisen van de respectieve experiment maar niet vegen de elektrode en met specifieke plaatsing en richting zoals beschreven in de video. Bijvoorbeeld, omdat dorsaal gelokaliseerde radiale glia afwijken van de bekleding van de laterale deel van het ventrikel, kan men kiezen om slechts electroporate een regio 9,10. Verdere specificiteit kan ook worden gegeven met behulp van kleinere elektroden.
Plasmide DNA wordt snel verdund in de eerste drie weken 11. Daarom is het identificeren genomisch gemodificeerde cellen met plasmide DNA niet aanbevolen. Om deze beperking te omzeilen, worden CRE recombinase uiten plasmiden introdhanteerden met GFP in muizen waarin een stop sequentie geflankeerd door loxP plaatsen stroomopwaarts van een genomisch expressie fluorescent protein (tdTomato) 12 hebben. Na recombinatie wordt de stopsequentie verwijderd en het fluorescerende eiwit tot expressie wordt gebracht (Figuur 1F). Met vier weken na de elektroporatie paar GFP plasmide dat cellen worden waargenomen in de subventriculaire zone terwijl veel meer tdTomato er positieve cellen worden gezien. Bij het snijden van de bulbus olfactorius is ook duidelijk dat in vergelijking met tdTomato exprimerende cellen, GFP expressie veel minder cellen aanwezig zijn, maar beide zijn verworven kenmerken van rijpe granule cellen (figuur 1G).
Figuur 1. Neonatale subventriculaire zone Elektroporatie. (A) Schematische weergave van eenP0-P1 pup met ventriculaire systeem en het ruggenmerg met cerebrospinale vloeistof (teal) gemarkeerd geïnjecteerd met versterkte GFP (eGFP) coderen plasmide (Groen). (B) Kroon sectie toont oriëntatie van peddels ten opzichte van de plaats van injectie en laterale ventrikel. (C) oriëntatie van negatief (-).. positieve (+) elektroden ten opzichte XYZ as op geïnjecteerd pup (D) Horizontale weergave van een pup volgende elektroporatie (E) Afbeelding van het laterale ventrikel 24 uur Na elektroporatie van een eGFP vector coderende (Green). (F) Afbeelding van het laterale ventrikel 28 dagen na elektroporatie van CRE recombinase-en eGFP coderende plasmiden in muizen die een stopcodon stroomopwaarts van tdTomato. Recombinatie induceert expressie van tdTomato (rood). Opeenvolgende verdunningen van plasmide resultaat in een paar overgebleven eGFP positieve SVZ cellen, terwijl genomically uitgedrukt tdTomato wordt permanent uitgedrukt. (G)Verdunning van plasmide DNA (groen) blijkt omdat meer cellen in de korrel cellaag van de bulbus olfactorius de genomische marker, tdTomato (rood) te drukken. LV: laterale ventrikel; OB: bulbus olfactorius. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier detail de techniek van neonatale SVZ elektroporatie, een techniek om snel en krachtig labelen en manipuleren SVZ stamcellen en hun nakomelingen. Er zijn verschillende voordelen die elektroporatie heeft in vergelijking met andere technieken. Eerste, gezien de focale kenmerken van cellen, een cel kan zelfstandige en niet-cell autonome effecten onderscheiden. Tweede genetische manipulatie met behulp van induceerbare systemen kan een vergelijking effecten vóór of na synaptische integratie. Verder kan een bypass het gebruik van meerdere plasmiden door elektroporeren CRE expressie muizen met plasmiden die loxP sites. Ten vierde kan gen reporter plasmiden gebruikt worden om transcriptionele transactivatie bestuderen. In dit geval kan transcriptionele activiteit alleen worden gemeten in cellen die gemanipuleerd toegevoegd specificiteit kunnen worden ingevoerd wanneer deelgebieden worden gemicrodissecteerde. Ten vijfde, de tijdelijke etikettering van doorvoer versterken cellen als gevolg van voortdurende proliferatie en verdunning of het plasmide kan worden gebruikt als "birthdating" werkwijze vergelijkbaar met labeling met thymidine analogen 11. Zesde, hoewel de tijdelijke kenmerken van cellen kan worden gezien als een nadeel moet de techniek vatbaar transposase-transposon paren genomische integratie 13 induceren. Als alternatief kan lopende neurogenesis worden gewijzigd met CRE recombinase tot genomische modificatie van muizen die allelen geflankeerd door loxP plaatsen 7,11 induceren. Met dit protocol werden pasgeboren neuronen geïdentificeerd tot vier maanden na elektroporatie in Rosa26R-Stop-tdTomato muizen waarin de stop cassette wordt geflankeerd door loxP plaatsen 12. Bij elkaar genomen, neonatale SVZ elektroporatie is een kosteneffectieve en tijd efficiënt minimaal invasieve hulpmiddel voor de tijdelijke of permanente genetische manipulatie en de etikettering van voorhersenen neurale stamcellen en pasgeboren neuronen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen mededelingen te doen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Ministerie van Defensie (Idee ontwikkeling award, W81XWH-10-1-0041, AB), CT stamcellen subsidie (AB) en een National Institute of Health NRSA 10668225 (DMF). De huidige materiaal is gebaseerd op het werk mede ondersteund door de staat Connecticut in de Connecticut Stem Cell Research Grants Program. De inhoud ervan is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigen niet noodzakelijk de officiële standpunten van de staat Connecticut, het ministerie van Volksgezondheid van de staat Connecticut of CT Innovations, Inc De financiers hadden geen rol in de opzet van het onderzoek, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit tot publicatie, of de bereiding van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heavy Polished Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | BF150-110-10 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narishige | PC-10H | |
| Fast Green | Fischer Scientific | 0521192205 | |
| ECM 830 Square Wave Pulse generator | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Tweezertrodes | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12-562-36 | |
| Tungsten Halogen lamp | USHIO America, Inc | 1002247 | |
| Picospritzer II | Parker Instruments | 052-0312-900 |
References
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
- Imayoshi, I., Sakamoto, M., Kageyama, R. Genetic methods to identify and manipulate newly born neurons in the adult brain. Frontiers in Neuroscience. 5, 64 (2011).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i120-i125 (2009).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PloS ONE. 3, e1883 (2008).
- Chesler, A. T., et al. Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis. PloS ONE. 3, e1517 (2008).
- Platel, J. C., et al. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
- Alvarez-Buylla, A., Kohwi, M., Nguyen, T. M., Merkle, F. T. The heterogeneity of adult neural stem cells and the emerging complexity of their niche. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 73, 357-365 (2008).
- Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis. Neural Development. 6, 13 (2011).
- de Chevigny, A., et al. miR-7a regulation of Pax6 controls spatial origin of forebrain dopaminergic neurons. Nature Neuroscience. 15, 1120-1126 (2012).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Frontiers in Neuroscience. 4, (2010).
- Feliciano, D. M., Quon, J. L., Su, T., Taylor, M. M., Bordey, A. Postnatal neurogenesis generates heterotopias, olfactory micronodules and cortical infiltration following single-cell Tsc1 deletion. Human Molecular Genetics. 21, 799-810 (2012).
- Iguchi, T., Yagi, H., Wang, C. C., Sato, M. A tightly controlled conditional knockdown system using the Tol2 transposon-mediated technique. PloS ONE. 7, e33380 (2012).
