Summary
Se demuestra una técnica mínimamente invasiva conocida como electroporación neonatal zona subventricular. La técnica consiste en la inyección de ADN de plásmido en los ventrículos laterales de cachorros neonatales y la aplicación de corriente eléctrica para suministrar y manipular genéticamente las células madre neuronales
Abstract
Las células madre neurales (NSC) de la línea de los ventrículos laterales postnatales y dan lugar a múltiples tipos de células que incluyen neuronas, astrocitos y células ependimarias 1. La comprensión de los mecanismos moleculares responsables de la NSC auto-renovación, el compromiso y la diferenciación es fundamental para el aprovechamiento de su potencial único para reparar el cerebro y entender mejor los trastornos del sistema nervioso central. Los métodos anteriores para la manipulación de los sistemas de mamíferos requiere el esfuerzo largo y costoso de la ingeniería genética a nivel animal entero 2. Por lo tanto, la gran mayoría de los estudios han examinado las funciones de las moléculas NSC in vitro o en los invertebrados.
Aquí se demuestra la técnica simple y rápida para manipular NPCs neonatales que se conoce como zona neonatal subventricular (SVZ) electroporación. Técnicas similares se han desarrollado hace una década para estudiar NSCs embrionarias y han ayudado a los estudios sobre Cortical desarrollo 3,4. Más recientemente, este fue utilizado para estudiar el cerebro anterior roedor postnatal 5-7. Esta técnica da como resultado el etiquetado robusto de SVZ NSCs y su progenie. Por lo tanto, postnatal SVZ electroporación ofrece una alternativa costo y tiempo efectivo de mamíferos ingeniería genética NSC.
Protocol
Este procedimiento es conforme con los requisitos de Yale IACUC. Los científicos deberían asegurarse de que las directrices sean aprobadas IACUC y siguió de acuerdo a sus necesidades institucionales.
1. Sección 1. Preparación de ADN Pipettes, soluciones y Vidrio
- Generar alta pureza (OD 260/280> 1,80) alta concentración (mg / l> 2,5) libre de endotoxinas ADN.
- Preparar 0,9% de solución salina y el filtro estéril a través de un filtro de 22 micras.
- Colocar 10 cm fuego pulido tubos capilares de vidrio de borosilicato (OD: 1,5 mm, ID: 1,10 mm) en un modelo PP-830 Narishige PC-10 extractor de pipeta de vidrio con un alambre de Kanthal. Conjunto extractor para una tracción paso ponderado en 70.5 ° C. Rompa las puntas con unas pinzas circulares e inspeccionar bajo un microscopio de disección para los bordes dentados. Puntas cónicas y se coloca bajo una lámpara UV durante 15 min. Pipetas Pulled deben ser marcadas en 2 mm del borde de la punta.
- Preparar 0,1% peso / volumen verde rápido solutipor mezcla filtrada estéril solución salina al 0,9% con el verde de secado rápido.
2. Sección 2. Preparación de los animales, pipeta de vidrio de carga y de inyección de plásmido
- Retire el día postnatal 0-1 crías en jaulas individuales, en lugar de un plato de Petri de vidrio previamente enfriado a 4 ° C, y luego colocar en hielo húmedo.
- Después de aproximadamente 5 min, determinar el estado de anestesia mediante la utilización de la respuesta pellizco pie. Si no hay movimiento, las crías sometidas a la inyección intraventricular.
- Es importante señalar que la combinación de verde rápido, ADN, y la solución salina puede dar como resultado la rápida evaporación, cristalización, y el bloqueo de pipetas de vidrio. Por lo tanto, generar una solución madre y parte alícuota de 1-2 l sobre Parafilm inmediatamente antes de las inyecciones.
- Aspirar todo el volumen alícuota con la pipeta de vidrio tirado.
- Sostenga la cabeza del cachorro entre el pulgar y el dedo índice de su mano menos dominante.
- Encienda una lámparad sostenga la cabeza del cachorro a las afueras del haz de luz. Si es necesario, poner en solución salina cabeza para reducir la cantidad de luz reflejada por las crías. Los ventrículos ahora debe estar iluminado.
- Con la mano dominante, inserte la aguja en el ventrículo lateral más cercano a usted (Figura 1A y 1B). El sitio de inyección debe ser de aproximadamente equidistante de esta sutura y el ojo y 2 mm lateral a la sutura sagital. Insertar sacó la pipeta hasta la marca de 2 mm para un cachorro P0, que debería asegurar la penetración en el ventrículo lateral. Coincidentemente, es posible que vea el relleno de líquido cefalorraquídeo en la pipeta de la liberación de la presión intracraneal. Para reducir la presión intracraneal, lo que ayuda a la inyección de plásmido, aflojar su control sobre la cabeza de la pup.Step 2,8. Inyectar aproximadamente 0,5 l de plásmido en el ventrículo lateral utilizando un inyector de aire a presión (Picospritzer, Parker).
3. Sección 3. La electroporación y la recuperación
- Set la tensión del generador de electroporación para 5 impulsos cuadrados, 50 mseg / pulso a 100 voltios, con intervalos de 950 mseg. La especificidad espacial de la electroporación del plásmido está dictada por la direccionalidad de transferencia de carga. Debe prestarse atención dada a la colocación dada la heterogeneidad de las poblaciones de células madre a lo largo de la SVZ 8. Las diferencias en las tasas de proliferación y el destino celular se han identificado lugares ventral-dorsal y caudal rostral-9,10.
- Una vez que el plásmido se inyecta, introducir los electrodos de pinza en PBS. Este paso es maximizar la transferencia de carga y para evitar quemaduras causadas por la resistividad.
- Coloque el electrodo positivo en la pared lateral dorsal del cachorro cerca de la oreja ipsilateral al sitio de la inyección de plásmido (Figura 1C y 1D). Coloque el electrodo negativo en el hemisferio contralateral lateral ventral al cachorro hocico.
- Iniciar la transferencia actual presionando los foots pulsobruja pedal y barrer los electrodos de dorsal a lateral utilizando ~ 25 ° intervalos angulares.
- Lugar a electroporación cachorros en una almohadilla de calentamiento durante 5 min. Gire suavemente crías cada 30 segundos con una estimulación suave.
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Representative Results
Neonatales subventricular resultados zona de electroporación en el etiquetado de casi toda la glía radial contigua a la zona dorsal, lateral dorsal subventricular, y lateral siguiendo el "barrido" de movimiento del electrodo de pinza (Figura 1E). Sin embargo, la electroporación se pueden adaptar a los requisitos del experimento respectivo pero no barriendo el electrodo y el uso de la colocación y orientación específicos tal como se detalla en el vídeo. Por ejemplo, desde la glía radial dorsalmente localizada difieren de las que recubren la sección lateral del ventrículo, se puede optar por electroporación sólo una única región 9,10. Especificidad adicional también se puede administrar utilizando pequeños electrodos.
El ADN del plásmido se diluye rápidamente dentro de las primeras tres semanas 11. Por lo tanto, la identificación de células genómicamente modificados, utilizando ADN de plásmido no se recomienda. Para eludir esta limitación, plásmidos recombinasa CRE se expresan introduced junto con GFP en ratones que tienen una secuencia de parada flanqueado por lox P sitios aguas arriba de una proteína expresada genómicamente fluorescente (tdTomato) 12. Tras la recombinación, la secuencia de parada se retiró y la proteína fluorescente se expresa (Figura 1F). A las cuatro semanas después de la electroporación pocas células que expresan GFP plásmido se ven en la zona subventricular mientras que muchas más células tdTomato positivos se ven. Al seccionar el bulbo olfativo también es evidente que en comparación con las células que expresan tdTomato, muchas menos células que expresan GFP están presentes, sin embargo, ambos han adquirido las características de las células granulares maduros (Figura 1G).
Figura 1. Electroporación neonatal zona subventricular. (A) Diagrama esquemático de unP0-P1 cachorro con el sistema ventricular y la médula espinal que contiene líquido cefalorraquídeo (TEAL) destacó inyectados con mayor GFP (eGFP) que codifica plásmido (Green). (B) Sección coronal que muestra la orientación de las paletas en relación con el sitio de inyección y el ventrículo lateral. (C) Orientación de negativos (-).. electrodos y positivo (+) con respecto al eje XYZ en inyectó cachorro (D) Vista horizontal de un cachorro Después de la electroporación (E) la imagen de la electroporación hr ventrículo lateral 24 siguiente de un vector de codificación de eGFP (verde). (F) de imagen del ventrículo lateral 28 días después de la electroporación de la recombinasa Cre-y codificación de eGFP-plásmidos en ratones portadores de un codón de parada aguas arriba de tdTomato. Recombinación induce la expresión de tdTomato (rojo). Diluciones sucesivas de resultado plásmido en pocas células eGFP restantes SVZ positiva, mientras que genómicamente expresado tdTomato se expresó permanentemente. (G)La dilución del ADN plásmido (verde) es aparente dado que más células en la capa de células granulares del bulbo olfatorio expresan el marcador genómico, tdTomato (rojo). LV: ventrículo lateral; OB: bulbo olfativo. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
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Discussion
Aquí detalle la técnica de electroporación SVZ neonatal, una técnica para etiquetar rápidamente y con firmeza y manipular células SVZ madre y su progenie. Hay varias ventajas que la electroporación tiene en comparación con otras técnicas. En primer lugar, dado el etiquetado focal de células, uno es capaz de discernir celulares autónomos efectos autónomos y no por células. Segunda manipulación, genética utilizando sistemas inducibles permite comparar los efectos antes o después de la integración sináptica. Además, se puede omitir el uso de múltiples plásmidos por electroporación de ratones que expresan CRE con plásmidos que contienen sitios loxP. En cuarto lugar, los plásmidos de gen reportero puede ser usado para estudiar la transactivación transcripcional. En este caso, la actividad transcripcional se puede medir sólo en las células que son manipuladas; especificidad añadido puede ser introducido cuando subregiones se microdissected. En quinto lugar, el etiquetado transitoria de células de amplificación de tránsito debido a la continua proliferación y o diluciónf el plásmido se puede utilizar como "birthdating" método similar al marcaje con timidina análogos 11. En sexto lugar, aunque el etiquetado transitoria de células podría ser visto como una desventaja, la técnica debe ser susceptible de pares transposón-transposasa para inducir la integración genómica 13. Alternativamente, la neurogénesis en curso puede ser alterado con CRE recombinasa para inducir la modificación genómica de ratones que contienen alelos flanqueado por sitios loxP 7,11. El uso de este protocolo, las neuronas recién nacidas fueron identificados hasta cuatro meses después de la electroporación en Rosa26R-Stop-tdTomato ratones en los que se flanqueaban el casete parada por sitios loxP 12. En conjunto, neonatal electroporación SVZ es un costo efectivo y eficiente del tiempo herramienta mínimamente invasiva para la manipulación genética transitoria o permanente y el etiquetado de las células madre neurales del cerebro anterior y las neuronas recién nacidas.
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Disclosures
Los autores no tienen conflicto de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Departamento de Defensa (Premio Idea desarrollo, W81XWH-10-1-0041, AB), CT con células madre subvención (AB), y el Instituto Nacional de Salud NRSA 10668225 (DMF). El presente material está basado en trabajo apoyado en parte por el Estado de Connecticut bajo el Stem Cell Research Connecticut Programa de Subvenciones. Su contenido es de exclusiva responsabilidad de sus autores y no representan necesariamente la opinión oficial del Estado de Connecticut, el Departamento de Salud Pública del Estado de Connecticut o innovaciones CT, Inc. Los financiadores no participó en el diseño del estudio, recogida de datos y el análisis, la decisión de publicar, o la preparación del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heavy Polished Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | BF150-110-10 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narishige | PC-10H | |
| Fast Green | Fischer Scientific | 0521192205 | |
| ECM 830 Square Wave Pulse generator | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Tweezertrodes | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12-562-36 | |
| Tungsten Halogen lamp | USHIO America, Inc | 1002247 | |
| Picospritzer II | Parker Instruments | 052-0312-900 |
References
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